专利名称：UsiRNA复合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及双链RNA复合物，该双链RNA复合物的过客链中具有一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体。本发明的RNA复合物可用于治疗用途、诊断用途或科研用途。该复合物包括能够下调基因表达的短干扰RNA复合物(siRNA双链体)，该短干扰RNA复合物包含反义链和连续或不连续的过客链(“有义链”)。这些链中的至少一条具有一个或更多个本发明的羟甲基取代的核苷酸单体，所述羟甲基取代的核苷酸单体可位于3’端、5’端、3’ 端和5’端二者和/或位于内部。序列表本申请包括经EFS-Web随此提交的序列表，该序列表是于2009年11月27日生成的ASCII文件，名称为08-19PCT. txt，大小为98，574个字节，其完整内容由此通过引用并入本文。
背景技术：
RNA干扰(RNAi)提供了一种使靶基因表达沉默的方法。它为基础研究提供了用于研究遗传和生物化学途径和个体基因以及基因产物功能的方法。因此，RNAi已成为制药业中靶验证的关键工具并且已经进行了大量投资，其目的在于基于能够介导针对其异常表达与疾病状态或状况有关的基因进行RNA干扰的RNA复合物，进行药物开发。然而，RNA复合物作为RNAi治疗剂发挥作用的能力受到诸如序列特异性或“脱靶” 效应、效力、核酶稳定性以及非特异性细胞因子诱导之类的问题的限制。本发明提供了用于改进RNA复合物的RNAi活性同时减弱或消除RNAi中与RNA复合物相关的不利问题的化合物、组合物、方法以及用途。其中，本申请提供了新型化合物和组合物，其用于制备和使用具有改进的效力和核酶稳定性并且具有减弱或消除的“脱靶”效应和/或细胞因子诱导的RNA复合物。
发明内容
本发明提供了 RNA复合物，所述RNA复合物具有并入RNA链中的一个或更多个羟甲基取代的单体以用于RNA指导的基因调节或基因分析，特别是RNA干扰。因此，本发明的一个目的是提供与通常使用的RNA复合物相比具有减弱的脱靶效应的RNA复合物。另一目的是提供具有减弱的干扰素反应的RNA复合物。又一目的是提供在针对在细胞培养中或体内的酶解稳定性方面具有改进的特性的RNA复合物。还一目的是提供在细胞培养中或体内相对于未修饰的RNA复合物表现出提高的基因调节功能(例如，基因沉默效应)的RNA复合物。还一目的是提供靶向特定器官或组织和能够穿透细胞膜的RNA复合物。本发明还提供了适于将羟甲基取代的单体并入寡核苷酸的单体及其合成方法。一方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸包含有义链和反义链以及具有15至M 个碱基对的双链区，其中所述有义链5’端的最后三个位置中的任一个或更多个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据。
另一方面，所述核酸还包括有义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。又一方面，所述核酸还包括反义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。另一方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸包含有义链和反义链以及具有15至 24个碱基对的双链区，反义链5、6、7以及8位中的一个或更多个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据，其中反义链的位置从反义链5’端的1位开始计数。另一方面，所述核酸还包括有义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。又一方面，所述核酸还包括反义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。另一方面，所述核酸具有19或20个碱基对的双链区。另一方面，所述有义链和所述反义链各自的长度为21或22个核苷酸单体。另一方面，所述核酸具有平端或3’端悬端。另一方面，所述反义链具有含至少15个连续核苷酸单体的区域，所述15个连续核苷酸单体与SEQ ID NO :12、34、56、78、100、1M或147的任何15个连续的核苷酸单体相对应。在一个相关的方面，所述反义链具有含至少15、16、17、18、19、20、21、22、23或对个连续核苷酸单体的区域所述15、16、17、18、19、20、21、22、23或对个连续核苷酸单体与SEQ ID NO :12、34、56、78、100、124 或 147 的任何 15、16、17、18、19、20、21、22、23 或 24 个连续的核苷酸单体相对应。一方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸包含有义链和反义链以及具有25至40 个碱基对的双链区，其中所述反义链3’端的最后一个位置和所述有义链3’端的最后一个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据。另一方面，所述反义链3’端的最后两个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据。一方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸包含有义链和反义链以及具有25至40 个碱基对的双链区，其中所述有义链的21、22以及23位中的一个或更多个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据，其中所述有义链的位置从所述有义链5’端的1位开始计数。一方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸包含有义链和反义链以及具有25至40 个碱基对的双链区，其中所述反义链的18、19、20、21以及22位中的一个或更多个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据，其中所述有义链的位置从所述反义链3’端的1 位开始计数。另一方面，所述核酸还包括所述反义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。另一方面，所述核酸还包括所述有义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。另一方面，所述反义链具有含至少15个连续核苷酸单体的区域，所述15个连续核苷酸单体与SEQ ID NO :169、185、201、217或233的任何15个连续的核苷酸单体相对应。
在一个相关的方面，所述反义链具有含至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40 个连续核苷酸单体的区域，所述 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40 个连续核苷酸单体与 SEQ ID NO :169、185、201、217 或 233 的任何 15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40 个连续的核苷酸单体相对应。
另一方面，所述羟甲基取代的核苷酸单体为2’ -3’ -开环-核苷酸单体。 另一方面，所述羟甲基取代的核苷酸单体选自下述单体D、F、G、H、I或J
权利要求
1.一种核酸，所述核酸包含有义链和反义链以及具有15至M个碱基对的双链区，其中所述有义链5’端的最后三个位置中的任一个或更多个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据。
2.根据权利要求1所述的核酸，其中所述核酸还包括所述有义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。
3.根据权利要求1所述的核酸，其中所述核酸还包括所述反义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。
4.一种核酸，所述核酸包含有义链和反义链以及具有15至M个碱基对的双链区，其中所述反义链5、6、7以及8位中的一个或更多个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据，其中所述反义链的位置从所述反义链5’端的1位开始计数。
5.根据权利要求4所述的核酸，其中所述核酸还包括所述有义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。
6.根据权利要求4所述的核酸，其中所述核酸还包括所述反义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。
7.根据权利要求1-6任何一项所述的核酸，其中所述双链区具有19或20个碱基对。
8.根据权利要求1-6任何一项所述的核酸，其中所述有义链和所述反义链各自的长度为21或22个核苷酸单体。
9.根据权利要求1-6任何一项所述的核酸，其中所述核酸具有平端或3’端悬端。
10.根据权利要求1-6任何一项所述的核酸，其中所述反义链具有含至少15个连续核苷酸单体的区域，所述15个连续核苷酸单体与SEQ ID N0:12、34、56、78、100、1M或147的任何15个连续的核苷酸单体相对应。
11.一种核酸，所述核酸包含有义链和反义链以及具有25至40个碱基对的双链区，其中所述反义链3’端的最后一个位置和所述有义链3’端的最后一个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据。
12.根据权利要求11所述的核酸，其中所述反义链3’端的最后两个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据。
13.一种核酸，所述核酸包含有义链和反义链以及具有25至40个碱基对的双链区，其中所述有义链的21、22以及23位中的一个或更多个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据，其中所述有义链的位置从所述有义链5’端的1位开始计数。
14.一种核酸，所述核酸包含有义链和反义链以及具有25至40个碱基对的双链区，其中所述反义链的18、19、20、21以及22位中的一个或更多个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据，其中所述有义链的位置从所述反义链3’端的1位开始计数。
15.根据权利要求13或14所述的核酸，所述核酸还包括所述反义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。
16.根据权利要求13或14所述的核酸，所述核酸还包括所述有义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。
17.根据权利要求11、13或14所述的核酸，其中所述反义链具有含至少15个连续核苷酸单体的区域，所述15个连续核苷酸单体与SEQ ID NO :169、185、201、217或233的任何 15个连续的核苷酸单体相对应。
18.根据权利要求1-6和11-14任一项所述的核酸，其中所述羟甲基取代的核苷酸单体为2’ -3’ -开环-核苷酸单体。
19.根据权利要求1-6和10-13任一项所述的核酸，其中所述羟甲基取代的核苷酸单体选自下述单体D、F、G、H、I或J :
20.根据权利要求1-6和10-13任一项所述的核酸，所述核酸还包括选自下述的核苷酸类似物:2' -O-烷基-RNA单体、2 ‘-氨基-DNA单体、2 ‘-氟-DNA单体、LNA单体、PNA 单体、HNA单体、ANA单体、FANA单体、CeNA单体、ENA单体、DNA单体以及INA单体。
21.一种降低细胞中基因表达的方法，所述方法包括制备权利要求1-6和10-13任一项所述的核酸并使用所述核酸处理细胞。
22.—种治疗人类疾病的方法，所述疾病选自炎症性疾病，包括类风湿性关节炎；代谢性疾病，包括高胆固醇血症；肝脏疾病；脑炎；骨折；心脏病；病毒性疾病，包括肝炎和流感； 以及癌症；所述方法包括制备权利要求1-6和10-13任一项所述的核酸并将所述核酸施用于所述人类。
23.权利要求1-6和10-13任一项所述的核酸在制备用于治疗疾病的药物中的用途， 所述疾病包括炎症性疾病，包括类风湿性关节炎；代谢性疾病，包括高胆固醇血症；肝脏疾病；脑炎；骨折；心脏病；病毒性疾病，包括肝炎和流感；以及癌症。
全文摘要
本发明提供了双链RNA复合物，该双链RNA复合物的过客链(或有义链)中具有一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体。本发明的RNA复合物可用于治疗用途、诊断用途或科研用途。RNA复合物包括能够调节基因表达的短干扰RNA复合物(siRNA)，该短干扰RNA复合物包含反义链和连续或不连续的过客链(“有义链”)。另外，本发明的一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体可位于3’端、5’端、3’端和5’端二者。
文档编号C12N15/113GK102239259SQ200980148743
公开日2011年11月9日 申请日期2009年12月3日 优先权日2008年12月3日
发明者巴里·A·波利斯基, 纳仁德拉·K·韦什, 迈克尔·E·休斯顿, 迈克尔·V·滕普林 申请人:玛瑞纳生物技术有限公司