专利名称：一种发酵木糖生产乙醇的重组酵母的构建方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组酵母的构建方法。
背景技术：
随着经济增长所引起的对能源的巨大需求和化石等常规燃料的日益枯竭，加快了 人们寻找开发新能源的步伐。乙醇作为一种可再生的清洁能源被认为是最具潜力和发展前 景的能源之一。传统的以粮食为原料发酵生产乙醇的方法，成本高，污染重，产率低，造成了 资源的严重浪费，受到了一定的限制。 以各类农林废弃物为代表的植物纤维素等是地球上最丰富的生物质资源。纤维 素、半纤维素是植物纤维的主要成分，质量分数可达50% 70%，是重要的可再生资源，其 中半纤维素的主要水解产物是木糖，若以其为原料生产燃料乙醇，不仅可以解决当前以粮 食等为原料生产燃料乙醇的诸多问题，而且还可以促进农村的经济发展和减少因焚烧产生 的环境污染等问题。 自然界中发酵木糖的酵母菌有树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、休哈塔假 丝酵母(Candida shehatae)、嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus)以及黏红酵母 (Rhodotorula glutinis)等，但它们对乙醇的耐受能力较差，发酵液中乙醇浓度低，不适合 乙醇的工业化生产。酿酒酵母是乙醇发酵的优良菌株，但它缺乏木糖代谢途径，不能代谢木 糖产乙醇。 利用基因工程技术构建重组细菌或酵母发酵木糖生产乙醇，现已有报道，但构建 的重组菌株具有以下缺点1.在构建过程中所涉及的步骤多，且方法繁琐；2.重组微生物 所获得的与木糖代谢有关的代谢途径不稳定。 微生物原生质体融合技术又称细胞融合技术，是微生物育种中一种重要的方法， 它是指通过酶法去除两种不同亲株的细胞壁后，得到原生质体，再置于高渗溶液中，在一定 融合剂的促融或电击融合等的作用下使两者相互凝集并发生细胞之间的融合，进而导致基 因或染色体重组，获得新菌株的育种方法。原生质体融合方法主要有硝酸钠、高钙高pH、 PEG法、电击法等。然而，到目前为止还没有关于采用原生质体融合法构建发酵木糖产乙醇 的重组酵母的报道。
发明内容
本发明针对上述不足提供一种构建发酵木糖生产乙醇的重组酵母的方法，以及该 方法构建得到的重组酵母及应用。 本发明发酵木糖生产乙醇的重组酵母的构建方法，是采用原生质体融合法将能够 代谢木糖的酵母与酿酒酵母融合，筛选出能够代谢木糖且乙醇产率较高的重组酵母。
所述能够代谢木糖的酵母包括但不限于黏红酵母(Rhodotorulaglutinis)、圆 红冬孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)，乳酒假丝酵母(Candida kefyr)，扣囊复膜 孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)。优选为黍占红酵母(Rhodotorula glutinis)。
具体而言，本发明方法可包括如下步骤
1)酿酒酵母URA3营养缺陷型突变株的获得 通过亚硝基胍(NTG)化学诱变，在制霉菌素及含有5-F0A(5-氟乳清酸)、尿苷及尿 嘧啶的YNB(不含氨基酸的氮源)固体培养基上筛选酿酒酵母URA3缺陷型突变株；
2)通过高渗溶液以及蜗牛酶分别处理酿酒酵母及黏红酵母细胞，经离心去酶，重 悬于稳渗剂中制备原生质体； 3)通过PEG融合方法制备融合细胞，并在营养缺陷型的培养基上筛选能够生长的 菌株； 4)将筛选到的融合细胞在仅以2%木糖为唯一碳源的YP(Y :yeast extract P : p印tone)平板培养基上再次筛选，同时逐步提高培养基中木糖的浓度，不断进行传代培养 及发酵优化，剔除、筛选出相对生产乙醇较高的重组酵母。 上述步骤中为了筛选采用了酿酒酵母URA3营养缺陷型，然而本领域技术人员还 可以按照此类方法使用诸如各种氨基酸营养缺陷型、各种核酸营养缺陷型以及各种维生素 营养缺陷型等等，利用相应的培养平板进行筛选。 利用通过上述方法构建得到的重组酵母，进行葡萄糖、木糖共发酵按2%的量接 种重组酵母，在28 30°C， pH5. 0 6. 5条件下发酵，组分为5%木糖+2%蛋白胨+1 %酵 母膏+10%葡萄糖，并分别测定发酵液中葡萄糖和木糖的消耗量及乙醇的产量。结果，融合 细胞能够在上述条件下发酵木糖产乙醇。 本发明运用原生质体融合技术能克服基因工程技术缺点的优点，构建了代谢木糖 并发酵生产乙醇的新菌株。本发明与其他育种技术相比，具有遗传物质更为完整、杂交频率 较高、受接合型或致育型的限制较小，并且存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合细 胞，提高菌株产量和品质等优点。同时原生质体融合技术还可以扩大基因交流和重组的范 围，为酵母发酵木糖产乙醇的重组研究和遗传改良提供了新的途径。 本发明采用简便经济的PEG融合法进行细胞融合，具有操作简单，技术要求不高， 时间短等特点；营养缺陷型融合保证了所筛选的细胞均是重组酵母，避免了亲本的干扰； 以木糖为唯一碳源的筛选法使获得的融合细胞均为能够代谢木糖的重组酵母，方法简单可 靠；细胞融合率高且融合细胞能够代谢木糖并产乙醇。
图1显示的是制备的原生质体； 图2显示的是筛选的融合细胞，方框内为对照； 图3显示的是融合细胞共发酵葡萄糖及木糖生产乙醇。
具体实施例方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明中涉及到的百分号"％"，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指在2(TC时 容量的比例。 本发明涉及的发酵木糖产乙醇的菌株来源于黏红酵母，但也包括含有能发酵木糖 的其它微生物，如圆红冬孢酵母菌(Rhodosporidiumtoruloides)，乳酒假丝酵母(Candida kefyr)，扣囊复膜孢酵母(Saccharomycopsis fibuligera)等。
实施例1 :酿酒酵母URA3缺陷型突变株的获得 1.菌种活化将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CICC 1292购于中国工业 微生物菌种管理保藏中心)接种于YPD(Y :yeastextract， P :p印tone， D :glucose)斜面培 养基上，28 3(TC恒温培养2d，重复1 2次。将活化形成的单菌落酿酒酵母用灭菌牙签 挑取适量接种于液体YPD培养基中，28 30°C 220rpm摇床震荡培养14 16h，培养菌体的 0D6。。至1. 0 1. 5的对数生长期时，取此时培养的酵母用作突变。 2.菌种突变及筛选取一定量的上述酵母4500rpm 5min离心收集菌体，ddH20洗 涤2次后将菌体悬浮于10mL的柠檬酸缓冲液中。加入化学诱变剂亚硝基胍(NTG)至终浓 度为120 ii g/mL。室温振荡培养lh后4500rpm， 5min离心收集菌体，ddH20洗涤2次，将菌 体转入100mL YNB培养基中3(TC培养3h，此时加入制霉菌素至终浓度为25 y /mL， 28。C培 养3h， 4500rpm， 5min离心收集菌体，ddH20洗涤2次后悬浮于lmL ddH20中，最后稀释悬浮 液涂布于含有5-F0A (5-氟乳清酸)、尿苷及尿嘧啶的YNB固体培养基上筛选URA3缺陷型突 变株。经筛选得到13株URA3缺陷型突变株。
实施例2 :酵母原生质体的制备
1.菌种活化同时实施例1 2制备分别活化URA3缺陷型酿酒酵母和黏红酵母(Rhodotorulaglutinis CGMCC 2. 704购于中国普通微生物菌种保藏管理中心)菌种，并转接到50mL的YPD培养基上，在温 度为3(TC，转速为200rpm的条件下培养10 12h后收集菌体，稀释细胞数为1. 0X10 2. 0 X 10个/mL，离心收集菌体(4500rpm， 5min)，用ddH20洗2次后加入预处理剂(100mL磷 酸缓冲液中加0. lg EDTA和0. lmL P -巯基乙醇)，在30。C下保温20 25min，离心去除 预处理剂，用高渗缓冲液洗涤(100mL磷酸缓冲液中加17g蔗糖)l次后，加入蜗牛酶液(用 PBS配制，0. 22 ii m无菌过滤器过滤)，3(TC下轻轻振荡培养，定时取样显微检验，待90 %左 右的细胞变为原生质体后停止酶解，离心去酶(4000rpm， 10min)用渗透压稳定剂洗2次，重 悬于稳渗剂中备用。制备的原生质体如图1所示。
实施例3 :酵母原生质体的融合及鉴定
本发明采用了 PEG融合的方法制备原生质体。 1. PEG融合取两种制备好的原生质体按等比例混合(各取lmL)，离心，用0. 5M CaCl2洗涤，加入2mL 35% PEG(丽=6000)_CaCl2 (10mM) ， 30。C震荡融合30min。用高渗缓 冲液洗2次，稀释涂布于不含尿嘧啶及尿苷的再生培养基上，3(TC培养2 3d，筛选融合细 胞。 2.融合细胞的鉴定酿酒酵母URA3缺陷型细胞在缺乏尿嘧啶及尿苷的培养基上 不能生长，通过原生质体融合互补可以恢复为原养型，因此能够在缺乏尿嘧啶及尿苷的培 养基上生长的细胞均为融合细胞。为进一步确认，本发明对融合细胞的细胞体积和DNA的 含量进行了测定，结果融合细胞的体积和DNA含量约为2亲株之和，因此，从体积和倍性上可以说明融合细胞确为双亲株融合的结果(图2)。
实施例4 :发酵木糖融合细胞的筛选 酿酒酵母URA3缺陷型和黏红酵母融合后，将筛选到的融合细胞用无菌牙签转到
2%木糖的YP平板上再次筛选菌落比较大的重组酵母菌株，同时不断提高YP培养基中木
糖的浓度，经过多次传代培养，挑选出生长较好的菌株至浓度为5X木糖的YP平板上，培养
2 3(1后，挑取最大的菌落发酵，发酵液组分为5%木糖+2%蛋白胨+1%酵母膏+10%葡萄
糖，利用液相色谱检测发酵液中的乙醇含量，以筛选出产乙醇能力较高的菌株。 实施例5 :重组酵母(融合细胞)的葡萄糖、木糖共发酵 1.融合细胞的活化，同实施例1。 2.葡萄糖、木糖共发酵按2%的量接种活化的融合细胞进行发酵，发酵温度为 28 3(TC，pH为5. 0 6. 5，发酵组分为5%木糖+2%蛋白胨+1%酵母膏+10%葡萄糖，并 分别测定发酵液中葡萄糖和木糖的消耗量及乙醇的产量。结果如图3所示，重组酵母能够 在上述条件下发酵木糖产乙醇。 3.挑选3株URA3缺陷型突变株，分别按照上述方法进行细胞融合和和筛选，经发 酵验证均能得到发酵木糖产乙醇的重组酵母。
权利要求
一种发酵木糖生产乙醇的重组酵母的构建方法，其特征在于，采用原生质体融合法将能够代谢木糖的酵母与酿酒酵母融合，筛选出能够代谢木糖且乙醇产率较高的重组酵母。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述能够代谢木糖的酵母为黏红酵母 (Rhodotorula glutinis)、圆红冬孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)，乳酒假丝酵母 (Candida kefyr)，扣囊复膜抱酵母(Saccharomycopsis fibuligera)。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述能够代谢木糖的酵母为黏红酵母 (Rhodotorula glutinis)。
4. 如权利要求1 3任一项所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤1) 酿酒酵母URA3营养缺陷型突变株的获得通过亚硝基胍化学诱变，在制霉菌素及含有5-F0A、尿苷及尿嘧啶的YNB固体培养基上 筛选酿酒酵母URA3缺陷型突变株；2) 通过高渗溶液以及蜗牛酶分别处理酿酒酵母及黏红酵母细胞，经离心去酶，重悬于 稳渗剂中制备原生质体；3) 通过PEG融合方法制备融合细胞，并在营养缺陷型的培养基上筛选能够生长的菌株；4) 将筛选到的融合细胞在仅以2%木糖为唯一碳源的YP平板培养基上再次筛选，同时 逐步提高培养基中木糖的浓度，不断进行传代培养及发酵优化，剔除、筛选出相对生产乙醇 较高的重组酵母。
5. 权利要求1 4任一项所述方法筛选得到的重组酵母。
6. 权利要求5所述重组酵母在发酵木糖生产乙醇中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种发酵木糖生产乙醇的重组酵母的构建方法。本发明通过一种简单的原生质体融合技术将能够代谢木糖的酵母和酿酒酵母融合到一起，通过筛选获得能够代谢木糖，又相对产乙醇较好的新菌株。本发明方法简单可靠，细胞融合率高且融合细胞能够有效地代谢木糖并产乙醇。本发明为酵母发酵木糖产乙醇的重组研究和遗传改良提供了新的途径。
文档编号C12R1/72GK101792753SQ20091025921
公开日2010年8月4日 申请日期2009年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者尚海涛, 徐斌, 李荣杰, 段绪果, 胡长浩, 薛亮, 薛培俭 申请人:安徽丰原发酵技术工程研究有限公司