专利名称：南方水稻黑条矮缩病毒的rt-pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及一种南方水稻病毒的检测方法，尤其涉及一种南方水稻黑条矮縮病毒 (southern rice black streaked dwarfvirus， SRBSDV)的RT-PCR(反转录聚合酶链式反 应)检测方法。
背景技术：
普通水稻黑条矮縮病毒病是一种在江浙一带严重发生的病毒病，每年造成严重损 失。2008年浙江省农科院和华南农业大学分别报告一种新的病毒病发生在广东和海南两 省，华南农业大学暂定名此病毒为南方水稻黑条矮縮病毒(southern rice blackstreaked dwarf virus, SRBSDV)，而浙江农科院将其称为水稻黑条矮縮病毒2号(rice black streaked dwarf virus 2， RBSDV2)。湖南省2009年大面积发生类似于这两种病毒病的矮 縮病，据初步统计发病面积在100万亩以上，但究竟是何种病毒引起抑或2种病毒混合引 起，还需进行全面检验。 关于SRBSDV的检测技术，华南农业大学周国辉等根据此病毒第十片段RNA的核苷 酸序列设计两对引物进行巢式RT-PCR检测，这种方法需要做2次PCR，既费时又耗材。
因此有必要建立一种简单且准确的检测SRBSDV (或RBSDV2)的技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种南方水稻黑 条矮縮病毒(southern rice black streakeddwarf virus, SRBSDV)的RT-PCR检测方法， 可准确将SRBSDV与普通的水稻黑条矮縮病毒(rice black streaked dwarf virus,RBSDV) 区分开来。 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是一种南方水稻黑条矮縮病 毒的RT-PCR检测方法，其特点是该检测方法是以南方水稻黑条矮縮病毒特异性引物对待 测样品进行RT-PCR扩增，最后电泳鉴定；该特异性引物为
正向引物5' -TTAAGTTTATTCGCAACTTCGAAG-3'
反向引物5' -CGCTTTAGATGCTGACAAATCAC-3'。 与现有技术相比，本发明的优点是该方法所使用的特异性引物是对南方水稻黑 条矮縮病毒第十段RNA特异的，且该对引物只做一次RT-PCR就可准确将SRBSDV与RBSDV 区分开，足以准确检测出SRBSDV，无需做巢式RT-PCR，如此，不仅可节省约2h的时间，还可 节约一次PCR的试剂用量。
图1是PCR产物序列经MEGA4. 0软件建立的系统进化树图。
图2是用本发明的特异性引物做一次RT-PCR的结果。 图中，从左至右的电泳带依次为Marker、阴性对照(健康稻苗)、浙江普黑、常德南黑1、常德南黑2、汉寿南黑1、汉寿南黑2、桃源南黑、Marker。 注文中的普黑指普通水稻黑条矮縮病毒，南黑指南方水稻黑条矮縮病毒。
具体实施例方式
—、引物的设计利用病毒核苷酸序列进化的保守性，从NCBI/GenBank搜索并下载SRBSDV和 RBSDV2第十段RNA及相近病毒第十段RNA的核苷酸序列，运用MEGA4. 0软件对这些序列进 行比对，从扩展名为mas的文件中找出SRBSDV与RBSDV2的核苷酸序列所共有而其它病毒 序列均与之不同的引物候选区，设计出的一对引物为
正向引物5' -TTAAGTTTATTCGCAACTTCGAAG-3' 反向引物5' -CGCTTTAGATGCTGACAAATCAC-3'(反向引物使用时需颠倒互补)。
上述引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，预期的PCR产物为477个碱基。
二、病毒的一次RT-PCR过程 病毒RNA的提取按双链RNA提取法(为现有技术)。RT-PCR扩增按宝生物工程(大连)有限公司PrimeScript 0neSt印RT-PCR Kit
Ver. 2说明书进行。 RT-PCR反应体系如下 PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 li 1 2X1 St印Buffer 25 ii 1 正向引物(20iiM) liil 反向引物(20iiM) liil 模板RNA 3 ii 1 RNase Free dH20 加至50 ii 1 反应温度及时间如下
1.反转录(RT) :50。C 30min
2.变性94°C 2min 3.循环94。C 30sec，60。C 30sec，72。C lmin，共30循环。
三、PCR扩增产物的鉴定 取PCR扩增产物5 ii 1，点样于1. 2%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)，以DL2， 000 DNA Marker Marker作为标准分子参照，以120V的电压于0. 5XTAE电泳缓冲液中电泳40min， 用凝胶成像系统检查，结果出现的条带与预期的大小相符。
四、PCR扩增产物序列的鉴定 将正向引物和反向引物分别经BLAST检索，见下表1和下表2。结果表明，该对特 异性引物的序列能100%覆盖100%相同的全部是SRBSDV或RBSDV2核苷酸序列。
表l南黑正向引物的BLAST结果
核苷酸序列
Southern rice black-streaked dwarf virus isolate UCH23-24 maior o Southern rice black-streaked dwarf virus isolate UCH19-20 maior o Rice black-streaked dwarf vims 2 seament S10, comDlete sequence Southern rice black-streaked dwarf vims isolate Hainan se。ment S] Southern rice black-streaked dwarf virus isolate UCH17-18 major o Monosiaa brevicollis clone 〕GIAC丫I-8;IJ17, complete se叫ence Trichomonas vaqinalis G3 conserved hypothetical protein (TVAG 12 Caenorhabditis briqqsae Hypothetical protein C已G12752 (C已G1275: 已acillus cereus G9842, complete qenorme Bacillus cereus complete qenorne
PREDICTED: Tribolium castaneum similar to AGAP006127-PA (LOCf
Clostridium phytofermentans ISDq, complete qenome
Giardia lamblia ATCC 50803 Kinase, SC丫l (GL50803 8805) mRNA, 表2南黑反向引物的BLAST结果
核苷酸序列
Rice black-streaked dwarf virus 2 se。ment S10, complete sequence Southern rice black-streaked dwarf vims isolate Hainan se。nnent: S] Gsllus ciallus clone WAG-93J15t complete sequence E。uid herpesvirus 9 DNA, complete qenome, strain: P19 Drosophils melanoqaster chromosome 3R' complete sequence Mus musculus chromosome 1, done comolete sequen
Equine herpesvirus 1 strain complete Qenome
E叫ine herpesvirus 1 strain Ab4, cornolete qenome Mus musculfjs BAC clone RP24-211F3化om chrorrios師e 18, com。le Mouse DMA sequence from clone RP23-146J6 on chromosome 17, c Lotus iaiDonicus aenomic DNA, chromosome 5, clone: UT08O18, TM Drosoohila mdanoaaster, chromosome 3R, re。ion 69A-89A,巳AC cl Droso口hila melanoaaster, chromosome 3P., reaion 89A1-89A5,已AC
覆盖率相同率
100%100%
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78% ;10。％
91%〗100% 将PCR产物直接送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，序列用DNAsis软件 比对结果与南方黑条矮縮病毒(SRBSDV或RBSDV 2)第10段序列中要扩增的序列基本一 致。 序列经MEGA4. 0软件建立系统进化树，结果4条序列(见图1中的Dingcheng、 Taoyuan、Hanshou、Yueyang)均与南方黑条矮縮病毒(见图1中的EU523360和EU764840)
聚在一簇。 由此证明了利用该对特异性引物，采用RT-PCR反应系统，能扩增出该特异性序 列，PCR产物大小与预期的一致，DNA序列测定结果与得到特异性引物的引物候选区的序列一致。
实施例1 : 用这对特异性引物对来自浙江的RBSDV病株和来自湖南5地的SRBSDV病株做一 次RT-PCR，见图2，结果只有湖南5地的SRBSDV病株为阳性，扩增出预期的477个碱基的条 带，来自浙江的RBSDV病株和水稻健苗对照均为阴性。说明了本发明的该对特异性引物对 南方水稻黑条矮縮病毒是特异的，通过对RBSDV与SRBSDV病毒作一次RT-PCR，就足以准确 地检测出SRBSDV，能将RBSDV与SRBSDV两种病毒准确地区分开来，无需做巢式RT-PCR。
权利要求
一种南方水稻黑条矮缩病毒的RT-P CR检测方法，其特征在于该检测方法是以南方水稻黑条矮缩病毒特异性引物对待测样品进行RT-PCR扩增，最后电泳鉴定；该特异性引物为正向引物5’-TTAAGTTTATTCGCAACTTCGAAG-3’反向引物5’-CGCTTTAGATGCTGACAAATCAC-3’。
2. 如权利要求1所述的南方水稻黑条矮縮病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于所述 特异性引物的设计是基于南方水稻黑条矮縮病毒第十段RNA的核苷酸序列，RT-PCR产物大 小为477bp。
全文摘要
一种南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)的RT-PCR检测方法，该检测方法是以南方水稻黑条矮缩病毒特异性引物对待测样品进行RT-PCR扩增，最后电泳鉴定；该特异性引物是利用病毒核苷酸序列进化的保守性，从NCBI/GenBank搜索并下载SRBSDV第十段RNA及相近病毒第十段RNA的核苷酸序列，运用MEGA4.0软件对这些序列进行比对，从扩展名为mas的文件中找出不同研究者报告的SRBSDV核苷酸序列所共有而其它病毒序列均与之不同的一对引物。经BLAST结果表明，与引物100％覆盖且100％相同的全部是SRBSDV核苷酸序列。使用此引物对可将SRBSDV病株与普通的水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)病株准确区分开来，无需做巢式RT-PCR。
文档编号C12Q1/70GK101713001SQ20091025919
公开日2010年5月26日 申请日期2009年12月9日 优先权日2009年12月9日
发明者高必达 申请人:湖南农业大学