专利名称：一种重组腺病毒及其在肿瘤治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种以串联方式同时携带抑癌基因和肿瘤免疫相关基因的重组腺病毒及其在肿瘤治疗中的应用。
恶性肿瘤是目前严重危害人类健康的疾病之一，而其治愈率之低给医学工作者带来严重挑战。传统治疗手段(外科手术、放疗、化疗)常不能根治恶性肿瘤，且往往由于毒副作用而严重影响患者的生活质量，因此人们迫切需要一种新的肿瘤治疗手段。基因治疗是在基因水平上对疾病进行预防和治疗，即通过编码相关遗传信息的特异性脱氧核糖核酸(DNA)序列的转移来达到治疗目的。尽管目前人们对于肿瘤的发病机制还不甚明了，但已有诸多证据表明肿瘤的发生与细胞遗传物质的改变有关，因此基因治疗对于肿瘤是一种合理的且有着极好发展前景的治疗手段。近年来基因治疗日趋成熟，目前已在美国等发达国家广泛进入临床试验，主要包括三类肿瘤抑制基因治疗、肿瘤免疫基因治疗和药物敏感性基因治疗。这些方案的共同之处是均通过向患者体内导入单一基因(或相关DNA序列)来达到治疗目的。但肿瘤的发生和发展是一个多阶段的复杂过程，往往涉及多种基因的异常，不同肿瘤乃至患同种肿瘤的不同患者的基因异常情况都不尽相同，因此单靠一种基因或一类治疗方案很难达到广泛而有效的治疗效果。在这种情况下，肿瘤的复合基因治疗往往显得更为有效，即联合多种基因治疗策略，通过向患者体内导入多种目的基因，从多个环节控制肿瘤的发生和发展。
本发明的目的在于提供一种用于肿瘤复合基因治疗的重组腺病毒。该重组腺病毒以串联方式携带人抑癌基因和肿瘤免疫相关基因，因此同时具备肿瘤抑制基因治疗和肿瘤免疫基因治疗的双重功效。
本发明的具体实施方案如下1.将人抑癌基因和肿瘤免疫相关基因以串联方式插入到同一株腺病毒载体上，获得重组腺病毒。
2.观察到重组腺病毒可以有效地进入肿瘤细胞。
3.观察到该重组腺病毒介导的抑癌基因和肿瘤免疫相关基因可在肿瘤细胞中有效表达。
4.观察到抑癌基因具有抑制肿瘤细胞生长并诱导其凋亡的功能，即可实现肿瘤抑制基因治疗；亦观察到肿瘤免疫相关基因具有增强肿瘤细胞的免疫原性，进而提高机体的抗肿瘤免疫反应的功能，即可实现肿瘤免疫基因治疗。
本发明提供一种以串联方式携带抑癌基因和肿瘤免疫相关基因的重组腺病毒，其中的抑癌基因可以是p53，肿瘤免疫相关基因可以是B7-1和GM-CSF。该重组腺病毒可以以液体形式被配成注射液、滴液、喷雾剂、涂抹液等用于治疗肿瘤，其肿瘤类型可以是头颈部肿瘤，头颈部肿瘤的类型又可以是喉癌。实施例将通过描述以串联方式携带p53，B7-1和GM-CSF基因的重组腺病毒及其对喉癌的基因治疗作用来进一步阐述本发明。
应用本发明提供的重组腺病毒治疗肿瘤是从肿瘤发生与发展的机理入手，联合肿瘤抑制基因治疗和肿瘤免疫基因治疗策略，同时向患者体内导入抑癌基因和肿瘤免疫相关基因。一方面通过抑癌基因来抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡；另一方面通过肿瘤免疫相关基因来提高肿瘤细胞的免疫原性，进而调动机体自身的抗肿瘤免疫反应来杀死残余或转移的肿瘤细胞。因此应用本发明提供的重组腺病毒治疗肿瘤比以往的肿瘤治疗手段更具有科学性和逻辑性，疗效将更持久和彻底。若本发明得以应用，将为目前尚无成熟治疗方法的肿瘤的临床治疗提供一种新的治疗策略。
结合附图进一步说明本发明
图1为以串联方式携带抑癌基因和肿瘤免疫相关基因的重组腺病毒的结构示意图。1——代表腺病毒基因组2
代表抑癌基因，包括一种或多种的组合A1，A2，...，An。此类基因具有抑制肿瘤细胞生长并诱导其凋亡的功能，即可实现肿瘤抑制基因治疗。3
代表肿瘤免疫相关基因，包括一种或多种的组合B1，B2，...，Bn。此类基因具有增强肿瘤细胞的免疫原性，进而提高机体的抗肿瘤免疫反应的功能，即可实现肿瘤免疫基因治疗。图2携带人野生型抑癌基因p53，免疫共刺激分子B7-1和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF三种外源基因的穿梭质粒pBB-102的构建示意图1.poly A；2.GM-CSF基因；3.内部核糖体进入位点序列(IRES)；4.p53基因；5.CMV启动子；6.B7-1基因；7.RSV启动子图3携带人野生型p53，B7-1和GM-CSF三种外源基因的重组腺病毒BB-102的结构示意图1——腺病毒基因组； 2.GM-CSF geneGM-CSF基因；3p53基因；4.B7-1基因图4免疫组织化学法检测Ad-p53和BB-102介导的p53基因在喉癌细胞Hep-2中的表达1.对照细胞，p53表达阴性；2.携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒Ad-GFP感染的细胞，p53表达阴性3.携带人野生型p53基因的重组腺病毒Ad-p53感染的细胞，p53表达阳性4.BB-102感染的细胞，p53表达阳性。图5流式细胞分析法检测BB-102介导的B7-1基因在Hep-2细胞中的表达图6ELISA检测BB-102介导的GM-CSF基因在Hep-2细胞中的表达图7BB-102对Hep-2细胞生长的抑制作用图8TdT法原位检测Ad-p53和BB-102介导的p53基因对Hep-2细胞的凋亡诱导作用
1.对照细胞，细胞无凋亡；2.Ad-GFP感染的细胞，细胞无凋亡；3.Ad-p53感染的细胞，细胞发生凋亡；4.BB-102感染的细胞，细胞发生凋亡。图9透射电镜观察Ad-p53和BB-102所介导的p53基因对Hep-2细胞超微结构的影响。
1.对照细胞细胞结构正常，无凋亡；2.Ad-GFP感染的细胞细胞结构正常，无凋亡；3.Ad-p53感染的细胞细胞出现凋亡特征，如染色质固缩边移，线粒体肿胀，富含溶酶体，核破碎等；4.BB-102感染的细胞；细胞出现凋亡特征，如染色质固缩边移，线粒体肿胀，富含溶酶体，核破碎等。图10细胞毒分析。以BB-102感染Hep-2细胞而制备的瘤苗可在体外诱导外周血淋巴细胞(PBL)形成细胞毒性T细胞(CTL)，CTL对正常Hep-2细胞具有裂解活性。
实施例以串联方式携带p53，B7-1和GM-CSF基因的重组腺病毒及其对喉癌的基因治疗作用1.腺病毒的构建携带人野生型p53，B7-1和GM-CSF三种外源基因的穿梭质粒(命名为pBB-102)的构建过程如图2所示。将pBB-102与携带腺病毒基因组DNA的重组质粒GT4050共转染293细胞，二者在细胞内发生同源重组，形成携带人野生型p53，B7-1和GM-CSF三种外源基因的重组腺病毒，命名为BB-102，其结构示意图如图3所示。
携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒(Ad-GFP)和携带人野生型p53基因的重组腺病毒(Ad-p53)由美国百特医疗用品公司基因治疗部(Gene TherapyUnit，Baxter Healthcare Company，USA)惠赠，293细胞系购自ATCC。
2.病毒扩增与纯化将293细胞接种于150毫米平皿中，待细胞生长至90％汇合状态时，按10个空斑形成单位(pfu)/细胞的量加入病毒，36～48小时后，细胞出现完全病变效应(CPE)，收集细胞，冻存于-80℃，待累计到50～60个平皿时，统一纯化病毒。
将出现细胞病变效应的293细胞于-80℃和37℃间反复冻融三次，2500转/分钟离心10分钟以除去细胞碎片；配制1.5克/毫升氯化铯溶液(秤取30克氯化铯，加PBS至终体积42.5毫升)、1.35克/毫升氯化铯溶液(取15毫升1.5克/毫升的氯化铯液，加PBS至终体积21毫升)和1.25克/毫升氯化铯溶液(取11毫升1.5克/毫升的氯化铯液，加PBS至终体积20毫升)；制备氯化铯密度梯度依次将0.5毫升1.5克/毫升氯化铯溶液、2.5毫升1.35克/毫升氯化铯溶液和2.5毫升1.25克/毫升氯化铯溶液加入超速离心管中；将6毫升冻融后的待纯化病毒加于各管的氯化铯梯度液之上；150,000g，10℃离心1小时，于1.35克/毫升氯化铯溶液和1.25克/毫升氯化铯溶液之间出现白色雾状病毒带；收集病毒带，并与1.35克/毫升氯化铯溶液混和；150,000g，10℃离心18小时；吸出病毒带，以1～2倍体积的Hanks液稀释病毒，以Hanks液为透析液于4℃透析病毒，每2小时更换一次透析液，共换液5次；取出纯化的病毒液，空斑实验确定其滴度分别为BB-1022×1010空斑形成单位/毫升；Ad-p532×1011空斑形成单位/毫升；Ad-GFP9×1010空斑形成单位/毫升；加10％无菌甘油，-80℃冻存。
3.腺病毒载体对喉癌细胞Hep-2的转染率将Hep-2细胞接种于6孔板，接种量为5×105细胞/孔，24小时后将培养液(含5％胎牛血清的DMEM)吸出，分别用0、20、40、60、80和100空斑形成单位/细胞的Ad-GFP(稀释于0.5毫升培养液)感染细胞，1～2小时后吸去病毒液，每孔加3毫升培养液，24～48小时后，在荧光显微镜下计数GFP表达阳性的细胞数，同时计数该视野内的全部细胞数，计算转染率。结果表明喉癌细胞对腺病毒高度敏感。随着病毒量的加大，其转染率提高，当病毒量为50空斑形成单位/细胞时，转染率达90％以上。
4.腺病毒载体介导的外源基因在喉癌细胞中的表达Hep-2细胞以5×104细胞/孔的量接种于12孔培养板，每孔底部加一小块盖玻片，使细胞能够自然生长于玻片上，24小时后分别以50空斑形成单位/细胞的BB-102、或Ad-p53、或Ad-GFP感染细胞，48小时后将玻片取出，以丙酮固定细胞，通过免疫组化法可检测到BB-102或Ad-p53所介导的p53基因在Hep-2细胞中均可高效表达(图4)。
Hep-2细胞以1×106细胞/皿的量接种于60毫米平皿中，24小时后以50空斑形成单位/细胞的BB-102感染细胞，48小时后将细胞消化下来，用Hanks液洗两遍，重悬于100～200微升Hanks液中，加20微升FITC标记的鼠抗人B7-1单克隆抗体，室温孵育30分钟，用Hanks液洗两遍，重悬于1～2毫升Hanks液中，通过流式细胞分析可检测到BB-102介导的B7-1基因在Hep-2细胞膜上的表达(图5)。
Hep-2细胞以5×105细胞/皿的量接种于60毫米平皿中，24小时后以50空斑形成单位/细胞的BB-102感染细胞，此后每24小时收集上清，更换新鲜培养液，连续12天。ELISA检测BB-102介导的GM-CSF在Hep-2细胞中的表达。结果表明(图6)以50空斑形成单位/细胞的BB-102感染Hep-2细胞2-4天时，GM-CSF表达至高峰，随后呈下降趋势。
5.BB-102介导的p53基因对Hep-2细胞的生长抑制作用Hep-2细胞以5×104细胞/孔的量接种于6孔培养板，24小时后以50空斑形成单位/细胞的BB-102或Ad-GFP感染细胞，此后每天观察细胞生长状况，随后将细胞消化下来，经台盼蓝染色后计数活细胞，绘制细胞生长曲线。结果表明(图7)与正常Hep-2细胞相比，以50空斑形成单位/细胞的BB-102感染的细胞，其生长受到明显抑制，而该剂量的对照病毒Ad-GFP则对细胞生长不产生影响。
6.BB-102和Ad-p53介导的人野生型p53基因对Hep-2细胞凋亡的诱导Hep-2细胞以5×104细胞/孔的量接种于12孔培养板，每孔底部加一小块盖玻片，使细胞能够自然生长于玻片上，24小时后分别以50空斑形成单位/细胞的BB-102、或Ad-p53、或Ad-GFP感染细胞，72小时后将玻片取出，以中性福尔马林固定细胞，通过3’末端标记法原位检测细胞凋亡(TdT FragELTMDNA Fragmentation Detection Kit，Oncogene)。结果如图8所示感染BB-102或Ad-p53的细胞发生凋亡，而感染Ad-GFP的细胞和对照细胞则无凋亡。
Hep-2细胞以1×106细胞/瓶的量接种于培养瓶，24小时后以50空斑形成单位/细胞的BB-102、或Ad-p53、或Ad-GFP感染细胞，72小时后固定细胞，通过透射电镜观察细胞超微结构。结果如图9所示BB-102或Ad-p53感染的细胞均可见染色质固缩边移，线粒体空虚，富含溶酶体，核破碎等等。而感染Ad-GFP的细胞和对照细胞则无此现象。
7.BB-102介导的外源基因对Hep-2细胞免疫原性的影响取三瓶Hep-2细胞，其中一瓶为对照，另外两瓶分别以50空斑形成单位/细胞的Ad-GFP或BB-102感染，12小时后三瓶细胞均以30戈瑞60Coγ射线照射灭活，并分别与来自自愿献血者的外周血淋巴细胞(PBL)以1∶10的比例混合培养于含10％FBS的RPMI-1640培养液中，加白介素2至终浓度为100单位/毫升，置于37℃的二氧化碳培养箱中培养。7天后将刺激后的淋巴细胞(效应细胞)与Hep-2细胞(靶细胞)以不同的效靶比(100∶1，50∶1，25∶1，12.5∶1)混合培养于96孔板(每孔含1×104肿瘤细胞)，4小时后测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性(CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit，Cat.#G4000，Promega)，计算效应细胞对靶细胞的裂解活性。结果如图10所示以BB-102感染Hep-2细胞而制备的瘤苗可在体外诱导外周血淋巴细胞生成细胞毒性T细胞(CTL)，这些CTL(效应细胞)对野生型Hep-2细胞(靶细胞)具有杀伤活性，当效靶比为100∶1时，其杀伤率可达60％以上。
权利要求
1.一种用于肿瘤治疗的重组腺病毒，其特征在于该腺病毒以串联方式同时携带抑癌基因和肿瘤免疫相关基因。
2.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征是抑癌基因可以是p53。
3.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征是肿瘤免疫相关基因可以是B7-1和GM-CSF。
4.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于该腺病毒可以用于治疗肿瘤。
5.根据权利要求4所述的重组腺病毒，其特征是肿瘤可以是头颈部肿瘤。
6.根据权利要求5所述的重组腺病毒，其特征是头颈部肿瘤可以是喉癌。
7.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征是所述重组腺病毒可以以液体形式被配成注射液、滴液、喷雾剂、涂抹液等。
全文摘要
本发明涉及生物医学领域,具体地说是涉及一种串联方式同时携带抑癌基因和肿瘤免疫相关基因的重组腺病毒及其在肿瘤治疗中的应用。将抑癌基因和肿瘤免疫相关基因以串联方式插入到同一株腺病毒载体上,实验表明;该重组腺病毒同时具备双重抗肿瘤功效:(1)抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡(2)增强肿瘤细胞的免疫原性进而提高机体的抗肿瘤免疫反应。据此认为:此类重组腺病毒在肿瘤的基因治疗中具有极好的应用前景。
文档编号C12N15/09GK1260998SQ9910030
公开日2000年7月26日 申请日期1999年1月20日 优先权日1999年1月20日
发明者邱兆华, 吴祖泽, 劳妙芬 申请人:中国人民解放军军事医学科学院百环生物医学研究中心