专利名称：改善磷酸盐在植物中溶解性的方法
技术领域：
本发明涉及将具有高水平吲哚-3-乙酸(IAA)的细菌用于农业应用，例如改善农业产量和增加植物生长肥料的可用性。
背景技术：
氮(N)和磷(P)是植物生长的主要限制因素。一些微生物改善N和P的摄取和可用性，使化学肥料依赖性最小。与别的主要营养如氮相比，磷(P)是迄今多数土地情况中最少移动和植物可利用的。尽管土壤中富含有机和无机形式的P，但其经常是植物生长主要甚至首要的限制因素。 全世界许多土壤是缺乏P的，因为即使是在肥沃的土壤中，游离浓度(植物可利用的形式) 通常仍较低，这是由于可溶性P与钙、铁或铝的高反应活性导致P沉淀(36，41)。此外由于成本限制，在发展中国家中没有广泛使用提供三种主要植物营养(N、P和钾)的化学肥料。 在这些地区，磷酸盐岩(Phosphate Rock, PR)的直接应用越来越多，即使I3R释放的P通常对于作物生长来说太少(9，38)。已知许多微生物，特别是假单胞菌属(Pseudomonas)、杆菌属(Bacillus)和根瘤菌属(Rhizobium)，具有改变它们代谢的能力以响应细胞生长可用的磷。代谢的转变通过抑制和诱导不同基因来介导，所述基因的产物涉及范围从P源的摄取和获得到新细胞组分的从头合成(36，18)。此外，体外研究显示在一些这类细菌中观察到P 溶解活性和生长素吲哚-3-乙酸(IAA)的生成(39，17)，尽管没有证明连接IAA生成和P溶解的直接关联。在不同的微生物中研究P摄取。包括苜蓿根瘤菌(S.meliloti)在内的许多细菌具有至少两种P转运系统，与高和低亲和力转运系统相一致。所述高亲和力系统由Ph0CDET 操纵子编码，而低亲和力系统由pit (在orfA-pit操纵子内)编码。在苜蓿根瘤菌中编码两种P转运系统的基因表达受PhoB激活剂控制。在P过量情况下，PhoB失活，pho⑶E环表达。在P有限的情况下，所述低亲和力Pit通透酶系统受活化的PhoB抑制，而高亲和力 PhoCDET系统被诱导并变为P转运的主要机制(10)。许多菌株含有产物pstSCAB同系物作为高亲和力磷酸盐转运子。在没有磷胁迫时观察到苜蓿根瘤菌1021的pstC ORF中的1碱基缺失很可能负责(通过PhoB) 12个磷饥饿诱导基因的中等组成型激活(24，43)。在植物和微生物中，PR溶解的主要机制是H+分泌、有机酸生成和酸性磷酸酶生物合成(2，3)。包括乙酸、乳酸、苹果酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、葡糖酸、酮葡糖酸等的有机酸可与磷酸铁和磷酸铝中的铁或铝形成复合体，从而将植物可利用的磷酸盐释放到土壤中(18， 22)。有机酸还可通过阻断土壤颗粒的P吸收位置或通过与土壤矿物表面的阳离子形成复合体来提高P利用率(36)。大多数有机磷化合物的矿物化通过磷酸酶进行。土壤中这些酶的主要来源被认为是微生物来源。具体地，磷酸酶活性在根围明显增加。多数土壤的PH值从酸性到中性。因此，酸性磷酸酶在此过程中应起主要作用(36)。在本发明中，分析了苜蓿根瘤菌1021株RD64的P溶解能力和其对苜蓿宿主植物生长的影响。
本作者使用苜蓿根瘤菌_截形苜蓿(S. meliloti-M. truncatula)系统，因为所述细菌可利用微阵列且苜蓿是用于不确定的根瘤发育的公认模式系统。所述RD64株之前已工程改造为过量生成IAA(11，35)，显示其能在液体生长培养基中释放与野生型1021相比最多78倍的IAA (12，21)。之前也有报道称在用IAA处理的大肠杆菌(E.coli)细胞(7)中发现RD64更加耐盐以及其他非生物胁迫(5)。被该株根瘤化的苜蓿植物具有较高程度的保护免受盐胁迫诱导的氧化损伤(5)。此外，之前证明IAA以尚未了解的机制引发非常远的系统如转化人细胞(15)、大肠杆菌(8)和苜蓿根瘤菌(21)的三羧酸循环或柠檬酸循环、TCA循环中酶的诱导。为了评价苜蓿根瘤菌RD64中IAA过量生成引发的总体效应，用微阵列分析比较了野生型1021和RD64及用IAA和其他四种化学上或功能上相关的分子处理的1021的基因表达图谱。在RD64和IAA处理的1021细胞差异表达的基因中，本作者发现pho操纵子的两个基因。该意外发现引导作者检测RD64中矿物P溶解机制和P饥饿情况下该菌株改善苜蓿生长的潜在能力。P饥饿情况定义为细菌1021或RD64在含有1. OmM磷酸钾的培养基中生长时段。自由生长条件下观察到RD64的酸性磷酸酶活性和有机酸分泌的提高。此外，从被该菌株根瘤化的苜蓿植物根部渗出的有机酸含量高于被1021野生型菌株根瘤化的植物所测。此效应与观察到的这些植物中增加的P溶解和植物干重生成相关联。发明描述本发明中，用W000/28051 (RD64 株)所述的质粒 pG-Promintron-iaaM-tms2 将苜蓿根瘤菌1021株工程改造为过量生产植物激素IAA。本领域技术人员应理解也可工程改造其他株系。本发明意外发现RD64可高效地从不可溶来源如磷酸盐岩(PR)中活化P。在P有限条件下，RD64相较1021野生型菌株更高的P活化性与所述高亲和力P转运系统的编码基因上调、酸性磷酸酶活性的诱导和分泌到生长培养基中的马来酸、琥珀酸以及富马酸的增加相关联。P有限条件在仅细菌生长于确定的最小培养基时涉及5%的PR浓度，或在1021 或RD64根瘤化的苜蓿植物生长于确定的最小培养基时涉及0. 02%的PR浓度。在P有限条件下生长时，与所述野生型菌株(Mt-1021)根瘤化的植物相比，RD64(Mt-RD64)根瘤化的截形苜蓿(Medicago truncatula)植物释放较高含量的另一种P溶解有机酸，2_羟戊二酸。已证明与Mt-1021植物相比，Mt-RD64植物显示出较高的干重生成。本作者在此报道了与P有限的Mt-1021植物相比，P有限的Mt-RD64植物的芽和根鲜重也表现出显著增长。本作者讨论了在根瘤菌属-豆科(rhizobium-legume)模式系统中，与细菌IAA过量生产而不是IAA生产相连的不同因子的平衡相互作用本身是如何在胁迫环境条件下(具体是在P有限情况下)刺激植物生长。因此，能够为植物生长提供溶解P的土壤细菌如RD64，对改善农业产量特别有利，特别是在热带地区如化学肥料使用有限且有大量可利用I3R资源的撒哈拉沙漠以南 (sub-Saharan) jftlK。因此本发明的一个目的是将具有高吲哚-3-乙酸(IAA)含量的细菌用于溶解土地中的磷酸盐岩，其中所述细菌通过转化能够增加IAA含量的试剂的编码基因而获得。
能够增加IAA含量的所述试剂优选为吲哚乙酰胺水解酶(iaaM)或色氨酸一氧化物酶(tms2)。 在一个优选的实施方式中，所述细菌属于根瘤菌属。所述根瘤菌属的细菌优选苜蓿根瘤菌种。所述细菌还优选能生成吲哚-3-乙酸(IAA)植物激素。所述细菌还优选包含在豆科植物根瘤中。本发明的另一个目的是为可根瘤化的植物和/或所述植物生长周边土壤提供可溶性磷的方法，其包括用具有高吲哚-3-乙酸(IAA)含量的细菌诱导所述植物根瘤化，其中所述细菌通过转化能增加IAA含量的试剂的编码基因而获得。能够增加IAA含量的所述试剂优选为吲哚乙酰胺水解酶(iaaM)或色氨酸一氧化物酶(tms2)。所述细菌优选属于根瘤菌属。所述根瘤菌属的细菌还优选是苜蓿根瘤菌种。所述细菌还优选能生成吲哚-3-乙酸(IAA)植物激素。所述细菌优选包含在豆科植物根瘤中。通过涉及下图的非限制性实施例阐述本发明。图Si.在P充足条件下(13mM磷酸钾)，苜蓿根瘤菌细胞中pho操纵子基因的定量 RT-PCR分析。在RD64和用0. 5mM IAA、IncU Trp, ICA和2，4_D处理的1021细胞中高度表达的基因相对表达水平大于1。在1021细胞中高度表达的基因的相对表达水平小于1(对照)。误差线代表三次独立生物实验的标准偏差。
图1.在P饥饿条件下，苜蓿根瘤菌细胞中pho操纵子基因表达的定量RT-PCR分析。在RD64和用0. 5mM IAA、Ind、Trp, ICA和2，4_D处理的1021细胞中高度表达的基因相对表达水平大于1。在1021细胞中高度表达的基因的相对表达水平小于1(对照)。误差线代表五次独立生物实验的标准偏差(P < 0. 05)。图2. P饥饿条件下苜蓿根瘤菌细胞中酸性(A)和碱性(B)磷酸酶活性。生长在 MOPS缓冲最小培养基(起始P浓度=13mM)中的对数期细胞经清洗且随后在不含添加卩(1021和1 64株系)和含有0.5^^、扑？或111(1(1021株系)的相同培养基中重悬。在 30°C下进行3小时处理。数值为四次独立生物实验的平均值士SD (ρ < 0. 05)。图3.释放到含有5% PR作为P源的苜蓿根瘤菌培养物里的可溶性磷酸盐。数据为四次独立生物实验的平均值士SD(p < 0. 006)。图S2.细菌上清㈧和根分泌物样本⑶里的有机酸在210nm处的HPLC色谱图。 箭头指向GC-MS鉴定的峰。数字对应下列酸(1)马来酸，(2)琥珀酸，(3)富马酸和(4) 2-羟
戊二酸。图4.释放到含有5%磷酸盐岩I3R作为P源的无细菌培养基里的可溶性磷酸盐的变化(生长在含ra的最小培养基中的细菌的P有限条件)。在生长培养基中加入所述有机酸㈧马来酸、琥珀酸和富马酸至模拟1021(0A-1021)、用0.5mM IAA处理的 1021(0A-1021+IAA)和RD64细胞(0A-RD64)释放量的水平。在生长培养基中加入所述2-羟戊二酸(B)至模拟Mt-1021(0A-Mt-1021)和Mt_RD64 (0A_Mt_RD64)植物释放量的水平。加入的各有机酸量源自HPLC分析获得的数据且在材料与方法部分给出。数据为五次独立生物实验的平均值士SD(p < 0. 006)。图5.细菌IAA过表达对截形苜蓿生长的影响。㈧在P有限(0. 02% PR)和P充足(多于SmM磷酸钾)条件下生长了 4周的植物表型。(B)如(A)所述生长1周的植物根的表型。如㈧所述生长的植物的(C)芽鲜重，⑶根鲜重。数据为平均值士SD(n = 30， ρ < 0. 001)。材料和方法细菌生长条件所述苜蓿根瘤菌野生型1021株和所述包含p-iaaMtms2构建体的过量生成IAA的 RD64株如前所述(12，21)。用于根瘤菌属(RMM)的标准甘露醇最小培养基改良成含有作为碳源的(w/v)甘露醇、(w/v)氯化铵、用以缓冲的IOmM吗啉丙磺酸(MOPS ；pH 7.0) 和加至终浓度ImM (P饥饿)和13mM(P充足)的P(KH2PO4)。按所需加入抗生素(5)。P 消耗对于P饥饿实验，1021野生型和RD64菌株的细胞于30°C在含有1 % (w/v)甘露醇作为碳源和13mM P的RMM肉汤中生长到对数期中期(0D_ = 0. 6)，用不含P的RMM清洗，重悬于相同的培养基且随后分成3组培养物。无P (-P) U. OmM P (P饥饿细胞)或13mM P (+P 细胞也称为P充足细胞)分别加入所述三组培养物中。所述P饥饿和P充足1021野生型细胞用0. 5mM IAA处理3. 0小时。为了检测IAA效应的特异性，将其他四种酸度范围从酸 (pH 2.9)到弱酸(pH 6. 1)的选定化合物〔吲哚(Ind)，色氨酸(Trp)，吲哚-3-羧酸(ICA) 和2，4- 二氯苯氧基乙酸(2，4-D)〕溶于50% (w/v)乙醇并加入到P饥饿和P充足的1021 野生型细胞中至终浓度为0. 5mM。新介绍的IAA生物合成途径用Trp生成IAA，因此提出了所述RD64细胞是否Trp饥饿的问题。确实，如作者所述细菌中有将Trp转变为IAA的两种新基因，所述两种基因可能非常有效以至周围一有Trp分子它们就将其转变为IAA而没有 Trp参与蛋白合成。为了排除此细菌可能部分对Trp饥饿，RD64细胞还用0. 5mM Trp处理并用微阵列和RT-PCR分析。最终，为了避免溶剂干扰，用相似量的乙醇溶液处理对照细胞。 每个处理3小时后，分批收集细胞，冷冻并储存在-80°C用于实验。对于磷酸盐溶解实验，用5%摩洛哥(Moroccan)磷酸盐岩(PR)(西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)，目录号32)作为P源。当5% I3R用作P源以允许细菌生长时描述为P有限条件。持续进行至少五次独立实验。微阵列分析用前述方法对比生长在P充足(13mM)条件下的1021未处理细胞(对照)和 RD64、1021+IAA、1021+Ind、1021+Trp、1021+ICA 和 1021+2，4-D 细胞的基因表达图谱，如 Imperlini 等报道(21)。RT-PCR 分析如前所述(5)分离P充足和P饥饿细胞的总RNA。用StrataScript 反转录试剂 (司查塔基公司(Stratagene))和作为引物的随机六聚体来合成cDNA。用Power SYBR PCR Master Mix (应用生物系统公司(Applied Biosystems))进行定量PCR。反应在iCycler iQ(伯乐(Bio-Rad))上进行。热循环条件为95°C 15分钟，40个循环的95°C变性20秒、 72°C退火(20秒)和延伸(35秒)。用Primer3软件设计的特异引物对如下。phoB :5，-TTACGTCGTCAAGCCCTTCT-3，(SEQ ID Ni)禾口
5，-CCGGTGAGGACATGAGAAAT-3，(SEQ ID N2)；phoC 5' -ACTCCTGCGCATGATAAACC-3，(SEQ ID N3)禾口5，-TGTTGAGGACGCTCAGTACG-3，(SEQ ID N4)；phoD :5，-TATCTCGTTCCCCTCGTCAC-3，(SEQ ID N5)禾口5，-ACCTTTGTCGACCATCTTGC-3，(SEQ ID N6)；phoE :5，-GCTTCATCCTGTGCTTCCTC-3，(SEQ ID N7)禾口5，-AGACCTTCCTCCGGTTTCAT-3，(SEQ ID N8)；phoT :5，-TGGCGTCGTTCTTTACATGA-3，(SEQ ID N9)禾口5，-GTCTCCTTTTCGAGCGTGAC-3，(SEQ ID N10)；smc02641 :5，-CGAGAGGTGATGACGGAAGT-3，(SEQ ID Nil)禾口5，-ACCGACTTTCTCGCACAGAT-3，(SEQ ID N12)；smc00128 :5， -CTTCAGCATGAACGACCAGA-3， (SEQ ID N13)禾口5，-AAGAACCGCGTAACCTTCCT-3 ‘ (SEQ ID N14)；如前所述(8)，在比较Ct值法中smc02641和smc00128作为管家基因用于数据归一化。磷酸酶活性如前报道(16)在P有限条件下对碱性和酸性磷酸酶进行分析。报道的单位为 nmol/分钟/mg蛋白。用Bradford检验确定蛋白浓度。磷酸盐溶解用Saheki等所述的改良菲斯克和撒拜罗法(Fiske and Subarrow)评估可溶性磷酸盐浓度(37)。植物生长条件。如前报道(5)，截形苜蓿Jemalong 2HA变种的种子经表面灭菌、发芽并转移到溶液培养单元中。通过提供包含ImM CaCO3和1. ImM KCl (分别替代7. 3mM CaHPO4和1. ImM K2HPO4)的改良延森(Jensen)培养基实现P有限条件。这些植物仅在第一周接受0. 02% 冊。为了收集分泌物，清洗四周龄植物的根、蒸馏水浸没并在生长室放置48小时。分泌物蒸发至干并用HPLC分析。峰值一致性用GC-MS确定。有机酸和磷酸盐释放基于培养物上清中有机酸生成分析获得的结果，将苹果酸(MA)、琥珀酸(SU)、富马酸(FU)和2-羟戊二酸(2HG)加入无细菌培养基中，并测量可溶性磷酸盐浓度。对于1021 生长刺激条件，加入1.4mg/l FU, 500mg/l MA和lg/1 SU0对于1021+IAA生长刺激条件， 加入 16mg/l FU,860mg/l MA 和 860mg/l SU。对于 RD64 生长刺激条件，加入 5. 6mg/l FU, 840mg/l MA和3. lg/1 SU0对于Mt-1021和Mt_RD64生长刺激条件，分别加入2HG至终浓度49. 6mg/l和115. 2mg/l。无细菌培养基也用0. 5mM IAA溶液处理。刺激生长的培养基是无细菌或其上清的培养基。所述培养基仅包含市售纯化粉末(西格玛公司(SIGMA))的RP 和有机酸，所用有机酸浓度为生长在确定的培养基(含或不含IAA或来自RFD64)中的所述细菌生成的有机酸浓度。用HPLC测量有机酸通过HPLC用反相海波西尔金(Hypersil GOLD) C18 (IOOx 4. 6mm)柱(赛摩电子公司(Thermo Electron Corporation))测量所述有机酸。操作条件和定量如前所述(20)。GC-MS 分析收集自HPLC的有机酸部分经干燥、衍生为其叔丁基二甲基甲硅烷基(tBDMS)衍生物并在Micromass GCT质谱分析仪(英国曼彻斯特的沃特斯公司(Waters corp))上分析，所述分析仪连接装有7683自动取样器(加州帕洛阿尔托的安捷仑技术公司(Agilent Technologies))和ZB-5ms (英国麦克尔斯菲尔德的飞诺麦克斯公司(Phenomenex))毛细管柱(30m χ 0. 25mm I. D. χ 0. 25 μ md. f.，有 5m 保护柱)的安捷伦(Agilent) 6890 系列气相色谱仪。用无分流注射技术在250°C和2. Oml/分钟氦气流下注射样本。烘箱设为70°C 持续2分钟，然后以7°C /分钟逐步升温至350°C并持续5分种。所述GC界面和源温度设为250°C并在70eV以1光谱/秒的获得速度从0到47分钟获取EI+质谱图。从现有质谱和罗萨穆斯特研究有限公司(Rothamsted Research LTD，英国哈彭登赫特福德)之前分析的标准品的保持时间数据或从NIST质谱数据库与获自文献(30)的保持时间数据联用来鉴定色谱峰值。采用M\M-15+、M-57+在5ppm内的精确质量测量来核实分析物鉴定。各样本获得的色谱图与衍生试剂空白对比。数据分析用单向方差分析(ANOVA)和徒吉(Tukey)多重比较测试对数据进行统计学评估。结果pho操纵子基因调控本作者用转录谱分析法在P充足(13mM)条件下评价了苜蓿根瘤菌细胞中IAA过量生成引发的总体效应。本作者用野生型1021的基因表达图谱和RD64及用IAA处理的 102K1021+IAA)的基因表达图谱作比较。为了确定IAA效应的特异性，本作者还比较了未处理的1021细胞与四种化学或功能相似分子如吲哚(1021+Ind)、色氨酸(1021+Trp)、 吲哚-3-羧酸(1021+ICA)和2，4-二氯苯氧基乙酸(1021+2，4-D)的表达图谱(42)(表 S1-S6)。
权利要求
1.具有高吲哚-3-乙酸(IAA)含量的细菌在溶解土地内磷酸盐岩的应用，其中所述细菌通过转化能够增加IAA含量的试剂的编码基因而获得。
2.如权利要求1所述的细菌应用，其特征在于，所述能够增加IAA含量的试剂为吲哚乙酰胺水解酶(iaaM)或色氨酸一氧化物酶(tms2)。
3.如权利要求2所述的细菌应用，其特征在于，所述细菌属于根瘤菌属。
4.如权利要求3所述的细菌应用，其特征在于，所述根瘤菌属的细菌是苜蓿根瘤菌种。
5.如权利要求4所述的细菌应用，其特征在于，所述细菌能生成吲哚-3-乙酸(IAA)植物激素。
6.如权利要求1-5所述的细菌应用，其特征在于，所述细菌包含在豆科植物根瘤中。
7.—种为可根瘤化的植物和/或所述植物生长周边土壤提供可溶性磷的方法，所述方法包括用具有高吲哚-3-乙酸(IAA)含量的细菌诱导所述植物根瘤化，其中所述细菌通过转化编码能增加IAA含量的试剂的基因而获得。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述能够增加IAA含量的试剂为吲哚乙酰胺水解酶(iaaM)或色氨酸一氧化物酶(tms2)。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述细菌属于根瘤菌属。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述根瘤菌属的细菌是苜蓿根瘤菌种。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述细菌能生成吲哚-3-乙酸(IAA)植物激素。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述细菌包含在豆科植物根瘤中。
全文摘要
本发明涉及将具有高吲哚-3-乙酸(IAA)含量的细菌用于溶解土地中的磷酸盐岩(phosphate rock)，其中所述细菌通过转化能够增加IAA含量的试剂的编码基因而获得。
文档编号C12N1/21GK102414311SQ201080020013
公开日2012年4月11日 申请日期2010年3月23日 优先权日2009年3月23日
发明者R·德费 申请人:国家研究院