专利名称：用于以阵列状配置动物细胞的基板的制造方法以及以阵列状配置有动物细胞的基板的制 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于以阵列状配置动物细胞的基板的制造方法，以及使用该方法的以阵列状配置有动物细胞的基板的制造方法。
背景技术：
尝试以逐个的水平确定、选择细胞，并使用所选择的细胞。例如，对分别检出逐个淋巴细胞的抗原特异性、进而回收所检出的一个抗原特异性淋巴细胞、使用所回收的一个抗原特异性淋巴细胞，例如制造抗体进行了研究(专利文献I)。专利文献I中，为了检出抗原特异性淋巴细胞，而使用微孔阵列芯片。该微孔阵列芯片中，各微孔的形状及尺寸具有一个微孔仅容纳一个淋巴细胞的形状及尺寸。已知若在基板表面培养动物细胞则称为细胞外基质的粘接蛋白质在细胞外形成，将细胞附着在基板表面。已知将如此附着在基板表面上的细胞剥离而利用。作为剥离方法，也已知利用电刺激(专利文献2 4)。现有技术文献 专利文献
专利文献I日本特开2004-173681号公报 专利文献2日本特开2008-295382号公报 专利文献3日本特开2005-312343号公报 专利文献4日本特开平10-42857号公报 专利文献I 4的全部记载特别地合并于此作为公开。
发明内容
但是，利用细胞外基质实现的细胞对基板表面的附着、通过电刺激进行的细胞的剥离未用作将动物细胞分别逐个地配置在基板表面上的技术方案。本发明的目的在于提供不使用微孔就可以将动物细胞分别逐个地配置在基板表面上的新的技术方案。本发明人为了达成上述目的而进行各种研究，结果发现，通过细胞外基质的吸附和利用细胞外基质的部分性的电刺激进行的剥离，可以形成可以个别附着动物细胞的培养基板，从而完成本发明。本发明如下所述。[I]用于以阵列状配置动物细胞的基板的制造方法，含有(1)准备在电极基板表面上以阵列状具有吸附用表面的基板的步骤，
(2)在上述基板的电极表面及吸附用表面上吸附细胞外基质的步骤，和
(3)对上述电极施加微弱电位，将电极表面的细胞外基质剥离，而得到在吸附用表面上吸附有细胞外基质的基板的步骤。[2]以阵列状配置有动物细胞的基板的制造方法，含有
(1)准备在电极基板表面上以阵列状具有吸附用表面的基板的步骤，
(2)在上述基板的电极表面及吸附用表面上吸附细胞外基质的步骤，
(3)对上述电极施加微弱电位，将电极表面的细胞外基质剥离，而得到在吸附用表面 上吸附有细胞外基质的基板的步骤，和
(4)在步骤(3)中得到的基板表面上培养动物细胞，得到在吸附用表面上附着有动物细胞的基板的步骤。[3] [I]或[2]中记载的制造方法，其中，阵列状的各吸附用表面的尺寸为在一个吸附用表面上可以附着一个动物细胞的尺寸。[4] [I] [3]中任意一项记载的制造方法，其中，上述基板选自非导电性的有机材料和无机材料。[5] [I] [3]中任意一项记载的制造方法，其中，上述基板为玻璃、塑料或陶瓷。[6] [I] [4]中任意一项记载的制造方法，其中，步骤(3)中的上述微弱电位在一0. 4V 一0. 2V 或+ 0. 2V + 0. 5V(相对于 Ag/AgCl (vs. Ag/AgCl))的范围。[7] [2] [6]中任意一项记载的制造方法，其中，步骤⑷中的动物细胞的培养在对上述电极施加一 0. 4V 一 0. 2V(相对于Ag/AgCl)范围的电位、抑制动物细胞对于上述电极的附着的同时进行。[8] [2] [6]中任意一项记载的制造方法，其中，步骤⑷中的动物细胞的培养以对上述电极施加正电位、在上述电极上附着动物细胞的方式进行，得到在吸附用表面及电极上附着有动物细胞的基板。根据本发明，可以形成可以个别附着动物细胞的培养基板，若使用该培养基板则也可以将动物细胞分别逐个地配置在基板表面上。
[图I]表示实施例I中的电极制造顺序的说明图。[图2]表不步骤⑵ ⑷的说明图。[图3]表示使用FITC标记胶原蛋白I作为细胞外基质蛋白质时的图案电极表面的图像。[图4]表示使用FITC标记胶原蛋白I作为细胞外基质蛋白质时的图案电极表面的图像。[图5]表示使用FITC标记聚-L-赖氨酸(poly-L-lysin)作为细胞外基质蛋白质时的图案电极表面的图像。[图6]表示实施例2中得到的培养动物细胞(HeLa细胞)24小时后的电极表面的图像。[图7]表示实施例3中得到的培养动物细胞(PC12细胞)24小时后的电极表面的图像。[图8]表示参考例I中的ITO电极表面对于水的接触角的测定结果。
具体实施例方式本发明涉及用于以阵列状配置动物细胞的基板的制造方法，以及使用该基板的以阵列状配置有动物细胞的基板的制造方法。用于以阵列状配置动物细胞的基板的制造方法含有以下的步骤(I) (3)，以阵列状配置有动物细胞的基板的制造方法含有以下的步骤(I) ⑷。步骤(I)
步骤(I)为准备在电极基板表面上以阵列状具有吸附用表面的基板的步骤。电极基板在绝缘性的基板的表面的一部分或全部上具有电极，例如可以为在载玻片(slide glass)上涂布氧化铟(ITO)而成的基板。但是，绝缘性基板并非意图限于载玻片，电极并非意图限 于氧化铟(ITO)。上述电极基板在表面上以阵列状具有吸附用表面。吸附用表面为用于吸附细胞外基质的电极以外的表面，由可以吸附细胞外基质的材料构成。可以吸附细胞外基质的材料例如可以为玻璃，但是若为非导电性的固体则不特别限定，可以为非导电性的有机材料、无机材料。作为非导电性的有机材料、无机材料，除了玻璃之外,还可以举出例如塑料、陶瓷等。因此，作为吸附用表面，可以示例玻璃表面，但是并非意图限于玻璃表面，可以从非导电性的有机材料、无机材料中适当选择。而且，利用显微镜等观察细胞外基质的吸附、细胞的附着状态时，优选基板透明。阵列状例如指的是纵列和横列分别以多个微小区域配置吸附用表面。对纵列和横列各自的微小区域数目不特别限定，可以根据动物细胞的种类(尺寸)、以阵列状配置有动物细胞的基板的利用目的等适当决定，例如可以在纵10 IO5X横10 IO5的范围。但是，并非意图限定于该范围。吸附用表面的形状为矩形(三角形、正方形、长方形、多边形等)、圆形、椭圆形等，可以适当决定。阵列状的各吸附用表面的尺寸可以为在一个吸附用表面上可以附着一个动物细胞的尺寸。动物细胞的尺寸根据细胞而多种多样，因此可以根据所附着的动物细胞的尺寸适当决定吸附用表面的尺寸。其中，例如动物细胞为HeLa时，吸附用表面的尺寸例如可以在25 IOOiim的范围。此外，阵列状的各吸附用表面的尺寸也可以为在一个吸附用表面上可以附着两个以上动物细胞的尺寸。电极基板表面上的阵列状吸附用表面可以如下形成，在基板表面上涂布电极层，将阵列状吸附用表面用的掩模在电极层表面上形成，接着通过掩模将电极层表面蚀刻，除去掩模。或者，在电极基板表面上形成阵列状吸附用表面也可以如下进行，在基板表面上通过阵列状吸附用表面用的掩模涂布电极层，接着除去掩模。电极层的形成、电极层表面的蚀刻等可以使用常规方法适当实施。步骤(2)
步骤(2)为在步骤(I)中准备的基板的电极表面及吸附用表面上吸附细胞外基质的步骤。如图2的步骤⑵所示，在基板的电极表面以及吸附用表面(阵列电极表面)上吸附细胞外基质。细胞外基质可以为细胞粘接性的蛋白质，例如可以为含有胶原、蛋白聚糖、透明质酸、纤连蛋白、层粘连蛋白、生腱蛋白、巢蛋白等的细胞外基质。细胞外基质可以获得市售品。细胞外基质对基板表面的吸附可以如下实施，将含有细胞外基质的水溶液涂布在基板表面上，或将基板表面以朝上的状态浸溃在含有细胞外基质的水溶液中，并静置。步骤(3)
步骤(3)为通过对吸附有细胞外基质的基板的电极施加微弱电位，将电极表面的细胞外基质剥离，而得到在吸附用表面上吸附有细胞外基质的基板的步骤。如图2的步骤(3)所示，在维持吸附用表面(中央部)的细胞外基质的吸附的状态下，施加了微弱电位的电极表面的细胞外基质剥离。微弱电位例如在一 0. 4V 一 0. 2V或+ 0. 2V + 0. 5V(相对于Ag/AgCl)的范围从吸附在吸附用表面上的细胞外基质维持吸附、可以剥离电极表面的细胞外基质的观点考虑是优选的。微弱电位优选例如在一 0. 4V 一 0. 2V(相对于Ag/AgCl)的范围的微弱电位的施加可以根据吸附在电极表面上的细胞外基质的量、细胞外基质的种类适当决定，例如可以在2小时 24小时的范围实施。通过微弱电位的施加进行剥离后，还可以根据需要洗涤基板表面，将游离的细胞外基质除去。通过步骤(I) (3)，可以制造用于以阵列状配置动物细胞的基板。至此得到的用于以阵列状配置动物细胞的基板进而供给以下的步骤(4)，其可以用于以阵列状配置有动物细胞的基板的制造中。步骤(4)
步骤(4)为在步骤(3)中得到的基板表面上培养动物细胞，得到在吸附用表面上附着有动物细胞的基板的步骤。如图2的步骤(4)A所示，在吸附用表面上附着动物细胞。对于在基板表面上培养的动物细胞不特别限定，可以是例如人正常细胞、ES细胞、iPS细胞、HeLa细胞、CHO细胞等。基板表面上的动物细胞的培养条件可以根据动物细胞的种类适当采用公知的培养条件。若向基板表面供给含有动物细胞的培养液，在对应于动物细胞的种类的培养条件下培养，则在吸附用表面上吸附细胞外基质，因此在细胞外基质上附着动物细胞，在吸附用表面上附着动物细胞。由此，制造以阵列状配置有动物细胞的基板。另外，步骤⑷中的动物细胞的培养可以在对上述电极施加一0. 4V 一0. 2V (相对于Ag/AgCl)范围的电位、抑制动物细胞对于上述电极的附着的同时进行。如图2的步骤
(4)B所示,通过对电极施加一 0. 4V 一 0. 2V(相对于Ag/AgCl)范围的电位,抑制动物细胞对于电极的附着，在吸附用表面上附着动物细胞。例如培养在血清中进行时，由于血清中含有细胞外基质蛋白质，通过在培养期间施加一 0. 2V 一 0. 4V(相对于Ag/AgCl)的负电位，可以抑制细胞外基质蛋白质对电极的吸附，结果可以抑制动物细胞对电极的附着。此外，即使在无血清进行培养的情况下，由于动物细胞分泌的细胞外基质，动物细胞有可能附着在电极上，此时，通过在培养期间施加一 0. 2V 一 0. 4V(相对于Ag/AgCl)的负电位，也可以抑制细胞外基质蛋白质对电极的吸附，抑制动物细胞对电极的附着。进一步地，由于动物细胞具有负电荷，也可以抑制动物细胞在上述施加了负电位的电极基板表面上的附着。由此，在施加了负电位的电极表面上不附着动物细胞，可以将细胞仅附着在欲附着动物细胞的阵列状图案部分。进一步地，步骤(4)中的动物细胞的培养，也可以以对上述电极施加正电位、在上 述电极上附着动物细胞的方式进行，得到在吸附用表面及电极上附着有动物细胞的基板。由于如上所述动物细胞具有负电荷，通过静电引力，可以在施加了正电位的电极基板表面上感应附着动物细胞。因此，若对上述电极施加正电位，则在未涂布胶原等细胞外基质蛋白质的部位，也可以良好地附着细胞。对于正电位，从利用静电引力实现的动物细胞的感应附着和不会对动物细胞造成损伤的观点考虑，例如在+ 0. 2V + I. OV (相对于Ag/AgCl)、优选在+ 0. 2V + 0. 6V(相对于Ag/AgCl)的范围是合适的。利用本发明的方法制造的以阵列状配置有动物细胞的基板例如可以用于调查动物细胞的性质、或调查由动物细胞排出的物质。特别是通过以阵列状将动物细胞逐个地配置在培养基板表面上，可以以单一细胞水平分析通过物理化学刺激而活化的机理。进一步地，附着在电极基板表面以及电极基板表面附近的吸附用表面上的细胞例如可以通过将频率在IKHz IOMHz的范围、且±1. 0V(相对于Ag/AgCl)或更小的电位的幅度的高频变动电位(波形例如为矩形波、正弦波或三角波)施加到电极上来剥离。其中，剥离时的培养液为磷酸缓冲液(不含Ca2'Mg2 + )从容易剥离的观点考虑是优选的。实施例
以下通过实施例对本发明进行更具体的说明。实施例I
(I)电极的制造
根据以下的顺序制造电极和3电极培养系统。图I表示电极制造的顺序的说明图。I)在载玻片(图I左上)上的中央部以6.3 7.5 Q/cm2涂布氧化铟(ITO)制造图案电极(IcmXlcm)(图I左下)。图案电极如左下所示，分为4个区域制造，各区域的图案A D如图I的中央所示。黑色部分为玻璃表面，白色部分为ITO电极表面。2)将该载玻片的端部部分用金钢钻开孔，用导电性树脂(Dotite、D-550、藤仓化成(株))连接导线和ITO电极。3)卸除 9 V'' r 'y 夕腔室玻片(Lab-tek chamber slide、177410、NalgeNunc)的腔 室部分，用水槽修复用硅粘合剂(东芝；'J ^ 一 >、TSE382-C ”了)粘接在ITO图案电极上。4)在9 7' r 〃々腔室玻片的盖部分的2个部位用金钢钻开孔，连接钼电极和银/氯化银电极。5)组合盖和腔室，完成3电极培养系统(右上照片)。(2)细胞外基质蛋白质的吸附
在(I)制造的3电极培养系统的电极表面上，按照以下的顺序吸附细胞外基质蛋白质。I)将ITO图案电极腔室在蒸馏水中超声波洗涤5分钟。2)向ITO图案电极腔室内加入IM NaOH，静置5分钟。3)将ITO图案电极腔室用PBS (-)轻轻洗涤后，在净化台内进行UV杀菌处理5分钟。4)将 0. lmg/ml 的 FITC 标记聚-L-赖氨酸(Sigma)的 PBS (-)溶液、或 0. lmg/ml的FITC标记胶原蛋白I (Sigma)的0. OlM HCl水溶液加入到腔室内，37°C下静置10分钟。5)用PBS (_)轻轻洗涤腔室内2次后，将ITO图案电极腔室保存在4°C下，或立即用于实验。(3)电位施加
在(2)中在电极表面上吸附细胞外基质蛋白质后，按照以下的顺序施加电位，从电极表面剥尚细胞外基质蛋白质。I)向ITO图案电极腔室内加入5ml的PBS (-)。2)安装连接电极的盖，形成3电极培养系统。3)利用恒电位仪(PS_14、Toho technical research)施加恒电位，由此剥离细胞外基质蛋白质。4)施加恒电位后用PBS (_)轻轻洗涤。然后用共焦激光显微镜(FV500、01ympus)观察细胞外基质蛋白质的分布。(4)结果
使用FITC标记胶原蛋白I作为细胞外基质蛋白质时的结果如图3和图4所示。图 3为在PBS(-)中施加一0. 4V、一 0. 3V、一 0. 2V、+ 0. 3V或+ 0. 4V的恒电位(相对于Ag/AgCl) 24小时时得到的电极表面的FITC的荧光图像。在图案化的玻璃表面(四方形)观察到荧光，表示吸附了 FITC标记胶原蛋白I，在其周围的ITO电极部分未观察到荧光，表示FITC标记胶原蛋白I剥离。图4为所施加的恒电位(相对于Ag/AgCl)为+ 0. 4V、施加时间在0 16小时变化时得到的电极表面的FITC的荧光图像。0 8小时时，在图案化的玻璃表面(四方形)的周围的ITO电极部分也观察到荧光，但是8 16小时时，仅在图案化的玻璃表面(四方形)观察到荧光，表示吸附了 FITC标记胶原蛋白I，在其周围的ITO电极部分未观察到荧光，表示FITC标记胶原蛋白I剥离。使用FITC标记聚-L-赖氨酸(Sigma)作为细胞外基质蛋白质时的结果如图5所示。图 5 为在 PBS (-)中施加一0. 4V、— 0. 3V、— 0. 2V、+ 0. 2V、+ 0. 3V、+ 0. 4V 或+ 0. 5V的恒电位(相对于Ag/AgCl) 24小时时得到的电极表面的FITC的荧光图像。施加一 0. 4V、一0. 3V、+ 0. 3V、+0. 4V和+ 0. 5V的恒电位(相对于Ag/AgCl) 24小时时，在图案化的玻璃表面(四方形)观察到荧光，表示吸附了 FITC标记聚-L-赖氨酸，在其周围的ITO电极部分未观察到荧光，表示FITC标记聚-L-赖氨酸剥离。施加一 0. 2V和+ 0. 2V的恒电位(相对于Ag/AgCl)24小时时，在图案化的玻璃表面(四方形)的周围的ITO电极部分也观察到荧光。实施例2
向在实施例I中使用FITC标记胶原蛋白I作为细胞外基质蛋白质、在PBS(-)中施加一 0. 3V的恒电位(相对于Ag/AgCl)42小时得到的图案电极的腔室内，接种悬浮在含有血清的培养基中的动物细胞(HeLa细胞)I X IO5细胞/孔，培养24小时。培养期间(24小时)，进一步施加一 0. 3V的恒电位。施加电位24小时后，对细胞、细胞外基质蛋白质的分布用共焦激光显微镜(FV500、Olympus)、相差显微镜(CKX-41、01ympus)进行观察。培养24小时后的电极表面的图像如图6所示。可知在吸附了 FITC标记胶原蛋白I的玻璃表面(四方形)上附着了动物细胞(HeLa细胞)。对于100 X 100 y m2以及50 X 50 y m2，成功将细胞仅配置在玻璃基板上。直至25X25iim2也可以进行细胞的配置控制。实施例3
向在实施例I中使用FITC标记胶原蛋白I作为细胞外基质蛋白质、在PBS(-)中施加+ 0. 4V的恒电位(相对于Ag/AgCl)66小时得到的图案电极的腔室内，接种悬浮在含有血清的培养基中的动物细胞(PC12细胞)，培养24小时。培养期间(24小时)，进一步施加+ 0. 4V的恒电位。施加电位24小时后，对细胞、细胞外基质蛋白质的分布用共焦激光显微镜(FV500、Olympus)、相差显微镜(CKX-41、Olympus)进行观察。培养24小时后的电极表面的图像如图7所不。可知在未吸附FITC标记I父原蛋白I的ITO电极基板表面上附着了动物细胞(PC12细胞)。参考例I
测定对ITO电极施加恒电位时的ITO电极的表面对于水的接触角。测定如下进行，在充满环辛烷的电解槽中的ITO电极的表面上载置水滴，对施加恒电位(24小时)前后的接触角进行测定。结果如图8所示。通过施加一 0. 4V和+ 0. 4V的恒电位(相对于Ag/AgCl)，对于水的接触角降低约20 40%，可知亲水性增加。由该结果推测，本发明中的通过细胞外基质蛋白质的恒电位施加进行的剥离的原因之一为，电极表面的亲水性增加。工业实用性
本发明对于动物细胞的培养相关领域是有用的。
权利要求
1.用于以阵列状配置动物细胞的基板的制造方法，含有 (1)准备在电极基板表面上以阵列状具有吸附用表面的基板的步骤， (2)在所述基板的电极表面及吸附用表面上吸附细胞外基质的步骤，和 (3)对所述电极施加微弱电位，将电极表面的细胞外基质剥离，而得到在吸附用表面上吸附有细胞外基质的基板的步骤。
2.以阵列状配置有动物细胞的基板的制造方法，含有 (1)准备在电极基板表面上以阵列状具有吸附用表面的基板的步骤， (2)在所述基板的电极表面及吸附用表面上吸附细胞外基质的步骤， (3)对所述电极施加微弱电位，将电极表面的细胞外基质剥离，而得到在吸附用表面上吸附有细胞外基质的基板的步骤，和 (4)在步骤(3)中得到的基板表面上培养动物细胞，得到在吸附用表面上附着有动物细胞的基板的步骤。
3.如权利要求I或2所述的制造方法，其中，阵列状的各吸附用表面的尺寸为在一个吸附用表面上可以附着一个动物细胞的尺寸。
4.如权利要求I 3中任意一项所述的制造方法，其中，所述基板选自非导电性的有机材料和无机材料。
5.如权利要求I 3中任意一项所述的制造方法，其中，所述基板为玻璃、塑料或陶瓷。
6.如权利要求I 4中任意一项所述的制造方法，其中，步骤(3)中的所述微弱电位在一0. 4V 一0. 2V或+ 0. 2V + 0. 5V(相对于Ag/AgCl)的范围。
7.如权利要求2 6中任意一项所述的制造方法，其中，步骤(4)中的动物细胞的培养在对所述电极施加一 0. 4V 一 0. 2V(相对于Ag/AgCl)范围的电位、抑制动物细胞对于所述电极的附着的同时进行。
8.如权利要求2 6中任意一项所述的制造方法，其中，步骤(4)中的动物细胞的培养以对所述电极施加正电位、在所述电极上附着动物细胞的方式进行，得到在吸附用表面及电极上附着有动物细胞的基板。
全文摘要
本发明提供不使用微孔就可以将动物细胞分别逐个地配置在基板表面上的新的技术方案。提供含有下述步骤(1)～(3)的用于以阵列状配置动物细胞的基板的制造方法、以及含有下述步骤(1)～(4)的以阵列状配置有动物细胞的基板的制造方法。(1)准备在电极基板表面上以阵列状具有吸附用表面的基板的步骤，(2)在上述基板的电极表面及吸附用表面上吸附细胞外基质的步骤，(3)对上述电极施加微弱电位，将电极表面的细胞外基质剥离，而得到在吸附用表面上吸附有细胞外基质的基板的步骤，和(4)在步骤(3)中得到的基板表面上培养动物细胞，得到在吸附用表面上附着有动物细胞的基板的步骤。
文档编号C12M3/00GK102712898SQ20108004913
公开日2012年10月3日 申请日期2010年10月29日 优先权日2009年10月30日
发明者小山纯弘 申请人:独立行政法人海洋研究开发机构