专利名称：一种检测人6种免疫相关基因的标签单核苷酸多态性位点方法
技术领域：
本发明涉及一种检测人6种免疫相关基因的标签单核苷酸多态性位点方法， 这些基因是人补体受体1型(CR1)、达菲抗原/趋化因子受体(DARC)、白细胞分化抗原 59 (⑶59)、白细胞分化抗原4 (⑶4)、白细胞分化抗原8A (⑶8A)和白细胞分化抗原8B (⑶8B) 等6个基因，属于医学分子生物学领域。
背景技术：
研究表明，红细胞具有免疫黏附、直接杀灭抗原异物、调节补体活性、增强NK细胞 功能、结合趋化因子、参与B细胞免疫调节等多种免疫功能，在天然免疫和获得性免疫中发 挥重要作用。在红细胞表面或胞浆内存在多种免疫相关物质，其中以补体受体1型的免疫 黏附功能和达菲抗原/趋化因子受体的趋化因子受体功能最受关注，白细胞分化抗原59则 具有限制人补体系统溶细胞活性、介导红细胞-T细胞信号传递的作用。T细胞则是实现获 得性免疫功能的主要细胞，其表面的白细胞分化抗原4和白细胞分化抗原8分别与主要组 织相容性复合体II类和I类抗原结合，可增强T细胞与抗原递呈细胞或靶细胞结合的程 度，在T细胞增殖和分化的信号转导中起重要作用，白细胞分化抗原4阳性的T细胞和白细 胞分化抗原8阳性的T细胞分别具有免疫辅助和免疫抑制及直接杀伤功能。上述免疫分子 的水平在多种疾病发生了改变，与疾病发生、发展和预后密切有关，但目前对这些分子的基 因与疾病遗传易感性的关联研究未见报道。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)是指染色体上单个核 苷酸变异而引起的DNA序列多态性，它具有密度高、遗传稳定、易于自动化分析等特点，被 认为是继限制性片段长度多态性、微卫星多态性之后的第三代遗传标记，可用于基因定位、 多态性分析等方面，是研究疾病遗传易感性、疾病诊断、药物筛选等的常用指标。目前已发 展了 20余种单核苷酸多态性检测方法，如DNA测序、限制性片段长度多态性分析、等位基因 特异的寡核苷酸杂交等，但这些方法不适合大规模、自动化检测；后来发展的DNA芯片技术 满足了高通量、自动化检测的需要，以DNA芯片为检测平台，结合上述反应原理，发展了多 种单核苷酸多态性检测方法，但一般的单核苷酸多态性芯片存在假阳性率高、通量不灵活 等缺点 ° Hirschhorn 等(Hirschhorn JN, et al. SBE-TAGS :an array-based method for eff icientsingle-nucleotide polymorphism genotyping. Proc Natl Acad Sci USA, 2000,97(22) 12164-12169)在单碱基延伸反应单核苷酸多态性芯片的基础上，建立了基 于单碱基延伸反应_标签微阵列杂交相结合的DNA芯片技术，巧妙地将等位基因特异性引 物序列和能与芯片上序列特异结合的标签序列集成于单碱基延伸引物上，将单碱基延伸反 应的高敏感度和高分辨率与标签微阵列的多重反应等优点融合在一起，克服了其他DNA芯 片技术的缺点，达到了高通量、高精确度、高通用性、简便、经济的效果。单碱基延伸法(single base primer extension)又称微测序法、模 板介导染料终止剂掺入分析或单核苷酸多态性鉴定技术(single-nucleotidepolymorphism-identification technology, SNP-IT)，是在双脱氧测序法的基础上发展出 来的单核苷酸多态性检测方法。其原理是首先设计1对PCR引物用于从基因组DNA中扩 增出含有目的单核苷酸多态性位点的片段，再设计1条与待测单核苷酸多态性位点上游序 列互补的延伸引物，该引物的3'端最后一个碱基与单核苷酸多态性位点上游相邻的1个 碱基互补；将延伸引物与PCR产物混合，掺入标记不同荧光染料的ddNTPs进行延伸反应，由 于ddNTP的特性，当延伸1个碱基，即加入的ddNTP与单核苷酸多态性位点碱基互补时，反 应即终止；通过检测延伸碱基所发出的荧光类型来判断单核苷酸多态性位点的碱基类型。 该方法基于测序原理，但由于只需测1个碱基，其准确性大大超过了一般测序反应，堪称单 核苷酸多态性检测的黄金标准。标签微阵列是在玻璃芯片板的板底预先合成寡核苷酸单链(标签)，与这些标签 互补的带有荧光标记的寡核苷酸链能通过杂交结合上去，然后扫描检测其荧光标记。引入 芯片技术有助于实现高通量、自动化检测，而采用标签微阵列使多重检测成为可能，可以利 用固定在芯片上的标签容易地将多种寡核苷酸链准确地区分开来。2005年，美国贝克曼公司基于这一原理开发了 GenomeLab SNPstream 12-重 /48-重基因分型系统，该系统采用的微阵列芯片是特殊的384孔板，孔底是平底的玻璃芯 片，从广泛应用于DNA芯片的几千条寡核苷酸链中选取了几十条交叉杂交率最低、与数据 库中各种基因组同源性极小、并能提供很强信号的标签，预先合成到微阵列芯片板上。384 孔板的每个孔板底有16个或者52个“点”，包括12个或48个序列不同的标签和4个质控， 分别可供最多12重或48重延伸反应。利用在线引物设计工具Autoprimer设计扩增含候 选单核苷酸多态性位点目的片段的多重PCR引物和相应的多重延伸引物，在每条延伸引物 的5'端加有与芯片上标签序列互补的序列，用于延伸产物与标签微阵列的结合，结果可由 成像仪上的双色荧光读出。其分型成功率达到96. 5 %，准确率达到99 %，只需要2ng的DNA 就足够进行12重及48重的检测，通量灵活，操作简便，自动化程度高。本发明建立并优化了多重PCR-荧光标记单碱基延伸_标签微阵列杂交基因分型 技术检测人补体受体1型等6个基因标签单核苷酸多态性位点的方法，以便对其在健康人 的遗传特点及与疾病易感性的关联进行研究。
发明内容
本发明的目的是建立采用多重PCR-荧光标记单碱基延伸_标签微阵列杂交基因 分型技术结合GenomeLab SNPstream 基因分型系统同时检测人补体受体1型(CR1)、达菲 抗原/趋化因子受体(DARC)、白细胞分化抗原59(CD59)、白细胞分化抗原4(CD4)、白细胞 分化抗原8A(CD8A)和白细胞分化抗原8B(CD8B)等6个基因标签单核苷酸多态性位点的方法。本发明所述方法包括以下步骤1.候选基因标签单核苷酸多态性位点的筛选利用HapMap网站的Tagger程序挑选各基因的标签单核苷酸多态性位点 (http://www. hapmap. org/cgi-perl/gbrowse/hapmap_B36/)① @ 人基因名；②设置 条件Population (人群)CHB (中国汉族)；Pairwise Methods (配对方法)Tagger pairwise (Tagger 配对标志法)；RSquare cut off (复相关系数临界值)0. 8 ;MAF cut
4off (最小等位基因频率临界值):0. 05 ；③执行搜索，即可显示该基因标签单核苷酸多态性 位点及与其密切关联的单核苷酸多态性位点的登录号。Pubmed 网立占(http //www. ncbi. nlm. nih. gov/pubmed/) g才戈示亥 苷酸多态性位点的信息。根据各单核苷酸多态性位点等位基因的类型，确定拟采用的延伸 试剂的类型，并据此调整不符合设计要求的单核苷酸多态性位点，主要包括单核苷酸多态 性位点前后含大量重复序列、相邻单核苷酸多态性位点在染色体上位置太近、等位基因类 型不在延伸试剂检测范围内。最终确定检测的27个标签单核苷酸多态性位点见表1。表1 27个标签单核苷酸多态性位点信息 2.单核苷酸多态性位点扩增引物及延伸引物设计与合成利用贝克曼公司编写的AP Editor软件编辑模板序列在指定页面输入选定标签 单核苷酸多态性位点的登录号，设置建立通用类模板(即所有单核苷酸多态性位点的等位 基因类型以T/A代替)，执行操作，即可自动搜索含该位点的序列信息；同时软件自动将重 复序列用字母“N”屏蔽；导出的序列文件为.txt格式。禾丨J用贝克曼公司在线工具Autoprimer (http //www. autopr imer. com/)设计单 核苷酸多态性位点扩增引物及延伸引物，选择设计引物为48-重，导入AP Editor软件导 出的序列文件，执行设计步骤，即可得到各单核苷酸多态性位点的1对PCR引物及1条延 伸引物，延伸引物的5'端包含有与微阵列芯片杂交板上固定序列互补的碱基序列。采 M BLAST(http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)及 UCSC In-Silico PCR 工具 (http://genome, ucsc. edu/cgi-bin/hgPcr ？ command = start) X^ti^if W PCR 弓L的牛寺胃 性进行评价。设计好的引物委托上海生工生物工程有限公司合成，采用聚丙烯酰胺凝胶电 泳法纯化。表2设计的27个单核苷酸多态性位点扩增引物及延伸引物 3.基因组DNA样本的制备(1)人全血基因组DNA提取采集受试者清晨空腹静脉血2mL，入乙二胺四乙酸二钾抗凝管，混勻。采用 Promega公司Wizard 基因组DNA纯化试剂盒(货号A1125)提取人外周血基因组DNA，按 说明书操作，具体步骤如下①吸取900PL细胞裂解液加至1.5mL环氧树脂管中，轻摇血标 本管充分混勻，取全血300 u L加至含有细胞裂解液的环氧树脂管中，颠倒混和5 6次；② 室温孵育lOmin，其间颠倒2 3次使红细胞裂解，13000 16000r/min离心40秒，尽可能 移弃上清，留下白色沉淀物及约10yL残留液；剧烈震荡环氧树脂管约10 15秒，使白细 胞重悬；③加入300 iiL细胞核裂解液至上述重悬细胞中，抽吸溶液5 6次使白细胞溶解； ④加入1. 5 ii LRNA酶，颠倒混和2 5次，37°C孵育15min，冷却至室温；⑤加入100 y L蛋白 沉淀液，剧烈震荡10 20秒，静置lOmin，其间剧烈震荡2 3次，使蛋白充分沉淀；⑥置室 温中13000 16000r/min离心5min，可见褐色蛋白沉淀，将上清移至事先加好400 u L异丙 醇的1. 5ml环氧树脂管中；⑦轻轻颠倒混和溶液直至白色丝状DNA成团状；⑧室温13000 16000r/min离心lmin后轻轻倒出上清，加入500 y L 70%乙醇，轻轻颠倒几次以洗涤DNA 及环氧树脂管管壁，13000 16000r/min离心lmin ；⑨轻轻倒出上清，环氧树脂管倒置于吸 水纸上，室温风干10 15min ；⑩加100 u L DNA水化液4°C过夜后，将DNA溶液置超低温冰 箱保存。(2) DNA纯度及浓度测定①将DU800紫外/可见光分光光度计调至DNA测试状态，仪器稳定15min ；②先用 空气调零，然后吸取100 yL灭菌双蒸馏水至微量比色杯中，作为空白对照，再次调零；③在 0. 5mL环氧树脂管中加入96 ii L灭菌双蒸馏水，吸取DNA溶液4 y L加入其中，混勻后加至微 量比色杯，上机测试，记录260nm吸光度/280nm吸光度比值以及浓度值。4.单重PCR验证单核苷酸多态性位点扩增引物质量(1)按下列反应体系分别配制各单重PCR混合物，加入96孔板中。引物对(每种引物浓度为10 u mol/L)0. 5 u LdNTPs (每种成分浓度为 2. 5mmol/L)2. 0 u L10XPCR 缓冲液 II2. 5 ii LMgCl2 (25mmol/L)5. 0 u LAmplitaq Gold DNA 聚合酶(5 单位 / ii L)0. 2 u L基因组DNA0. 5u L双蒸馏水14. 3 ii L_
合计25. 0 ii L(2)用封板膜密封96孔板，lOOOr/min离心10秒。(3)在基因扩增仪上运行如下程序保持(HOLD) :94°C lmin — 40个循环94°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C lmin — HOLD -A°C lOmin。(4) 1.8%琼脂糖凝胶电泳称取0.9g琼脂糖加入锥形瓶，量取50mL lXTris 碱-乙酸-乙二胺四乙酸缓冲液，摇勻，放入微波炉中加热至琼脂糖完全溶解；取出后冷却 至约70°C，加入2 y L浓度为10 y g/ y L的溴化乙锭溶液，混勻，将琼脂糖缓缓倒入制胶模 具中，插入梳子，待胶凝固；在对应孔中加入样本和DL2000 DNA分子标准，将胶置于加有 lXTris碱-乙酸-乙二胺四乙酸缓冲液的电泳槽中，以80伏电压进行电泳；电泳结束后， 采用SX-300凝胶图像分析系统扫描凝胶，根据DNA分子标准判断扩增产物中是否含有与目 标片段大小一致的片段。5.单核苷酸多态性位点的检测(1)基因组DNA样品的稀释根据测定的DNA浓度，在96孔板中加入适量灭菌双蒸馏水，将待测DNA样品全部 稀释到10ng/ii L。(2)引物稀释①PCR引物稀释(共27X2个)将合成好的引物稀释到240 u mol/L ；从54管稀释好的PCR引物中各取5 y L加入 到一个新的环氧树脂管中，并补加210 y L灭菌双蒸馏水，作为新的多重PCR引物池；PCR引 物池中共有480 u L试剂，各引物终浓度为2. 5 u mol/L。②延伸弓丨物稀释(共27个)将合成好的引物稀释到240 u mol/L ；从27管稀释好的延伸引物中各取5 y L力口入 到一个新的环氧树脂管中，并补加105 yL灭菌双蒸馏水作为新的延伸引物池；延伸引物池 中共有240 u L试剂，各引物终浓度为5 u mol/L。(3) 27-重 PCR
①配制多重反应混合物，每个96孔板(96个样品)所需试剂组成如下 引物池(各引物浓度为2. 5 u mol/L) dNTPs (各成分浓度为2. 5mmol/L) 10XPCR缓冲液II MgCl2(25mmol/L)
Amplitaq Gold DNA 聚合酶(5 单位 / ii L) 双蒸馏水
10. 56u L 18. 77 u L 52. 8u L 105. 6 u L
10.56u L 118.51u L_合计316.8iiL②向96孔板每孔内加入3 u L配好的PCR混合物，再将稀释好的基因组DNA加入 到对应的孔内，每孔加2 iiL。③用封板膜密封96孔板，1000r/min离心10秒。④在基因扩增仪上运行如下程序HOLD :94°C lmin — 40个循环94°C 30秒， 55°C 30 秒，72°C lmin — HOLD :4°C lOmin。
(4)PCR产物纯化
①按照下表中的体系，配制纯化试剂
核酸外切酶工(20单位／u L)lo．56 u L
碱性磷酸酶(1单位／u L)105．13 u L
10X碱性磷酸酶缓沖液31．68 u L
双蒸馏水169．43 u L
合计316．8 u L
②PCR结束后，取出96孔板，1000r．／’min离心lo秒，每孔加入3 u L新配制的纯化试剂。
⑧取新的封板膜密封96孔板，1000r．／’min离心lo秒。
④在基因扩增仪上运行如下程序37℃30m~n一96℃10m~n一4℃10m~n。纯化好的PCR产物可以在一20℃条件下存放几天。
(5)引物延伸反应
①提前将微阵列芯片延伸稀释缓沖液和纯化好的PCR产物解冻。
②按下表所示体系配制微阵列芯片引物延伸反应混合物
延伸稀释缓沖液397．17 u L
延伸引物混合物3．17 1~1+
20 X延伸试剂混合物(T／C，A／G)各lo．56 1~I+
双蒸馏水315．53 u L
DNA聚合酶2．21 1~I+
合计739．2 u L
⑧将PCR板t000r．／’m~n离心lo秒，向每个孔中加入7 u L配制好的引物延伸反应混合物。
④重新用封板膜封上PCR板，1000r．／’min离心lo秒。
⑤在基因扩增仪上，运行如下程序HOLD96℃3min一46个循环94~一C20秒，40℃11秒一HOLD4℃10min。
(6)准备微阵列芯片杂交板并进行杂交反应
①按照下表所示体系配制微阵列芯片杂交板洗涤液
20~洗涤缓沖液[300~I+
双蒸馏水5．700 u L
合计6000 u L
②取一七．384孔微阵列芯片杂交板，用封板膜将本次不使用的孔封闭。向杂交板的每个反应孔中加18~L 1 X微阵列芯片板洗涤缓沖液工。
⑧将微阵列芯片杂交板翻过来放在无生纸上，一起放在离心机的托盘内2000r／min离心2min，使杂交板上每个孔中的清洗液全部脱离。
④重复步骤②和⑧，共清洗3次。
⑤根据下表所示体系配制杂交溶液杂交缓冲液850 U L杂交试剂50 ii L_合计900 iiL⑥向96孔板每孔中加入8 PL上述杂交溶液，在离心机上稍稍离心使其混合均勻。 吸取18 ii L加入到微阵列芯片杂交板上对应的孔内。⑦将加入混合液的微阵列芯片杂交板放入一个密封的湿盒中，置于培养箱中， 42°C孵育2 2. 5小时。(7)杂交反应后清洗杂交板①按照下表所示体系配制杂交板清洗液64X 洗涤缓冲液 II100 u L双蒸馏水6300 iiL_合计6400 iiL②杂交反应完成后，将杂交板扣于无尘吸水纸上，2000r/min离心10秒，甩掉反应液。③每个反应孔加入ISiiL IX洗涤缓冲液II，再次清洗微阵列芯片杂交板，共清 洗3次。④清洗完毕后，用无尘纸蘸取少量无水乙醇轻轻擦拭杂交板背面玻片，使其清晰 无痕迹。(8)扫描杂交板清洗好的杂交板马上放到GenomeLab SNPstream 基因分型系统扫描仪上，运行 RunManager程序，进行扫描。扫描后杂交板避光保存。6.数据分析(1)编辑样本及信息运行PlateExplorer程序，编辑样本信息并生成.txt文件。导入从Autoprimer软 件中导出的单核苷酸多态性位点引物文件，上传样本信息文件，所有数据保存至数据库中。(2)读取扫描信息运行SNPAdmin程序，将扫描的杂交板信息转化为图像信息，并上传数据，获取基 因型。(3)分型结果调整与分析运行GetGenos程序，通过QC Review判断是否存在偏移点，如存在则需调整，并保 存至数据库，然后重新获取基因分型信息。在QC Review模式下分析数据，在质控点分型结 果合格的情况下，去除分型成功率<90%的单核苷酸多态性位点，通过R印ort程序导出分 型成功率> 90%的各单核苷酸多态性位点基因分型报告。7.单核苷酸多态性位点检测稳定性评价按上述方法对部分DNA样本单核苷酸多态性位点重复测定2次，计算单一单核苷 酸多态性位点基因分型结果符合率。
1
图1为91例样本检测后质控点分型结果，其中a、b、c、d图分别为基因型XX、YY、 XY和阴性质控点；图2为91例样品检测后3个单核苷酸多态性位点的分型结果，其中a、b、c图分别 为单核苷酸多态性位点rs3213427、rs863002、rs3020729，可见91例样本根据3个单核苷 酸多态性位点分别被清晰地归类到XX、XY，YY、XY，XX、XY、YY基因型。本发明的有益效果(1)本发明采用的单碱基延伸法使检测的敏感度和准确性大大超过了一般测序反 应；(2)本发明采用的标签微阵列杂交技术可以实现高通量、自动化和多重检测；(3)本发明所述方法操作简单、结果判断快速准确、检测结果稳定性高、单次检测 平均成本低廉。本发明所应用的试剂如下Wizard 基因组DNA纯化试剂盒、琼脂糖、碱性磷酸 酶(1单位/PL)、10X碱性磷酸酶缓冲液为美国Promega公司产品，dNTPs(每种成分 浓度为2. 5mmol/L)、DL2000DNA分子标准为日本Takara公司产品，10XPCR缓冲液II、 MgCl2(25mmol/L)、Amplitaq Gold DNA 聚合酶(5 单位 / ii L)为瑞士 Roche 公司产品，Tris 碱-乙酸-乙二胺四乙酸缓冲液、溴化乙锭溶液(lOyg/yL)为北京天根公司产品，核酸外 切酶I (20单位/ y L)为美国Biolabs公司产品，延伸稀释缓冲液、20 X延伸试剂混合物(T/ C，A/G)、DNA聚合酶、20X洗涤缓冲液I、杂交缓冲液、杂交试剂、64X洗涤缓冲液II、微阵 列芯片杂交板为美国Beckman Coulter公司产品(除已标明来源外)。本发明所应用的主要仪器如下DU800紫外/可见光分光光度计、GenomeLab SNPstream 基因分型系统为美国 BeckmanCoulter公司产品，基因扩增仪为德国Eppendorf公司产品，EPS-4105数字式双恒 电泳仪为北京军科院仪器厂产品，SX-300凝胶图像分析系统为上海小源科技公司产品(除 已标明来源外)。序列表<110>中国人民解放军总医院<120> 一种检测人6种免疫相关基因的标签单核苷酸多态性位点方法<160>81<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs4844600-R-TC-U41的上游扩增 引物。<400>1AATAACCAGG GCGGCATT 18<210>2
<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs4844600-R-TC-U41的下游扩增 引物。<400>2AATGCCCCAG AATGGCTT 18<210>3<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs4844600-R-TC-U41的上游延伸 引物。<400>3TACCTATGAC CAGCAAGCAC GATATGTCCC AATGGGAAAC TCAAA<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs2255301-TC-U39的上游扩增引 物。<400>4GAAAGGCAAA GGTGGAGG 18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs2255301-TC-U39的下游扩增引 物。<400>5TGCTGGGAGG AGCGCTAA 18<210>6<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs2255301-TC-U39的上游延伸引 物。<400>6CACGACAAGA CAACAGATAC GGGGTAGAGG GGGACAGCGG CGACA 45
1
<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsll585-TC_U40的上游扩增引 物。<400>7TACCTTAATT TCTAGGTGGG TGC 23<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsll585-TC_U40的下游扩增引 物。<400>8CCTCCTCTCC CAGAGGCT 18<210>9<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsll585-TC_U40的上游延伸引 物。<400>9AAGTACCACG TCAACGTCAC TTCATTGTAG GTAAGGACAT TTTCT 45<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs831629-TC_U34的上游扩增引 物。<400>10ATTTCTTAGT TCTGCTATGG ATGC 24<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs831629-TC-U34的下游扩增引 物。<400>11
TAGTGATAGC ATCAGGTGAG AAGA 24<210>12<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs831629-TC-U34的上游延伸引 物。<400>12CACTAGTCAT AACGCAGCCT TACTTAGGCA AGTTCAAAAC CTCCC 45<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3020729-TC_U38的上游扩增引 物。<400>13TAAAATGAAG TGGTGAGCTT AACC 24<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3020729-TC-U38的下游扩增引 物。<400>14GGCCCCTCTG CAATGCAA 18<210>15<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3020729-TC_U38的上游延伸引 物。<400>15ACGTAAGACC ACTCAAGACC AAAGAAAATC TCTGTGAAAC CCCTA 45<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl075835-TC_U37的上游扩增引 物。
物。物。
增引物。
增引物。
<400>16
TAGACTGTCA TCTCTGTCCT CAAG 24
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增 -TC-U37的下游扩增引 <400>17
TACTCTGAAG TCCCACAGCA C 21 <210>18 <211>45 <212>DNA <213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl075835-TC-U37的上游延伸引 <400>18
ACCGCACTAA GCAATGTATC GGAGAGTTGA GAAACCAAAT CACTA 45
<210>19
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl3024609-R-TC-U35的上游扩 <400>19
TGGTTCTGAG GCTACAGCA 19 <210>20 <211>23 <212>DNA <213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl3024609-R-TC-U35的下游扩 <400>20
ACTTGAGTTA AGATCACACT GGG 23 <210>21 <211>45 <212>DNA <213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl3024609-R-TC-U35的上游延伸引物。
物。物。物。引物。
<400>21
CAGAATAGCC ACGCCTAGAT ACCGAACTCG GCCTGTGCCC CAACT 45 <210>22 <211>28 <212>DNA <213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs863002-TC-U36的上游扩增引 <400>22
CTCAGTCTTT ATATCTCTT CCTTTTCC 28
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs863002-TC-U36的下游扩增引 <400>23
ATGGAACTGA CTCAAAGGCA 20
<210>24
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs863002-TC-U36的下游延伸引 <400>24
CACCGCTATC AACAGACTTG CTAGGAGGCT AGCATAGGAA GGAGA 45
<210>25
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3213426-R-TC-U33的上游扩增 <400>25
AACTTGTAGA ATTACAACT GGCAG 25 <210>26 <211>18 <212>DNA <213>人工序列
引物。引物。物。物。物。
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3213426-R-TC-U33的下游扩增 <400>26
TCCTCTGTGG TCCCAGGG 18
<210>27
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3213426-R-TC-U33的上游延伸 <400>27
CGCAGAAGCA ACTCACTTCT GCCCAGGACC ACAACCCACC TCACT 45 <210>28 <211>23 <212>DNA <213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3213427-TC-U31的上游扩增引 <400>28
TTGAGTGTTG CTCTCTAGTT TCC 23
<210>29
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3213427-TC-U31的下游扩增引 <400>29
CCTGGGATCC AAATGAGC 18
<210>30
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3213427-TC-U31的上游延伸引 <400>30
CAGAACATCC TCAGAAGCAA CCTTCAAGCC TAGCCCTTCT CTCAT 45
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl055141-TC_U32的上游扩增引 物。<400>31CAGAAAAATT TGACCTGTGA GG 22<210>32<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl055141-TC_U32的下游扩增引 物。<400>32TTCTCCCGCT TCGAGACC 18<210>33<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl055141-TC_U32的上游延伸引 物。<400>33CAAGCAACGA CCTACTACAA CCACCTCCCC TAAGCTGATG CTGAG 45<210>34<211>22<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl075838-TC-U29的上游扩增引 物。<400>34CCACTTTATA TCCTAGGCCT GG 22<210>35<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl075838-TC_U29的下游扩增引 物。<400>35TAACTGGGGA CCAGATGACA 20<210>36<211>45
20
<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl075838-TC_U29的上游延伸引 物。<400>36AATAAGCTCA CCACCGTCAA TCCTTTGAGG TGCTATCTTG GTGCC 45<210>37<211>23<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl546727-R-TC_U23的上游扩增 引物。<400>37CTCTAGAGCT GGCCTGT°C TA TTT 23<210>38<211>23<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl546727-R-TC_U23的下游扩增 引物。<400>38TAAACCTAGG GTTCTCATTT TCC 23<210>39<211 >45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl546727-R-TC-U23的下游延伸 引物。<400>39AGTAGCCTAA CAGCACTCGA AGGTTAAGTA ACTTGCCTGA GGGTC 45<210>40<211>26<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl3400210-TC-U25的上游扩增 引物。<400>40ATAAATAAAA AAGAGAAGCA CAATGC 26<210>41
21
<211>19<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl3400210-TC-U25的下游扩增 引物。<400>41AACCACCCTG GAAGGTAGG 19<210>42<211 >45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl3400210-TC-U25的上游延伸 引物。<400>42CCATAACAAC TTACCAGCCA ATCTCTGACT CTGGCCCGTC TCTTC 45<210>43<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsll064410-R-TC-U21的上游扩 增引物。<400>43TCTCCTCAGT TCTAGGCACA C 21<210>44<211>23<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsll064410-R-TC-U21的下游扩 增引物。<400>44TTTTCTTTTG AAGAGAAGCA AGG 23<210>45<211 >45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsll064410-R-TC-U21的上游延 伸引物。<400>45GATCCATCAA CAGACATCAC TATCCTGCCA TCACCCCAAA CGCAA 45<210>46 <211>24 <212>DNA <213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl7048010-TC-U19的上游扩增 <400>46
AAATTTCTGC CGTAATTCTC TACC 24
<210>47
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl7048010-TC-U19的下游扩增 <400>47
TATGGAGTTT CTGTTATAAC TGCC 24
<210>48
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl7048010-TC-U19的上游延伸 <400>48
CCACTCAACT CCACGAATAC TTCAAGGCTG CTCCTTGTTC TAATA 45
<210>49
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs4832054-R-TC-U20的上游扩增 <400>49
AAAAGAAGTT TCTCTCTCCT CATG 24
<210>50
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs4832054-R-TC-U20的下游扩增 <400>50
ATTTGTCATG TAATCCACAT GTTC 24<210>51<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs4832054-R-TC-U20的下游延伸 引物。<400>51ACAACTACCG ACGACAAGAC TGGAGTCTAT TCATGCATCA CTTCA 45<210>52<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3818361-TC_U18的上游扩增引 物。<400>52AAAGGACAGT TCCAGAGCAC T 21<210>53<211>26<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3818361-TC-U18的下游扩增引 物。<400>53TTAGTGAGAT GTGGCTACTG AACTAC 26<210>54<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3818361-TC-U18的上游延伸引 物。<400>54AACATCCACG CAACTCATAC GTTAGATATG GGGCAATTTC CTTTG 45<210>55<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsll064404-TC-U14的上游扩增 引物。
引物。引物。物。物。
<400>55
TACAAAATTG GAACACCACC 20
<210>56
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsll064404-TC-U14的下游扩增 <400>56
GCTTTGCCAT TTTAGCCTC 19
<210>57
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsll064404-TC-U14的上游延伸 <400>57
AACATACAGA CGCACTCCTC AATGCTGATG AGGATGTGGA GAAAC 45
<210>58
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl738548-TC-U12的上游扩增引 <400>58
AATTACTTGT CTGAAATGGC AGG 23
<210>59
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl738548-TC-U12的下游扩增引 <400>59
AAGAAGCAGA AAAAAGTCAT GATG 24 <210>60 <211>45 <212>DNA <213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl738548-TC-U12的上游延伸引<400>60
CCAGATCCTC ACCATGTAAG ACCTCAATCT GTAGTACATA TCAAG 45 <210>61 <211>28 <212>DNA <213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsllll8167-TC-U10的上游扩增 <400>61
ATTTAATTGA GTCAATACTG GTTATGTG 28 <210>62 <211>24 <212>DNA <213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsllll8167-TC-U10的下游扩增 <400>62
AAAAGATAAG GCATGAGAAA TGAA 24
<210>63
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsllll8167-TC-U10的上游延伸 <400>63
TCCAGAATAG ACAACAGACG CCAATATGTG AATATTATTA TCTTA 45
<210>64
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs2231454-R-TC-U6的上游扩增 <400>64
TATACTTACT ACTGTGAAGT AGGTCTCAAC T 31
<210>65
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
26<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs2231454-R-TC-U6的下游扩增
<400>65
TCCCTAAAGT TTGAGAACCA CT 22 <210>66 <211>45 <212>DNA <213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs2231454-R-TC-U6的上游延伸 <400>66
ACAACTCACG CAAGTACCAT CACCAACTGG TGCTAAAGAC TAGGA 45 <210>67 <211>32 <212>DNA <213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl2477946-R-TC-U7的上游扩增 <400>67
ATATTTATTC TATCTGGAGT ATACATTTGT GA 32 <210>68 <211>22 <212>DNA <213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl2477946-R-TC-U7的下游扩增 <400>68
AAGGATTCGA TCATTAGTGC TG 22 <210>69 <211>45 <212>DNA <213>人工序列
<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl2477946-R-TC-U7的上游延伸 <400>69
TACAAGCACG CACTAGACAT GAGATAGAGT TCAAGTTTTA CGTTT 45 <210>70 <211>26 <212>DNA
<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs6722860-TC_U5的上游扩增引 物。<400>70TTTGTCTTAC ATCCAAGTAC TGAAGT 26<210>71<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs6722860-TC_U5的下游扩增引 物。<400>71ATCTGAGAAT TCAGAAAGCA GATC 24<210>72<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs6722860-TC_U5的上游延伸引 物。<400>72CAACAAGTAA TCCGCAGACT CCAGGCTGCT ACAGGGCTTG AAGGT 45<210>73<211>27<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl2576440-R-TC_U4的上游扩增 引物。<400>73TTTTAGTCTA GGGAGTAGTT TTACCAA 27<210>74<211>31<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl2576440-R-TC-U4的下游扩增 引物。<400>74CCCAAATATT CTATAATTAA CCAAGTATTA C 31<210>75<211>45
<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl2576440-R-TC-U4的上游延伸 引物。<400>75ATCTAACGCA CCTACGACCT GAACATTGTC ATGTGTGAAT TTTCC 45<210>76<211>28<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl0768024-TC_U3的上游扩增引 物。<400>76AGATTAAGGA GATTATTTTG GATTATTC 28<210>77<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl0768024-TC_U3的下游扩增引 物。<400>77TCGGTCATGA GTCTTTGACA 20<210>78<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl0768024-TC_U3的上游延伸引 物。<400>78CAGCCATCCA TTCACTATCT GGGCCCAATG TAATCCCAGG GGTCA 45<210>79<211>23<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs9429945-TC_U2的上游扩增引 物。<400>79AATTTCCACA AACTTAGTGG CTT 23<210>80
<211>19<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs9429945-TC_U2的下游扩增引 物。<400>80AGCCTCCACA AGGAACACA 19<210>81<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs9429945-TC-U2的上游延伸引 物。<400>81CTCAGACTAC GAATCCACGT TGTATTCTCT TCCAGTTCTG GAGGC 4权利要求
一种检测人6种免疫相关基因的标签单核苷酸多态性位点方法，这些基因及标签单核苷酸多态性位点为补体受体1型基因rs3818361、rs9429945、rs4844600、rs17048010、rs11118167；达菲抗原/趋化因子受体基因rs863002；白细胞分化抗原59基因rs1546727、rs831629、rs10768024、rs2231454、rs11585、rs1738548、rs12576440；白细胞分化抗原4基因rs11064410、rs2255301、rs1075835、rs1075838、rs11064404、rs3213427、rs1055141、rs3213426；白细胞分化抗原8A基因rs3020729；白细胞分化抗原8B基因rs4832054、rs12477946、rs13024609、rs6722860、rs13400210，其特征在于检测方法包括如下步骤(1)挑选各基因的标签单核苷酸多态性位点，确定延伸试剂类型，并对初选单核苷酸多态性位点进行评价、调整；(2)设计单核苷酸多态性位点扩增引物及延伸引物，委托公司合成；(3)制备人全血基因组DNA样本；(4)单重PCR验证单核苷酸多态性位点扩增引物质量；(5)通过多重PCR-荧光标记单碱基延伸-标签微阵列杂交反应制备供基因分型系统检测单核苷酸多态性位点用的样本；(6)采用基因分型系统检测样本单核苷酸多态性位点；(7)采用基因分型系统软件分析单核苷酸多态性位点分型效果，去除分型成功率＜90％的单核苷酸多态性位点，并利用分型成功率＞90％的单核苷酸多态性位点确定个体基因型；(8)对多个DNA样本单核苷酸多态性位点重复检测，计算分型符合率，以评价方法的稳定性。
2.根据权利要求1所述的一种检测人6种免疫相关基因的标签单核苷酸多态性位点方 法，其特征在于设计的27个标签单核苷酸多态性位点扩增引物及延伸引物序列如序列1 81所述引物序列。
全文摘要
本发明提供一种检测人6种免疫相关基因的标签单核苷酸多态性位点方法，它运用多重PCR-荧光标记单碱基延伸-标签微阵列杂交基因分型技术结合GenomeLabTMSNPstream基因分型系统同时检测上述6个基因27个标签单核苷酸多态性位点，具体方法包括基因组DNA提取、候选基因标签单核苷酸多态性位点的筛选、单核苷酸多态性位点扩增引物及延伸引物设计与合成、单重PCR验证单核苷酸多态性位点扩增引物质量、单核苷酸多态性位点检测样本的制备及检测、数据分析、方法稳定性评价。本发明具有高通量、高精确度、高通用性、简便、经济、可进行自动化检测的优点，可用于上述免疫相关基因在健康人的遗传特点或其与各种疾病遗传易感性的关联研究。
文档编号C12Q1/68GK101851673SQ20101010075
公开日2010年10月6日 申请日期2010年1月26日 优先权日2010年1月26日
发明者田亚平, 胡金川 申请人:中国人民解放军总医院