专利名称：一种提高抗真菌蛋白质抗菌活性的方法
技术领域：
本发明属于植物保护学以及基因工程技术领域，具体涉及一种赋予抗菌蛋白靶向 结合真菌细胞壁能力的方法。
背景技术：
抗真菌蛋白质是一类对真菌生长具有抑制作用的蛋白质，一般分子量较小，结构 稳定，结合到真菌细胞表面后起到可以起到抑制真菌生长的作用。抗植物病原真菌的蛋 白质由于不易使真菌产生耐药性，对环境友好，对人畜安全而可以作为生物农药使用。抗 真菌蛋白的抗菌机制主要有在细胞壁和细胞膜上形成孔道，造成离子泄漏，对真菌产生 破坏作用；或者具有类似于去垢剂的功能，使真菌的细胞壁及细胞膜受到破坏(Zasloff et al，2002)。目前已报道的抗真菌蛋白包括植物防御素(plant defensins)、脂质转移 蛋白(lipidtransfer proteins, LTPs)、硫素(thionins)、蜕皮素(snakins)、橡胶蛋白类 (hevein-lik印印tides)、打结素类(knottin-like ρ印tides)、凤仙花素(IbAMPs)，MBPl 和新近发现的荠菜素(sh印herdins)、环肽(cyclotides)等。几丁质(chitin)是真菌细胞壁所特有的重要结构物质，植物细胞壁及哺乳动物 细胞中均不含此类物质。几丁质结合域(chitin-binding domain, CBD)是一段多肽，多 见于几丁质酶(chitinase)，可帮助蛋白质结合于几丁质底物，但几丁质结合域本身并无 抑菌活性。几丁质结合域是一种高度保守的结构域，各种不同来源的几丁质结合域同源 性非常高，可普遍地结合于真菌细胞表面的几丁质，从而产生对真菌细胞壁的亲和作用。 Tantimavanich(1998)发现，若将源于黑麦种子的几丁质酶RSC_a的几丁质结合域去掉， RSC-a对水溶性乙二醇几丁质的水解活性几乎没有变化，而对不溶于水、存在于真菌细胞壁 的胶状几丁质的活性只相当于完整RSC-a的28%。而且RSC-a的几丁质结合域对几丁质的 结合是独立于催化区的，暗示几丁质结合域可以使蛋白质集中于真菌的细胞壁而起作用。 此外，在Iseli B. (1993)对烟草class I几丁质酶的研究中发现，具1个几丁质结合域的 几丁质酶的抗真菌能力比不具几丁质结合域的相同的酶要高3倍。如果将几丁质结合域去 掉，几丁质酶的抗真菌能力将大大下降(Itoh et al.，2002)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高抗真菌蛋白质抗菌活性的方法，以改造抗真菌蛋 白质，提高其对真菌细胞壁的结合能力，从而提高抗菌蛋白质作用的有效浓度。本发明方法包括将编码几丁质结合域(chitin-binding domain, CBD)的DNA序列 与编码抗真菌蛋白质的cDNA序列以正确读码框连接，然后克隆到蛋白质表达载体中，使用 工程菌对融合蛋白质进行表达，进一步利用商业化介质进行蛋白质纯化。还包括纯化后的 蛋白质的几丁质结合能力的检测，以及融合了几丁质结合域的蛋白质抗真菌活性与原来抗 真菌蛋白质抗菌活性的优劣比较分析。本发明提供的将几丁质结合域以正确读码框连接到抗真菌蛋白质的N末端进行
3融合表达与纯化的方法，其步骤如下(1)通过PCR或其它手段，得到抗真菌蛋白质的开放阅读框序列，克隆到适当的表 达载体中，然后将几丁质结合域的编码序列再次插入到该载体中，与抗真菌蛋白质的读码 框相融合，注意间隔适当核苷酸以保证酶切位点及阅读框的正确；(2)将步骤(1)中的表达载体转入大肠杆菌，得到的基因工程菌接种于LB液体培 养基中，培养到对数生长期后以IPTG诱导蛋白质的表达，然后超声破菌，获得总的菌体蛋 白质；(3)利用载体所带的蛋白质表达标签的亲和介质纯化步骤(2)所得蛋白质，透析， 获得纯化了的带有几丁质结合域的抗真菌蛋白质。应注意到，除了利用基因工程手段生产目的蛋白质外，操作者还可以将抗菌蛋白 质的阅读框与CBD编码序列融合后插入到转基因载体中，然后转化目的物种，以产生抗病 能力更强的新物种。本发明还提供测试改造过的融合蛋白质与几丁质的结合能力的方法，其步骤为 将表达了融合蛋白质的大肠杆菌总蛋白与几丁质珠(市售)温育，洗去非特异性结合的蛋 白质，收集亲和柱上样流出液并进行SDS-PAGE电泳，通过检验各上样流出液中是否含有目 的融合蛋白及目的融合蛋白的量来判断目的融合蛋白的几丁质结合能力。本发明还提供将改造过的融合蛋白质与原先蛋白质的抑菌能力相互比较的方法， 其步骤如下将融合蛋白和原蛋白质分别与植物病原真菌孢子定量混合培养，通过定时测 量培养液吸光度以测定病原真菌生长情况，从而判定两种蛋白质对该植物病原真菌生长所 起的抑制作用，比较它们的抑菌能力。在本发明中，术语“几丁质结合域”与“CBD”交替使用，意指一类多肽或结构域，具 有结合几丁质的能力，包括来源于微生物与植物的各种拥有该种特性或功能的多肽或结构 域。术语“抗真菌蛋白质”指一类对真菌具有抑制或杀灭作用的蛋白质，包括来源于植 物或其它物种的各类拥有该特性或功能的蛋白质，尤其指不含有几丁质结合域的该种蛋白 质。术语“有效浓度”指一定浓度的溶液中，实际起作用的成分的浓度，一般低于该成 分的实际浓度。依照本发明的方法，可将几丁质结合域与所有不含有几丁质结合域的抗真菌蛋白 质融合，赋予抗真菌蛋白质靶向结合真菌细胞壁的能力，从而提高该种蛋白质抑制真菌的 有效浓度。本发明提供了一种将几丁质结合域添加到不含几丁质结合域的抗真菌蛋白质 末端，使之形成融合蛋白的方法，目的是提高抗菌蛋白质与真菌细胞壁的结合能力，从而 提高抗菌蛋白的作用效率。应理解实施例中所采用的抗真菌蛋白质Ace-AMPl (Allium cepaantimicrobial protein 1)仅仅作为实施该方法的一个例子，而不为限制该专利申请 的应用范围。该发明所提供的方法同样可以应用于其它抗真菌蛋白的活性改造。采用Ace-AMPl抗菌蛋白作为例子是因为该蛋白是目前所报道的植物抗真菌蛋 白中作用最强的蛋白之一。它是一种来自于洋葱种子的蛋白质，具有较为广谱的抗真菌 能力(Cammue et al.，1995)。实施例中所采用的几丁质结合域CBD。hiA是环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)几丁质酶chiA的几丁质结合域，已证明其对几丁质的结合性则很强 (ffatanabeet al. ，1994)。本发明中也仅仅采用CBD。hiA作为几丁质结合域的一个例子，并不局限于此结合 域，任何其它被证明具有几丁质结合能力的CBD同样可被应用于本发明中提到的方法。本 发明为提高抗真菌蛋白质的作用效率提供了重要方法，可以利用本发明中提到的方法改造 任何现有的抗菌蛋白质。
图1为按照本发明的方法构建所获得的几丁质结合域(CBD)与抗真菌蛋白质 (Ace-AMPl)的融合蛋白质的表达载体示意2为按照本发明的方法构建所获得的融合蛋白的表达以及纯化结果。列1表示 未加IPTG诱导的大肠杆菌总蛋白质；列2表示加IPTG诱导表达的大肠杆菌总蛋白质；列3 表示经镍柱纯化以及透析过后的CBD。hiA与Ace-AMPl的融合蛋白质TRX-CBD-Ace-AMPl。图3为按照本发明提供的方法所获得的融合蛋白的几丁质结合能力检测结果。 列1表示经IPTG诱导表达的含有改造过的融合蛋白质的大肠杆菌总蛋白质；列2-列7表 示缓冲液洗下的杂蛋白质；列8表示经过缓冲液洗涤后仍结合于几丁质珠上的CBD。hiA与 Ace-AMPl 的融合蛋白质 TRX-CBD-Ace-AMPl。图4与图5为按照本发明的方法所获得的融合蛋白与原蛋白质的对毛霉抑菌活性 比较的结果。“ TRX，，、“ TRX-Ace-AMP 1 ”及“ TRX-CBD-Ace-AMP 1，，分别表示载体所带的标签蛋 白质、改造前的抗菌蛋白质、改造后的CBD融合抗菌蛋白质。图4表示在不同浓度的三种蛋 白质存在下，104个/ml的毛霉孢子于25°C生长60h的情况。图5表示不同浓度的三种蛋 白质对毛霉于25°C生长60h孢子萌发的影响，OD405值越小，代表蛋白质的抑菌效果越好。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等所著《分子克隆实验指南》(New York =Cold Spring Harbor LabortatryPress, 1989)中所叙述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1几丁质结合域与抗真菌蛋白质融合基因的构建1.合成CBD。hiA片段(SEQ ID NO. 1，源于几丁质酶Al的几丁质结合域的编码核酸 序列，可编码氨基酸序列如SEQ ID而.2所示的多肽)，应注意本实验仅以080。1^片段为 例，所选取的几丁质结合域片段并不局限于此。设计引物CBDchiA-F与CBDchiA-R，在两端 分别引入限制性内切酶识别位点，PCR后得到带有限制性内切酶位点的片断(视即将选用 的载体而定，此实施例引入的酶切位点为BglII与KpnI)，引物序列见SEQ ID NO. 5。2.提取洋葱种子中总RNA，经反转录PCR后获得抗真菌蛋白质Ace-AMPl的cDNA 片段(SEQ ID NO. 3，一种源于洋葱种子的不含几丁质结合域的抗真菌蛋白质的编码核酸序 列，可编码氨基酸序列如SEQ ID N0. 4所示的多肽，Cammue等，1995)，应该注意到本实验仅 以Ace-AMPl的cDNA为例，所选取的抗真菌蛋白质并不局限于此。克隆时根据该片段设计 引物AceAMPl-F与AceAMPl-R，并在两端分别弓丨入限制性内切酶识别位点(视选用的载体而
5定，此实施例引入的酶切位点为NcoII与XhoI)，引物序列见SEQ ID NO. 5。3.将步骤2中扩增所得序列正向插入合适的表达载体(视具体的表达蛋白质而 定，此实施例选用的表达载体为pET-32a，但并不局限于此)，测序正确后，然后再插入步骤 1所获得的片断，得到CBD。hiA与Ace-AMPl的编码序列相融合的表达载体。构建所得的表达 载体如图1所示。实施例2融合抗真菌蛋白质的获得1.将实施例1获得的含CBD。hiA与Ace-AMPl的融合蛋白质表达载体转化基因工程 菌Origami (DE3)，应该注意到本实验仅以CBD。hiA作为几丁质结合域的代表，Ace-AMPl蛋白 作为抗真菌蛋白质的代表，而不用于限制本发明的应用范围。2.待转化菌落长出后，将平板上的菌落接种至300ml含有卡那霉素、氨苄青霉 素及四环素的LB液体培养基中，37°C振荡培养至OD6tltl = 0. 6-0. 8，加入终浓度0. 05mM的 IPTG，30 V培养4h或20 V培养过夜。3.将步骤2所得的大肠杆菌菌液离心去上清，菌体以IXPBS洗涤后重悬于 His-tag融合蛋白纯化所需的IX初始缓冲液，加入终浓度ImM的PMSF，超声破菌，离心后 取上清并以0. 45 μ m孔径滤膜过滤，滤过液使用镍柱进行纯化，纯化后蛋白对1 XPBS溶液 透析。将透析产物以0.22 μ m滤膜过滤除菌，得到纯化的CBD。hiA与Ace-AMPl的融合蛋白。 表达及纯化的结果如图2电泳所示。实施例3融合抗真菌蛋白质的几丁质结合能力测试1.依照实施例2中步骤1，2的方法表达融合蛋白质，应该注意到此处仅以CBD。hiA 的作为几丁质结合域的代表，Ace-AMPl蛋白作为抗真菌蛋白质的代表，而不用于限制本发 明的应用范围。2.将所得菌液离心后，以1 XPBS洗涤，重悬于几丁质结合所需的1 X结合缓冲液 中。加入终浓度为ImM的PMSF后超声破菌，离心后得到的上清蛋白质以0.45 μ m孔径的滤 膜过滤。加入几丁质珠与上清蛋白质温育lh，以大量缓冲液洗涤杂蛋白质多次，最后吸取少 量几丁质珠与2XSDS上样缓冲液混勻煮沸，进行电泳检测。电泳检测的结果如图3所示。实施例4改造过的融合蛋白质与原抗菌蛋白质抗毛霉孢子萌发能力的比较以下体系加样毛霉孢子悬液各2 μ 1+改造过的融合蛋白质、或原蛋白质或标签 蛋白质，使终浓度分别为0μ g/ml，10y g/ml，20y g/ml，50y g/ml，100y g/ml+马铃薯葡萄 糖液体培养基167 μ 1，利用IXPBS将每孔终体积补齐至200 μ 1，每种浓度于同一块板中作 三组重复。25°C培养，于60h后测量0D405。三种蛋白质对于植物病原真菌的抑制效果如图 4与图5所示。实验结果表明，标签蛋白质明显没有抗性，而实施例2中得到的融合抗真菌 蛋白抗毛霉孢子萌发的能力显著优于改造前的蛋白质。将几丁质结合域连接到抗真菌蛋白质的末端形成融合蛋白的方法，可赋予抗真菌 蛋白质靶向结合到真菌细胞壁的能力，从而使抗真菌蛋白质对真菌作用的有效浓度提高。 该技术可用于生物农药的生产上，或者用于利用转基因手段改造物种的抗病能力上。1. SEQ ID NO. 1 的信息(1)序列特征长153bp，线性单链核苷酸(2)分子类型核酸(3)序列及序列标记
61 121
ACAAATCCTGGTGTATCCGCTTGGCAGGTCAACACAGCTTATACTGCGGGACAATTGGTC CBDchiA-F
ACATATAACGGCAAGACGTATAAATGTTTGCAGCCCCACACCTCCTTGGCAGGATGGGAA CCATCCAACGTTCCTGCCTTGTGGCAGCTTCAA
CBDchiA-R
注核苷酸序列位点在左侧加以标识，序列起始点定为+1。CBDchiA-F, CBDchiA-R
指PCR扩增CBD。hiA用到的引物(F-正向；R-反向)
2.SEQ ID NO. 2 的信息
(1)序列特征长为53残基的单链线性多肽
(2)分子类型多肽
(3)序列及序列标记
TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQ
3.SEQ ID NO. 3 的信息
(1)序列特征长279bp，线性单链核苷酸
(2)分子类型核酸
(3)序列及序列标记
1 CAGAACATATGCCCAAGGGTTAATCGAATTGTGACACCCTGTGTGGCCTACGGACTCGGA
AceAMPl-F
61 AGGGCACCAATCGCCCCATGCTGCAGAGCCCTGAACGATCTACGGTTTGTGAATACTAGA AACCTACGACGTGCTGCATGCCGCTGCCTCGTAGGGGTAGTGAACCGGAACCCCGGTCTG AGACGAAACCCTAGATTTCAGAACATTCCTCGTGATTGTCGCAACACCTTTGTTCGTCCC TTCTGGTGGCGTCCAAGAATTCAATGCGGCAGGATTAAC
121 181 241
AceAMPl-R
注核苷酸序列位点在左侧加以标识，序列起始点定为+1。AceAMPl-F,AceAMPl-R 指反式PCR获得Ace-AMPl的cDNA片段中用到的引物(F-正向；R-反向)。4. SEQ ID NO. 4 的信息(1)序列特征长为93残基的单链线性多肽(2)分子类型多肽(3)序列及序列标记QNICPRVNRIVTPCVAYGLGRAPIAPCCRALNDLRFVNTRNLRRAACRCLVGVVNRNPGLRRNPRFQNI PRDCRNTFVRPFffffRPRIQCGRIN5. SEQ ID NO.的信息
权利要求
一种用于改造抗真菌蛋白质的方法，其特征在于将具有真菌结合能力的几丁质结合域与抗菌蛋白质相连，使原抗菌蛋白质带有几丁质结合域；具体步骤如下(1)通过PCR手段，得到抗真菌蛋白质的开放阅读框序列，克隆到适当的表达载体中，然后将几丁质结合域的编码序列再次插入到该载体中，与抗真菌蛋白质的读码框相融合，间隔适当核苷酸以保证酶切位点及阅读框的正确；(2)将步骤(1)中的表达载体转入大肠杆菌，得到的基因工程菌接种于LB液体培养基中，培养到对数生长期后以IPTG诱导蛋白质的表达，然后超声破菌，获得总的菌体蛋白质；(3)利用载体所带的蛋白质表达标签的亲和介质纯化步骤(2)所得蛋白质，透析，获得纯化的带有几丁质结合域的抗真菌蛋白质。
2.—种将CBD域融合到目标蛋白质的末端的方法，其特征在于将编码CBD域的核苷酸 序列连接到编码抗真菌蛋白质的核苷酸序列的N末端或C末端，使两者的读码框一致，从而 表达出融合蛋白。
3.—种如权利要求2所得到的改造过的抗真菌蛋白质的编码序列插入到蛋白质表达 载体，转入基因工程菌所生产的抗真菌蛋白质。全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体为一种用于改造抗真菌蛋白质的方法。本发明包括将编码几丁质结合域的DNA序列与编码抗真菌蛋白质的cDNA序列以正确读码框连接，然后克隆到蛋白质表达载体中，使用工程菌对融合蛋白质进行表达，进一步利用商业化介质进行蛋白质纯化。还包括纯化后的蛋白质的几丁质结合能力的检测以及抗真菌活性分析。本发明可提高抗真菌蛋白质的抗菌效率。应用本发明可以改造现有抗真菌蛋白质的活性，提高它们对真菌细胞壁的靶向结合能力。
文档编号C12N15/62GK101921792SQ20101017559
公开日2010年12月22日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者何玥, 吴殷, 葛晓春 申请人:复旦大学