专利名称：：一种具有抗真菌活性的海洋放线菌及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及海洋微生物的应用及动植物，菌病害的防治，具体地说是~^禾中具有抗白色念珠菌(Ca(i/(iaa/6/c"mO、禾当瘟霉病菌(i^yWcMAar/a和尖孢镰刀菌(Fw"n'Mwowon^)等致病真菌的海洋微生物。
背景技术：
：稻瘟病又称稻热病、掐脖瘟，是世界各水稻产区的重要病害。稻瘟病在我国南北稻区均有发生，被列为水稻三大病害之首。此病流行年份一般减产10%20%，严重的50%，甚至80%以上。稻瘟霉病菌是稻瘟病的致病菌，上世纪五六十年代使用化学药剂防治稻瘟病使得水稻和人类都受到了很大的伤害，从七十年代开始人们开始采用绿色的生物农药防治稻瘟病，取得了不错的成果。但是稻瘟霉病菌耐药性的出现使得科学家们不得不开始寻找新的生物农药。尖孢镰刀菌在真菌分类上属于半知菌亚门尖镰孢属。它以产生的大量絮状菌丝危害寄主。植物致病尖孢镰刀菌在生长过程中可产生毒素，毒素在植物体内可以扩散或转移，并参与呼吸、光合等代谢作用，是导致植物枯萎的主要物质。尖孢镰刀菌引起的枯萎病是黄瓜的重要病害之一。白色念珠菌是一种条件致病性酵母菌，可存在于正常人的口腔黏膜、胃肠道、肛门、阴道、皮肤等部位。当机体营养不良、维生素缺乏、长期接触免疫抑制剂及抗菌药物时，或对于年老体弱、AIDS、癌症及长期带假牙的患者，白色念珠菌感染机率增高。治疗白色念珠菌感染常用的是唑类抗真菌药，如氟康唑(FCZ),这类药物可口服给药，副作用小、溶解度高、毒性低及组织分布广泛，对多数病原性白色念珠菌有广谱杀菌作用。但是随着唑类药物的广泛应用，真菌耐药性也越来越严重，临床治疗复发甚至失败的病例大量增多。另外，作为一种抗真菌研究中的模式菌株，对白色念珠菌的抗性作用可以作为评价对真菌抗性的有效指标。因此，寻找新型有效的抗真菌物质，是农学和医学领域迫切需要解决的问题。'
发明内容本发明的目的是提供一种具有抗真菌活性的海洋放线菌及其应用，其发酵液具有较强抗致病真菌作用，其发酵液还对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有很好的抗菌活性。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种具有抗真菌活性的海洋放线菌，系从我国黄渤海大连海域采集的繁茂膜海绵样品中分离得到，现保存于国家知识产权局指定的保藏单位，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址武汉珞珈山，武汉大学内，邮政编码430072;保藏日期为2007年4月13日；保藏编号CCTCCNO:M207046。该菌命名为灰色链霉菌6^印towyc^gr/w"5Hmp-S19。本发明所述的海洋放线菌在大多数培养基上生长良好，于高氏合成一号琼脂生长时，气生菌丝灰白色，分枝较多；基内菌丝呈淡火岩棕色，不断裂、无横隔、不生孢、无孢囊，孢子丝发育良好，直或波曲，成丛状。该菌具有一定的需盐性和耐盐性在没有NaCl的培养基上气丝生长微弱，可溶性色素颜色较深，在NaCl含量为1%—7%的培养基上生长均生长良好，在NaCl含量为9X的培养基上只生长基丝，气丝不生长，无可溶性色素。明胶液化、牛奶凝固、牛奶胨化、硝酸还原、淀粉水解、革兰氏染色均呈阳性；硫化氢产生、纤维素分解、酪氨酸酶产生均呈阴性。好氧生长；在PH为6.0-11.0环境中均可良好生长，PH<5.0则完全不能生长；能利用阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、棉子糖、甘露醇、麦芽糖、果糖、蔗糖、木糖；细胞壁含L-DAP，全细胞水解物不含特征糖，细胞壁属于I型。本发明所述的海洋放线菌发酵液抗菌活性以管碟发测定。本发明所述的海洋放线菌，其发酵液对白色念珠菌(Omtfe/afl/Wc^w)、稻瘟霉病菌(尸".cw/a"'a禾卩尖孢嫌刀菌(Fwar/謂oxjAspw画)具有较强的抗性作用，对细菌枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌也有很好的抗性作用。本发明所述的海洋放线菌发酵液中抗菌物质在中性偏酸及PH<10的偏碱性条件下都较为稳定，对热较为稳定，甚至在50'C处理20分钟后仍保留大部分抗菌活性。本发明所述的海洋放线菌发酵液经昆明种小鼠急性经口毒性实验和大耳白兔皮肤刺激实验证实为对哺乳动物无毒无刺激。本发明所述的海洋放线菌发酵液具有较强的抗真菌活性，并对致病细菌也具有很好的抗性效果，且药效持久、稳定、无毒，具备从中开发出新型、高效、无毒的天然农用及医用药物的巨大潜力。图l为本发明所述的海洋放线菌在高氏一号固体培养基上的电镜照片。图2为本发明所述的海洋放线菌的发酵!夜抗真菌活性结果A为抗白色念珠菌(Ca"c/油fl/Z)/c""《)结果，B为抗禾自瘤雾病菌(尸jr/cw/譜'fl结果，C为抗尖孢镰刀菌(Fwahwwax^porMW)结果。图3为本发明所述的海洋放线菌和部分相关菌株依据16SrRNA基因序列构建的系统发育树。具体实施例方式实施例l我国黄渤海大连海域采集的繁茂膜海绵样品，在实验室中按下列条件培养，即可活得本发明所述的海洋放线菌本发明所述的海洋放线菌是依据其形态学特征、细胞壁化学组分及16SrRNA基因序列的系统进化分析，该菌的16SrRNA基因全序列如下其具有序列表SEQIDNo:l中的碱基序列。SEQIDNo:l:400450500550600650700750800NTAACTAAGAATG(1)SEQIDNo:l的信息(参见序列表)(a)序列特征812碱基对*长度承双链*拓扑结构线性(b)分子类型DNA(C)假设否(d)反义否(e)最初来源菌株/SVr，画ycasHmp-S19;参照文献阎逊初，放线菌的分离与鉴定[M],北京，科学出版社，1992;进行鉴定，结果如表l-3所示；表1为本发明所述的海洋放线菌的培养特征'菌^pt生菌丝基内菌丝孢子丝Hmp-S19分枝较多无横隔，不断裂不生孢，无孢囊直或柔曲，成丛状性;表2为本发明所述的海洋放线菌的生理生化特征十为阳性；一为阴+/—为可疑。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3为本发明所述的海洋放线菌的碳源利用情况+为生长；一为不生长<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本发明所述的海洋放线菌培养及发酵条件(一)斜面培养条件改良高氏一号培养基于水溶液中，按重量体积比加入，可溶性淀粉1%，蔗糖0.5%，甘露醇0.5%，KN030.1%,K2HPO40.5%，MgSO47H2O0.5%，FeSO47H2O0.01%，NaCl2%，琼脂2%;pH7.07.5，121°C，0.1MPa蒸气灭菌30min;培养温度28°C;培养时间为4天。(二)种子培养条件种子培养基于水溶液中，按重量体积比加入，玉米粉1%，豆饼粉1%，KH2PO40.1%，CaCO30.1%;pH7.0，121°C，O.lMPa蒸气灭菌30min;取新鲜菌种斜面一支，将菌种从斜面转移至装有无菌水及玻璃珠的摇瓶中，28t:振荡30min，制备成均匀的菌悬液，接入种子液中，28。C摇瓶培养36小时。(三)发酵培养条件发酵培养基于水溶液中，按重量体积比加入，玉米粉1%，豆饼粉1%，KH2PO40.1%，CaCO30.1%;pH7.0，121°C，O.lMPa蒸气灭菌30min;将培养好的种子培养物以10%接种量，接种于发酵培养基，28'C摇瓶培养72小时，得到发酵液。本发明所述的海洋放线菌产生的发酵液经5000rpm离心3min，取上清液，即得到具有抗真菌活性的发酵液。实施例2本发明所述的海洋放线菌产生的发酵液抗菌活性分析将指示菌的菌悬液，涂布在合适的培养基上(白色念珠菌涂布在沙氏培养基上、稻瘟霉病菌和尖孢镰刀菌点接在土豆培养基上、细菌涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上)，放置牛津杯。本发明所述的海洋放线菌产生的发酵液经5000rpm离心3min，取上清液290W滴加在牛津杯中，适宜温度培养(细菌在37。C培养、真菌在28°。培养)，观察抑菌圈的大小。如图2所示，A.为抗白色念珠菌(C朋AWfla/Wo7似)结果，B为抗稻瘟霉病菌(i>/cw/an'a07z"e)结果，C为抗尖孢镰刀菌(Fwa,女max_y，w)结果o实施例3本发明所述的海洋放线菌发酵液抗真菌物质的稳定性分析分别以lmol/L的HCl和NaOH将本发明所述的灰色链霉菌产生的发酵滤液分别调至pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0后分别置于室温处理lh，30°C、4(TC、5(TC处理20min，以白色念珠菌为指示菌测定抑菌活性，分别以相同pH的缓冲液作为对照。(pH2.0-8.0采用磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲液，pH9.0-10.0采用甘氨酸——氢氧化钠缓冲液)。如表4所示，数值为抑菌圈直径(单位mm)，l为室温(25°C)处理1小时；2为3(TC处理20分钟；3为4(TC处理20分钟；4为5(TC处理20分钟；5为对照(相对应的pH缓冲液对照组)表4为本发明所述的海洋放线菌的发酵液抗真菌活性物质的稳定性实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例4本发明所述的海洋放线菌发酵液对哺乳动物的毒性分析(辽宁省疾病预防控制中心协助测定)毒性试验按GB15670-1995《农药登记毒理学试验方法》规定的实验方法进行。选用中国医科大学实验动物中心繁殖的普通级昆明种小鼠雌雄各10只，均以管词法对各组动物进行一次染毒。试验前禁食16h(过夜)，不禁水，剂量为5000mg/kg体重(灌胃容量为0.4ml/20g体重)。灌胃后观察14天，试验期间动物无异常反应，食欲正常，体重略有增加，无死亡，尸检未见异常改变。结果表明，本发明所述的灰色链霉菌菌体及发酵液对雌雄小鼠急性经口毒性LD5()>5000mg/kg，按照GB15670—1995我国农药急性经口毒性分级标准，属实际无毒。选用沈阳市于洪区动物实验饲料厂提供的大耳白兔进行皮肤刺激实验，涂药后lh、24h、48h检查家兔皮肤反应，动物试验部位和对照部位均未见有红斑和水肿形成。按照GB15670—1995对农药皮肤刺激性标准，本发明所述的海洋放线菌菌体及发酵液对家兔皮肤无剌激性。SEQUENCELISTING〈110〉中国科学院沈阳应用生态研究所<120〉一种具有抗真菌活性的海洋放线菌及其应用<130><160>1<170〉Pateiitlnversion3.1<210〉1〈211〉812〈212〉DNA〈213〉菌株Mycobacteri咖sp.SN12<220〉<221〉rRNA<222〉(736,761，767,769，784,792，800)<223〉n-a或g或c或t〈220〉<221〉rRNA<222〉(1〉..(812)<223><400〉1gtgcttaacacatgcaagtcgaacgatgaaccgctttcgggcggggatta''gtggcgaacg60ggtg3gt雄acgtgggcaatctgccctgcactctgggac幼gccctggaaacggggtct120aataccggatstgaccgtctgccgC3tggtggatggtgtaaagctccggcggtgC鄉3t180g邓cccgcggcctatcagcttgttggtgaggtagtggctcaccaaggcgacgacgggtag240ccggcctg叫agggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacggga300ggC3gC3gtgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagg360gatgacggccttcgggUgtaaacctctttcagcagggaigaagcgaaagtgacggtacct420cgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaat3Cgtagggcgcaagcg480ttgtccggaattaUgggcgt犯柳gctcgtaggcggcttgtCELCgtCggttgtgaaag540cccggggcttaaccccgggtctgcagtcgatacgggcaggctagagttcggtagggg卿600<image>imageseeoriginaldocumentpage10</image>权利要求1.一种具有抗真菌活性的海洋放线菌，该菌是灰色链霉菌属的菌株，于2007年4月13日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号CCTCCNOM207046，鉴别特征命名为StreptomycesgriseusHmp-S19。2.—种权利要求l所述的海洋放线菌的应用，其特征在于所述菌株5^ptowj;c"gn'^MHmp-S19的发酵液可用于抗白色念珠菌稻瘟霉病菌和/或尖孢镰刀菌的药物中，其具有抗致病真菌的活性。3.根据权利要求2所述海洋放线菌的应用，其特征在于所述菌株Sw;tow;^"y^^Hmp-S19的发酵条件为，于发酵培养基中按体积接种量710%接种菌株，28°C，培养4872小时；所述发酵培养基配方为每升水中，玉米粉515g，豆饼粉515g，磷酸二氢钾0.51.5g，碳酸钙0.51.5g，pH7.0。全文摘要本发明涉及海洋微生物的应用及动植物真菌病害的防治，具体地说是一种具有抗真菌活性的海洋放线菌及其应用，该菌是灰色链霉菌属的菌株，于2007年4月13日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号CCTCCNOM207046，鉴别特征命名为StreptomycesgriseusHmp-S19。本发明菌株的发酵液具有抗白色念珠菌(Candidaalbicans)、稻瘟霉病菌(Pyriculariaoryzae)和尖孢镰刀菌(Fuariumoxysporum)等致病真菌的作用，效果稳且持久，具有从中开发出新型、高效、无毒天然农用及医用药物的巨大潜力。文档编号C12N1/20GK101423805SQ20071015790公开日2009年5月6日申请日期2007年11月2日优先权日2007年11月2日发明者丽刘,王书锦,胡江春,薛德林,马成新申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所