专利名称：一种基因工程氧化葡萄糖杆菌及其制备方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明属于工业微生物领域，涉及一种维生素C生产相关菌株及其基因工程菌的制备方法及用途。
背景技术：
转座系统在当代遗传学和分子生物学研究中有很大的应用价值，它不仅能作为反向遗传学的工具，将外源基因转入受体基因组而使受体产生表型的变化，同时，其又因为随机的插入突变使内源基因失活而成为正向遗传学研究中的新宠。转座子是一种基因组上的可移动的遗传元件，它可以从遗传物质的一部分跳跃到另一部分，从而引起遗传变异。20世纪50年代初期，美国遗传育种学家McClintock首先在对玉米色斑不稳定现象的研究中发现了转座现象，发现了可从染色体的一个位置跳到另一个位置，乃至从一条染色体跳到另一染色体上的特殊基因。在随后的研究中人们在细菌和果蝇中也发现了此现象的存在，于是转座子开始引起了足够重视。在结构上，转座子具有共同特征，即两端是重复序列，有转座酶的识别位点，中间是结构基因，编码转座酶和另外一些蛋白质。围绕转座子在基因组中引入变异，利用其可移动的特性制备了许多包含转座子的人工载体，发展了很多基于转座子的分子生物学研究方法。Tn5属于复合转座子，最早是在hcherichia coli中被发现的，序列全长5818bp， 由编码三个抗生素(新霉素、博莱霉素、链霉素)的核心序列和两条倒置的IS50序列组成 (IS50属于IS4家族)。IS50R和IS50L高度同源，只是IS50L的第1442碱基处存在一个赭石突变。IS50具有19bp的倒置末端(外末端OE和内末端IE)，两倒置末端有7个碱基不相同。此倒置末端是转座酶(Tnp)的作用位点。IS50R编码53-Kda的Τηρ，还编码一个 48-Kda的转座阻遏蛋白anh)。Inh和Tnp使用同一阅读框，但启动子不同。Inh比Tnp少了 N端的55个氨基酸。由于IS50L上的赭石突变，翻译提前终止，不能产生有活性的Inh 禾口 Tnp0利用转座子Tn5及其衍生物对原核生物进行转座诱变，已广泛用于基因的鉴定、 定位、定向和克隆。Τη5能够在许多革兰氏阴性细菌基因组中进行随机、单位点的插入，可以用Τη5末端序列设计引物进行PCR扩增插入位点的侧翼序列，或直接进行测序等。突变体通常指某个形状发生可遗传变异的材料，或某个基因发生突变的材料。长期以来，育种专家致力于发现和分离有价值的自然突变和变异材料。自20世纪70年代以来，Y射线和EMS理化诱变手段在遗传育种方面开始应用，创制人工突变体。此后随着转座子标签等插入突变方法的发展，大大加快创制突变体的步伐。传统的菌种改良通常是通过各种物理化学的方法如紫外线、60Co、EMS以及NTG等对生产菌进行诱变育种。然而，此类诱变方法正突变率较低，菌种本身也因多次诱变而抗性增强，使得菌种的发酵水平难以进一步提高。另外这类方法虽然简便，但由于突变带有一定的盲目性、容易造成突变点以外的染色体损伤、突变位置不清楚等原因，使其应用受到很大限制，尤其是对于多基因控制的性状、功能，用传统的方法很难得到较全的突变体，而且即使得到了突变体，因为不知道突变位置，使后续操作非常困难。维生素C生产中所采用的菌种已经运用传统育种方法进行了多年的诱变筛选， 菌种性状提升的空间已经相对较小。基于现代菌种选育的理念，应用转座子Tn5，建立生产菌株的随机突变体库，通过随机突变的方法提高菌种的诱变效率，更高效的获得了性状优良的生产菌株。并且由于可以对突变定位，因此可以对发生突变的基因进行进一步的研究， 将改良菌株进一步优化。2-KGA (2-酮基-L-古龙酸)是L-抗坏血酸(维生素C)的重要前体，已知有多种微生物能够将L-山梨糖转化为2-KGA (2-酮基-L-古龙酸)，如美国专利3907639公开了属于醋菌属、假单孢菌、沙雷氏杆菌、葡萄状球菌、气杆菌、产碱杆菌、青霉菌、假丝酵母以及葡萄糖酸菌的微生物具有上述转化活性。因此，提高现有技术中D-山梨醇转化为L-山梨糖的效率是需要本领域技术人员着力解决的问题。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种基因工程氧化葡萄糖杆菌(GluconcAacter oxydans WelcomeI (090319-15))，该菌株已于2010年9月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国.武汉.武汉大学)，保藏编号是CCTCC NO :M2010224。本发明的另一个目的在于提供一种基因工程氧化葡萄糖杆菌(GluconcAacter oxydans WelcomeI (090319-15)) CCTCC NO :M2010224 的制备方法，包括将 Tn5 转座子导入氧化葡萄糖杆菌的基因组中，构建突变体库，以及在所构建的突变体库中筛选基因工程菌。本发明还涉及基因工程氧化葡萄糖杆菌(GluconcAacter oxydans WelcomeI (090319-15)) CCTCC NO :M2010224在D-山梨醇转化为L-山梨糖中的用途，以及所述基因工程氧化葡萄糖杆菌在维生素C发酵生产中的用途。本发明详述如下1、菌株及培养本技术方案采用的出发菌株为维生素C生产菌株之一——氧化葡萄糖杆菌 (Gluconobacteria oxydans Welcome I)，该菌株已于2009年12月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC NO :M209305。2、利用常规的种子培养基培养上述氧化葡萄糖杆菌。3、利用转座子和转座子标签法构建氧化葡萄糖杆菌饱和突变体库。本技术方案采用的转座子标签为Tn5-Kan，它保留了 Tn5转座子的19bp的末端倒置序列，并加入了 Kan抗性标记。也可根据特定菌的性质，更换筛选标记或报道基因。Tn5 转座子标签结构简单，属于随机性的转座子标签，可能是细菌基因功能研究中应用最广泛的一种标签，适用于大规模构建突变体、探寻功能基因。按照本领域技术人员熟悉的分子生物学技术，扩增转座子标签，采用适当的限制性内切酶切割含有筛选标记和转座酶的片段， 转化氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacteria oxydans Welcome I)。根据公式 P= 1-(1-(L/C) cf可以预测构建饱和突变体库所需的克隆数，P是发现任意一个基因插入突变的概率，L代表基因的平均长度，C是单倍体基因组的大小，η是插入突变的克隆数，f是每个克隆平均插入位点数。计算预测的克隆数在实际克隆数，利用转座子标签方法获得了预期的克隆数。 根据特定的表型分离转化子，PCR方法分析基因组的分子特征。
利用电转化方法将Tn5转座子导入氧化葡萄糖杆菌OnuconcAacteria oxydans Welcome I)中，并通过抗性筛选，得到饱和突变体库。本发明可以进一步采用常规的方法提取基因工程菌基因组DNA，以PCR方法鉴定饱和突变体库的阳性率。4、以高通量平板方法筛选基因工程氧化葡萄糖杆菌。按本技术领域一般技术人员熟悉的方法，利用前述氧化葡萄糖杆菌饱和突变体库，以高通量平板方法筛选基因工程菌，并根据菌株生长情况，判定所得到的突变株是否为高产基因工程菌。5、通过发酵实验验证氧化葡萄糖杆菌基因工程高产菌株。通过摇瓶和IOL罐发酵实验，进一步验证基因工程菌将D-山梨醇转化为L-山梨糖的效率高于出发菌株。本发明利用Tn5转座子，构建了氧化葡萄糖杆菌饱和突变体库，根据突变株生长情况进行生物检测，快速、低成本地筛选到了较出发菌株的L-山梨糖产量大幅提高的基因工程氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans WelcomeI (090319-15)) CCTCC NO: M20102M，提高了维生素C生产过程中底物的转化率。本发明具有简便、快速、准确、规模化寻找与某一表型相关的基因的操作特点。另外，由于能够对突变进行定位，对发生突变的基因可以进行进一步的研究，为进一步优化改良菌株奠定了基础。
图1为PCR方法分析突变体库基因组分子特征的电泳图谱，从左到右，点样顺序为基因工程氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans WelcomeI (090319-15)) CCTCC No: M2010224 ；氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacteria oxydans Welcome I) CCTCC No :M209305 (阳性对照)；Ikb ladder。
具体实施例方式氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacteria oxydans Welcome I):来自河北维尔康制药有限公司；D-山梨醇、L-山梨糖等化学试剂均为市购。LB培养基配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入细菌培养用胰化蛋白胨 (bacto-tryptone) 10g，细菌培养用酵母提取物(bacto-yeast extract) 5g，禾口 NaCl IOg0摇动容器至溶质完全溶解，用5mol/L NaOH(约0. 2ml)调节至pH7. 0，加入去离水至总体积为 1L，在151bf/in2(l. 03牡IO5)高压下蒸气灭菌20分钟。实施例实施例1 构建氧化葡萄杆菌(Gluconobacteria oxydans Welcome I)CCTCC No: M209305饱和突变体库1)培养氧化葡萄杆菌(Gluconobacteria oxydans Welcome I) CCTCC NO :M209305以的接种量将氧化葡萄杆菌甘油管接种于50ml LB培养基中，200rpm摇过夜， 至对数生长中后期0D_ = 0.3。活化后的菌种同样以接种量，转种于2*100ml LB培养基中，培养过夜，至对数生长中期0D_ = 0. 2左右。幻制备氧化葡萄杆菌(Gluconobacteriaoxydans Welcome I) CCTCC NO :M209305 电转感受态及电转化①2*100ml氧化葡萄杆菌置入预冷的500ml离心杯；②8000g离心10分钟；
③收集菌体，预冷的超纯水洗2次；④收集菌体，预冷的10%甘油洗1次；⑤收集菌体，重悬于Iml 10%的甘油。⑥取40ul菌悬液，加入IOOng Tn5转座子，电击；⑦加入Iml SOC培养基，活化2小时；⑧涂平板(含Kar^Oyg/ml)，孵育7天，得到阳性克隆4000个。实施例2以高通量平板方法选育基因工程氧化葡萄糖杆菌(GluconcAacter oxydans Welcome 1(090319-15))突变体库菌株扩增将4000株阳性克隆在LB平板(Kan抗性)上划线扩增，置于 30°C恒温箱中培养，生长7天后，菌种生长良好。按本技术领域一般技术人员熟悉的方法，以高通量平板方法(Biochimica et Biophysica Acta, 1647 (2003), 278-288)筛选基因工程菌，观察菌株生长情况，得到1个高产基因工程氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans WelcomeI (090319-15)) CCTCC No: M2010224o实验例种子培养基配方D-山梨醇 10%酵母膏0.3%碳酸钙0.7%pH 6. 0121°C 20分钟灭菌备用发酵培养基配方D-山梨醇 25%酵母膏0.014%玉米浆0.45%碳酸钙0.05%pH 6. 0121°C，20分钟灭菌备用。对照组氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacteriaoxydans Welcome I) CCTCC No: M209305。实验组基因工程氧化葡萄糖杆菌(GluconcAacter oxydans WelcomeI(090319-15))CCTCC No :M2010224。实验例1 氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans Welcome 1(090319-15))的摇瓶发酵种子培养250ml三角瓶装入25ml种子培养基。对照组和实验组冷冻甘油管接入 25ml种子培养基，31°C静置培养M小时。摇瓶发酵750ml带挡板摇瓶装入120ml发酵培养基。将实验组和对照组的种子培养物按10%接种量分别接入120ml发酵培养基，300C，220rpm,震荡培养M小时。取发酵液测定其中的L-山梨糖含量，根据公式Y = P/S*l. 012* 100%，Y为D-山梨醇转化为L-山梨糖的转化率，P为单位体积L-山梨糖的含量(重量)，S为单位体积D-山梨醇的投放量 (重量)，计算出L-山梨糖的转化率(见表1)。表 1 氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans Welcome 1(090319-15))摇瓶发酵实验结果
权利要求
1.一种基因工程氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans Welcome 1(090319-15) CCTCC NO :M2010224。
2.—种权利要求1所述基因工程氧化葡萄糖杆菌的制备方法，包括将Tn5转座子导入氧化葡萄糖杆菌的基因组中，构建突变体库。
3.根据权利要求2的制备方法，还包括在所构建的突变体库中筛选基因工程菌。
4.根据权利要求3的制备方法，其中的筛选是通过高通量平板方法进行的。
5.权利要求1所述基因工程氧化葡萄糖杆菌在D-山梨醇转化为L-山梨糖中的用途。
6.权利要求1所述基因工程氧化葡萄糖杆菌在维生素C发酵生产中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种维生素C生产相关菌株的基因工程菌，及其制备方法和用途。具体涉及一种基因工程氧化葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans Welcome I(090319-15))CCTCC NOM2010224及其制备方法，以及其在维生素C的发酵生产、特别是在D-山梨醇转化为L-山梨糖中的用途。
文档编号C12P17/04GK102559566SQ20101061130
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者于兰, 修建新, 吴洪涛, 孙君伟, 崔永涛, 朱欣杰, 李锦 , 杨丽霞, 米造吉, 谢萍, 贾茜, 黄艳敏 申请人:华北制药集团新药研究开发有限责任公司, 河北维尔康制药有限公司