专利名称：含CpG基序的核酸序列的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含CpG基序的核酸序列的制备方法及应用，涉及分子生物学领域 及动物免疫学领域。
背景技术：
新型免疫佐剂是现代免疫学的研究热点之一。近年来，大量研究显示细菌DNA中 存在的结构特征为5'嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶3'的非甲基化CpG 二核苷酸序列 (即CpG基序)，能激活多种畜禽的免疫系统，活化B淋巴细胞、巨噬细胞(ΜΦ)、树突状细 胞(DC)、自然杀伤细胞(NK)等免疫细胞，诱导天然免疫应答，分泌IL-I β、IL-12、TNF-α、 IFN-α ,IFN-Y等多种Thl型为主的细胞因子，被认为是最具潜力的新型免疫佐剂之一。体 内外试验表明，人工合成的含CpG基序的脱氧寡核苷酸与细菌DNA中非甲基化的CpG序列 一样，具有强烈的免疫刺激活性，作为蛋白质抗原或DNA疫苗的佐剂都具有显著的免疫增 强效果。此外，CpG寡核苷酸还可以促进其他佐剂的协同作用，弥补Th2类型免疫应答的缺 点，调节Thl和Th2型免疫应答的平衡，如把CpG寡核苷酸与氢氧化铝或弗氏佐剂等联用， 先诱导出混合型的Thl和Th2型应答，然后转向Thl类型。实验证明，相对于弗氏完全佐剂 或弗氏不完全佐剂、氢氧化铝等，CpG寡核苷酸可诱导更强的免疫应答，而且副作用也相对 较小。与CT(霍乱毒素)相比，CpG寡核苷酸还具有用量少、安全性高等特点，是黏膜疫苗 佐剂的理想选择。目前，常规疫苗在使用过程中出现的抗体水平较低、保护时间较短等造成的免疫 失败，促使人们寻找新的、高效的佐剂来提高疫苗的保护力。佐剂的研制与优化直接关系到 疫苗产业的发展。在国内外多采用人工合成且进行硫代修饰的CpG寡核苷酸或从其他低等 生物中提取含CpG基序的基因组DNA作为新型疫苗佐剂，证明具有较好的免疫增强效果，具 有替代传统佐剂的优势。但存在的问题是，人工合成的CpG寡核苷酸很容易降解，而硫代修 饰的序列费用昂贵，无法被生产接受；而低等生物的基因组DNA虽含有未甲基化的CpG基 序，但有可能引入有害基因或物质到机体内，盲目性较大。如何低成本、大规模地制备CpG 核酸佐剂，是实现CpG核酸佐剂在兽医临床推广应用的关键环节之一。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种含CpG基序的核酸序列的制备方 法，以应用于廉价、高效、安全的疫苗佐剂。本发明提供一种含CpG基序的核酸序列的制备方法，包括下列步骤(1)重组质粒pMD18-T-Bl的构建将B序列克隆入pMD18_T载体中，构建重组质 粒pMD18-T-Bl ；所述B序列如SEQ ID NO 1所示；(2)重组质粒pMD18-T-B12的构建以重组质粒pMD18-T_Bl为模板，以PI、P2为 引物进行PCR扩增，获得基因片段Bl ；用限制性内切酶EcoR I和Kpn I分别双酶切基因片 段Bl和质粒载体pMD18-T-Bl，然后连接，构建重组质粒pMD18-T-B12 ；
所述Pl 序列为 TACGAATTCGTTCCTGACGTTGGTG，所述P2 序列为 CATGGTACCACGCTAACGTCTAGCC ；(3)重组质粒pMD18-T-B123的构建以pMD18_T_B12为模板，以P3、P4为引物进行 PCR扩增，获得基因序列B2 ；用限制性内切酶Kpn I和Xba I分别双酶切B2和pMD18_T_B12， 然后连接，构建重组质粒PMD18-T-B123 ；所述 P3 序列为 TATGGTACCGTTCCTGACGTTGGTG，所述P4 序列为 CACTCTAGAACGCTAACGTCTAGCC ；(4)重组质粒pMD18-T-3B的构建以pMD18-T_B123为模板，以P5、P6为引物 进行PCR扩增，获得基因序列3B，将该序列直接与pMD-18-T载体连接，构建重组质粒 PMD18-T-3B ；所述P5 序列为 CGAATATTCTCGAGGGATCCTTCGTTCCTG，所述P6 序列为 CGCACATGTAGATCTCGATTACGCTAACGT ；(5)重组质粒pMD18-T-6B的构建用限制性内切酶BamH I和Bgl II双酶切 PMD18-T-3B得到3B片段；用Bgl II单酶切质粒pMD18_T_3B，去磷酸化后与3B片段连接， 构建重组质粒PMD18-T-6B ；(6)重组质粒pSP-6B的构建用限制性内切酶Ssp I和Pci I双酶切质粒 PMD18-T-6B，回收约1700bp的载体片段和约900bp的6B基因片段，将所述两片段连接后得 到重组质粒PSP-6B ；(7)以重组质粒pSP-6B为模板，用3’端硫代修饰的随机序列 5’-NpNpNpNpSNpSN-3’为引物，利用滚环扩增方法制备所述含CpG基序的核酸序列；所述3’ 端硫代修饰的随机序列中N表示A、T、C或G，ρ表示磷酸二酯键，s表示硫代修饰。本发明还提供按照上述方法制备获得的含CpG基序的核酸序列在猪或鸡的疫苗 方面的应用。本发明含CpG基序的核酸序列作为佐剂具有较强的免疫增强作用，其制备方法能 够大规模生产所述序列而且成本低廉。本发明根据CpG序列的种属特异性，设计对鸡、猪和小鼠具有免疫刺激活性的含 CpG基序的核酸序列，利用双酶切和同尾酶连接的方法构建富含CpG基序的重组质粒，并以 此重组质粒为模板，通过滚环扩增的方法高效制备含CpG基序的核酸序列。结果表明滚环 扩增得到的含CpG基序的核酸序列浓度可达到1. 8mg/ml左右，其成本比人工合成低得多， 且反应条件简单，能够实现规模化放大生产。同时，本发明构建的富含CpG基序的重组质 粒，可以通过生物发酵的方法大量扩增生产，进一步降低了后续滚环扩增所需的模板的成 本。本发明所采用的滚环扩增方法是一种新颖的恒温核酸扩增方法。与传统的PCR技 术相比，具有以下优点(1)操作简单，无需特异引物，可在半个小时左右对模板序列进行 扩增；(2)反应所使用的phi29DNA聚合酶性能稳定，可以持续几个小时高效地催化DNA的 合成，扩增效率高；⑶整个反应都是在30°C恒温条件下进行，因此，不需要PCR仪等昂贵的 仪器设备，成本低廉，能够适应大规模生产制备的需要。本发明制备的含CpG基序的核酸序列作为佐剂，配合鸡、猪的疫苗应用时，均能有 效提高机体的抗体水平。具体地，(1)以小鼠为实验动物，将本发明制备的含CpG基序的核酸序列与禽流感灭活抗原联用，能使抗体滴度在较短时间达到峰值，并能使其在高水平 维持较长时间；含CpG基序的核酸序列与白油佐剂联合使用时，免疫小鼠的淋巴细胞增殖 能力比单独使用白油佐剂显著增强；(2)以雏鸡为实验动物，将制备的含CpG基序的核酸序 列与新城疫灭活抗原联用，能有效降低新城疫疫苗的抗原剂量，而不减弱其免疫保护效果； (3)以仔猪为实验动物，将制备的含CpG基序的核酸序列与猪瘟弱毒疫苗联用，能有效提高 抗体转阳率和抗体滴度，提供有效的免疫保护。另外需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其他具有 实质性特点的方面和创造性的有益效果对本领域的普通技术人员来说是可以直接推知的。
图1-1 图1-3为目的片段PCR扩增产物的电泳图谱，其中图1_1为基因片段Bl 的电泳图谱，图1-2为基因片段B2的电泳图谱，图1-3为基因片段3B的电泳图谱；上述各图中的标记表示为1-基因片段附，2-基因片段82，3_基因片段38， M-DL2000Markero图2-1 图2-5是重组质粒的酶切鉴定电泳图谱；图中的各标记表示为1_用EcoR I和Hind III双酶切重组质粒pMD18_T_B12获 得的产物，2-用EcoR I和Hiind III双酶切重组质粒pMD18_T_B123获得的产物，3-用BamH I和Bgl II双酶切重组质粒PMD18-T-3B获得的产物，4-用Xho I和Bgl II双酶切重组 质粒pMD18-T-6B获得的产物，5-用Xho I和Bgl II双酶切重组质粒pSP_6B获得的产物， M-DL2000Markero图3是滚环扩增产物电泳图谱；图中各标记表示为Ml-DL15000Marker，M2_DL2000Marker，1、3_ 滚环扩增 6h 产 物，2、4_滚环扩增8h产物。图4表示不同佐剂对禽流感抗体效价的影响；图中各符号为 -A组，■ -B组，▲ -C组。图5雏鸡免疫后新城疫抗体效价变化；图中各符号为 -A组，■ -B组，▲ -C组，X-D组，-E组，*_F组，+-G组。
具体实施例方式下面通过实施例进一步理解本发明。这些实施例只是用来说明本发明，而不应解 释为对本发明的限制。在如下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，例 如感受态细胞的制备等。在如下实施例中，所用的限制性内切酶、碱性磷酸酶、连接酶、载 体、缓冲液、试剂盒等，如无特殊说明，均为宝生物工程(大连)有限公司产品。实施例1含CpG基序的核酸序列的制备1.B序列的设计与合成根据CpG序列的种属特异性，设计对鸡、猪和小鼠具有免疫刺激活性的B序列 5’ -GTTCCTGACGTTGGTGCATCGATGCAGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGGGGGTCGTCGTTTTGT CGTTTTGTCGTTGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGGGGGGCTAGACGTTAGCGT-3，，共 137bp，由宝生物工程(大连)有限公司合成。 2.含CpG基序的核酸序列的制备人工合成两端分别带有酶切位点和保护性碱基 的六条引物，序列如下
权利要求
一种含CpG基序的核酸序列的制备方法，包括下列步骤(1)重组质粒pMD18 T B1的构建将B序列克隆入pMD18 T载体中，构建重组质粒pMD18 T B1；所述B序列如SEQ ID NO1所示；(2)重组质粒pMD18 T B12的构建以重组质粒pMD18 T B1为模板，以P1、P2为引物进行PCR扩增，获得基因片段B1；用限制性内切酶EcoR I和Kpn I分别双酶切基因片段B1和质粒载体pMD18 T B1，然后连接，构建重组质粒pMD18 T B12；所述P1序列为TACGAATTCGTTCCTGACGTTGGTG，所述P2序列为CATGGTACCACGCTAACGTCTAGCC；(3)重组质粒pMD18 T B123的构建以pMD18 T B12为模板，以P3、P4为引物进行PCR扩增，获得基因序列B2；用限制性内切酶Kpn I和Xba I分别双酶切B2和pMD18 T B12，然后连接，构建重组质粒pMD18 T B123；所述P3序列为TATGGTACCGTTCCTGACGTTGGTG，所述P4序列为CACTCTAGAACGCTAACGTCTAGCC；(4)重组质粒pMD18 T 3B的构建以pMD18 T B123为模板，以P5、P6为引物进行PCR扩增，获得基因序列3B，将该序列直接与pMD 18 T载体连接，构建重组质粒pMD18 T 3B；所述P5序列为CGAATATTCTCGAGGGATCCTTCGTTCCTG，所述P6序列为CGCACATGTAGATCTCGATTACGCTAACGT；(5)重组质粒pMD18 T 6B的构建用限制性内切酶BamH I和Bgl II双酶切pMD18 T 3B得到3B片段；用Bgl II单酶切质粒pMD18 T 3B，去磷酸化后与3B片段连接，构建重组质粒pMD18 T 6B；(6)重组质粒pSP 6B的构建用限制性内切酶Ssp I和Pci I双酶切质粒pMD18 T 6B，回收约1700bp的载体片段和约900bp的6B基因片段，将所述两片段连接后得到重组质粒pSP 6B；(7)以重组质粒pSP 6B为模板，用3’端硫代修饰的随机序列5’ NpNpNpNpsNpsN 3’为引物，利用滚环扩增方法制得含CpG基序的核酸序列；所述3’端硫代修饰的随机序列中N表示A、T、C或G，p表示磷酸二酯键，s表示硫代修饰。
全文摘要
本发明涉及一种含CpG基序的核酸序列的制备方法及应用，涉及分子生物学领域及动物免疫学领域。所述核酸序列的制备方法为构建重组质粒pMD18-T-B1、重组质粒pMD18-T-B12、重组质粒pMD18-T-B1、重组质粒pMD18-T-B123、重组质粒pMD18-T-3B、重组质粒pMD18-T-6B、重组质粒pSP-6B；以重组质粒pSP-6B为模板，用3’端硫代修饰的随机序列5’-NpNpNpNpsNpsN-3’为引物，利用滚环扩增方法制备所述含CpG基序的核酸序列。本发明含CpG基序的核酸序列作为佐剂具有较强的免疫增强作用，其制备方法能够大规模生产所述序列而且成本低廉。
文档编号C12N15/10GK101979542SQ201010522899
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月28日 优先权日2010年10月28日
发明者侯继波, 卢宇, 吕芳, 张金秋, 徐海, 邓碧华 申请人:国家兽用生物制品工程技术研究中心