对辛伐他汀合成表现出改善性质的LovD突变体的制作方法

专利名称：对辛伐他汀合成表现出改善性质的LovD突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于生物合成化合物如辛伐他汀的方法和材料，包括利用微生物宿主的过程。
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背景技术：
辛伐他汀是可分离自土曲霉(Aspergillus terreus)发酵液的天然产物洛伐他汀的半合成衍生物。洛伐他汀和辛伐他汀都是降胆固醇药，能显著降低成人的心脏病风险。洛伐他汀和辛伐他汀由默克公司(Merck Co.)分别作为美降之(Mevacor)和舒降之(Zocor)销售。辛伐他汀是洛伐他汀的更强效衍生物，并在2005年是美国第二畅销药物，单在美国就有45亿美元的预期销售。土曲霉(A. terreus)中用于洛伐他汀生物合成的基因簇(参见例如，J. Kennedy, K.等，Science, 1999，284，1368-1372 ;和 C. R. Hutchinson, J.等，AntonieVan Leeuwenhoek 2000，78，287-295)此前已有描述(参见例如，美国专利号6，391，583，其内容通过引用纳入本文)。在所述基因簇中编码的是46kD的蛋白质LovD，该蛋白最初鉴定为酯酶同系物。洛伐他汀生物合成的直接前体红麴素J(Monacolin J)由上游巨合酶(megasynthase)LovB 组装(参见例如，L. Hendrickson, C. R.等，Chem.Biol. 1999，6，429-439)，(该酶也称为洛伐他汀九酮合成酶，LNKS)，烯酰基还原酶LovC和CYP450氧化酶。五碳单元侧链由LovF (洛伐他汀二酮合成酶，LDKS)通过乙酰-CoA和丙二酰-CoA之间的缩合合成。缩合的二酮由单独LovF结构域进行甲基化和还原性修饰产生共价连接于LovF酰基载体蛋白(ACP)结构域的磷酸泛酰巯基乙胺臂上的a-S-甲基丁酰基硫酯(参见例如，J. Kennedy, K.等，Science, 1999, 284, 1368-1372 和 C. R. Hutchinson, J.等，Antonie Van Leeuwenhoek2000, 78，287-295),随后从红麴素J生成洛伐他汀。在土曲霉中灭活LovD或LovF导致前体红麴素J的积累(参见例如，J. Kennedy, K.等，Science, 1999, 284, 1368-1372 和 C. R. Hutchinson, J.等，Antonie Van Leeuwenhoek2000，78，287-295)。一旦制得洛伐他汀，例如在土曲霉宿主中经发酵制得，可从洛伐他汀生成辛伐他汀。目前，辛伐他汀是洛伐他汀的半合成衍生物。洛伐他汀经土曲霉宿主的发酵获得。纯化该化合物后，如下进行半合成1)2-甲基丁酯侧臂可在碱的存在下水解产生中间体红麴素J;2)将游离酸内酯化；3)将C13处的醇官能团用保护基团(例如，叔丁基二甲基硅烷基)保护；4)将显露的CS醇用酰基底物如2- 二甲基丁酰氯酯化产生C13保护形式的辛伐他汀；以及5)将C13 OH去保护产生辛伐他汀。此前已描述辛伐他汀的各种多步合成(参见例如，PCT WO 2005/066150和美国申请号20050080275与20040068123，其内容通过引用纳入本文)。例如，广泛采用的方法始于洛伐他汀中CS酯的水解产生三醇红麴素J，然后选择性硅烷化C13醇，用二甲基丁酰氯酯化C8醇并使C13醇去保护产生辛伐他汀(参见例如，ff. F. Hoffman,等，J. Med.Chem. 1986，29，849-852)。已研究用脂肪酶和酯酶来酶促转化作为化学衍生的替代(参见例如，PCT WO 2005/040107, PCT WO 94/26920 和 T. G. Schimmel 等，Appl. Environ. Microbiol. 1997,63, 1307-1311，其内容通过引用纳入本文)。但是，区域选择性酯化的要求总是涉及其它醇基团的保护且常引起总体得率降低。因此，能选择性酰化红麴素J的CS的特异性试剂对于辛伐他汀和其它他汀类似物的有效合成很重要。上述方案的变形常见，但是大多数过程总是涉及首先分离洛伐他汀，水解甲基丁酯侧链，保护游离醇，与酰基底物反应，以及去保护。尽管涉及的化学转化相对简单，但它们低效且涉及多个步骤，并因此造成目前制备辛伐他汀的高成本(每颗药3美元)。为此，非常需要能促进高成本效率制备辛伐他汀和相关化合物的方法和材料。

发明内容
如下文详述，现可用LovD酰基转移酶多肽的变体在体外或体内产生辛伐他汀和相关化合物，所述变体经工程改造以显示促进其用于生成辛伐他汀和/或胡伐他汀(huvastatin)的性能。本文所述材料和方法设计成使得能用最少改动将现有洛伐他汀制备的发酵设施转化为制备辛伐他汀和相关化合物。本发明的实施方式提供设计用于利用制备洛伐他汀的生物方法来制备洛伐他汀的衍生物辛伐他汀的方法和材料。本发明还提供设计用于利用制备洛伐他汀的生物方法来制备相关化合物如普伐他汀衍生物胡伐他汀的方法和材料。本发明的实施方式包括的材料和方法可用于产生辛伐他汀而无需目前用来产生该化合物的多个化学合成步骤。本发明的典型实施方式不需要第一步先纯化洛伐他汀然后进一步半合成过程，而是在发酵过程中联用LovD酰基转移酶多肽的变体和酰基硫酯化合物来产生辛伐他汀和/或胡伐他汀的制备。本文公开的发明有多种实施方式。本发明的一种说明性实施方式是SEQ ID NO: I所示LovD多肽的变体，所述LovD多肽变体包含至少一种特定氨基酸取代，例如AlOV ；D12G ；K26E ；C40A ；C60N ；A86V ；H161Y ；A190T ；K227R ；G275S ；V334D ;V334F 和 / 或 L361M。本发明的一种相关实施方式是SEQ ID NO: I所示LovD多肽的变体，该LovD多肽的变体包含一组氨基酸取代，例如一组至少3个氨基酸的取代在C40和C60位置氨基酸残基处的取代，和在下组氨基酸残基位置处的另外至少一种取代A10 ；D12 ；K26 ；A86 ；A190 ；H161 ；K227 ；G275 ;V334 ;或L361。LovD多肽的此类取代变体中，氨基酸取代可包括在SEQ ID NO: I所示LovD多肽上氨基酸残基位置处未见的19种氨基酸中任一种。通常，所述取代变体与SEQID NO: I所示LovD多肽相比呈现一种或多种改变的性质，例如聚集减少；热稳定性改善；催化活性改善值改善；可溶表达水平改善；和/或25° C下的全细胞活性改善。如上所述，本发明的某些实施方式包括氨基酸取代的特定构象。例如，本发明的一些实施方式中，LovD多肽变体包含以下各组位置的氨基酸取代氨基酸残基位置C40、C60和A86 ;或氨基酸残基位置C40、C60、A86和A190 ;或氨基酸残基位置C40、C60、D12、A86和G275 ;或氨基酸残基位置C40、C60、D12、A86、C40、C60、A190和G275 ;或氨基酸残基位置C40、C60、D12、K26、A86、C40、C60、H161、A190 和 G275 ;或氨基酸残基位置 C40、C60、D12、A86、A190 和 G275 ;或氨基酸残基位置 C40、C60、A10、D12、K26、A86、A190 和 G275 ;或氨基酸残基位置 C40、C60、D12、K26、A86、A190 和 G275 ;或氨基酸残基位置 C40、C60、D12、K26、A86、H161、A190、G275、V334 和 L361 ;或氨基酸残基位置 C40、C60、D12、K26、A86、H161、A190、G275和V334。这些变体的具体说明性实施方式包括具有下列氨基酸取代的变体D12G、C40A、C60N、A86V、A190T 和 G275S ;或 D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T 和G275S ;或 D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T ；G275S 和 V334F。本发明的实施方式包括编码本文所述取代变体的多核苷酸，例如，与编码本文所述LovD多肽变体的多核苷酸具有至少95%-100%序列相同性的已分离多核苷酸。本发 明的相关实施方式包括含这些多核苷酸的载体(例如，包括含控制序列的表达载体，所述控制序列被转化有所述载体的宿主细胞所识别)以及含此类载体的宿主细胞。所述宿主细胞可选为大肠杆菌(Escherichia coli), 土曲霉(Aspergillus terreus),红色红曲菌(Monascus ruber),紫红色红曲菌(Monascus purpureus),丛毛红曲菌(Monascuspilosus),玻璃质红曲菌(Monascus vitreus),软毛红曲菌(Monascus pubigerus),卡氏念珠菌(Candida cariosilognicola),米曲霉(Aspergillus oryzea),斯梯蒙特皮真菌(Doratomyces stemonitis)，宛氏拟青霉(Paecilomyces virioti)，桔青霉(Penicillumcitrinum)，产黄青霉(Penicillin chrysogenum),短尾帚霉(Scopulariopsisbrevicaulis),粗糖链抱霉(Neurospora crassa)或绿色木霉(Trichoderma viride)。本发明的相关实施方式是制备LovD多肽变体的方法，包括将转化有LovD多肽变体编码子的宿主细胞在适于表达多肽的条件下培养，从而产生LovD多肽变体。在本发明的某些实施方式中，LovD多肽变体可融合异源氨基酸序列，例如能促进其处理的序列(例如，多组氨酸序列)。本发明的另一实施方式是SEQ ID NO: I所示LovD多肽变体的制备方法，其包括利用多核苷酸诱变方法产生LovD多核苷酸的突变体群；表达由所述LovD多核苷酸的突变体群所编码的LovD多肽变体群；从而制备LovD多肽的变体。所述多核苷酸诱变方法可选为饱和诱变或易错聚合酶链反应法。本发明的这些实施方式通常包括筛选所述LovD多肽变体的一个或多个成员以鉴定出与SEQ ID NO: I所示LovD多肽相比具有以下性质的变体聚集减少；热稳定性改善；酰基转移酶活性改善；kcat/Km值改善；可溶表达水平改善；和/或25° C下的全细胞活性改善。所述多核苷酸诱变过程可选为受控过程，从而在编码以下氨基酸残基位置的密码子处产生取代突变A10 ；D12 ；K26 ；A86 ；A190 ；H161 ；K227 ；G275 ；V334 ;和/或L361。在本发明的相关实施方式中，所述多核苷酸诱变过程受控从而产生的变体包含C40A与C60N ;以及在编码以下氨基酸残基位置的密码子处的其它取代突变A10 ；D12 ；K26 ；A86 ；A190 ；H161 ；K227 ；G275 ；V334 ;和 / 或 L361。本发明的另一实施方式是制备辛伐他汀的方法，其包括以下步骤混合红麴素J ；在LovD酰基转移酶存在下将酰基部分提供给红麴素J的C8羟基的酰基硫酯；和SEQ IDNO: I所示LovD酰基转移酶多肽的某变体，所述LovD酰基转移酶多肽变体包括以下残基位置的至少一个氨基酸取代A10 ；D12 ；K26 ；A86 ；A190 ；H161 ；K227 ；G275 ；V334 或 L361 ;然后允许所述LovD多肽变体利用来自酰基硫酯的酰基以区域选择性酰化红麴素J的CS羟基；从而制得辛伐他汀。在本发明的某些实施方式中，在发酵培养基中混合红麴素J ;酰基硫酯和LovD多肽变体，所述培养基中存在产生所述LovD酰基转移酶的分离生物体，其中所述分离生物体为以下至少一种土曲霉；不表达SEQ ID NO:3所示LovF多肽的土曲霉；大肠杆菌；或不表达SEQ ID N0:4所示bioH多肽的大肠杆菌。可选在此类实施方式中，酰基硫酯选自丁酰基硫酯，N-乙酰基半胱胺硫酯或甲基-巯基乙酸硫酯，包含中等链长(C3-C6)酰基部分和/或能跨越生长在发酵培养基中的大肠杆菌或土曲霉细胞的细胞膜的酰基硫酯(例如，a - 二甲基丁酰基-S-甲基-巯基丙酸酯(DMB-S-MMP)，二甲基丁酰基-S-乙基巯基丙酸酯(DMB-S-EMP)和二甲基丁酰基-S-甲基巯基乙酸酯(DMB-S-MTG)及二甲基丁酰基-S-甲 基-巯基丁酸酯(DMB-S-MMB))。在制备辛伐他汀的方法中，所述分离的生物体可以生长于至少一种以下条件温度为25-40° C ;持续时间为至少4到至少48小时；pH为7-8 ;和/或在含LB、Fl或TB培养基的发酵基质中。所述方法可选进一步包含通过至少一个纯化步骤来纯化由所述方法制得的辛伐他汀，所述步骤包括裂解存在于组合物中的分离生物体的细胞；离心；沉淀辛伐他汀的游离酸形式；将辛伐他汀的游离酸形式转化成辛伐他汀盐；过滤；或高效液相色谱(HPLC)。在某些实施方式中，所述方法制备物质组合物，其所含红麴素J是最初与酰基硫酯混合的红麴素J的0%-1%，所述酰基硫酯在LovD酰基转移酶变体的存在下将酰基部分提供给红麴素J的CS羟基；和/或使得加入组合物的红麴素J中至少95%转化成辛伐他汀。可选在这些方法中，LovD多肽变体包含氨基酸取代D12G、C40A、C60N、A86V、A190T和G275S ；D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T 和 G275S ;或 D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T ;G275S和V334F。本发明的相关实施方式是物质组合物，其包含红麴素J ;在LovD酰基转移酶存在下将酰基部分提供给红麴素J的C8羟基的酰基硫酯；SEQ ID NO: I所示LovD酰基转移酶多肽的某变体，所述LovD多肽变体包括以下氨基酸取代在氨基酸残基位置C40和C60 ；以及以下至少一个氨基酸残基位置A10，D12，K26，A86，A190，H161，K227，G275，V334或L361 ;以及辛伐他汀。本发明的另一实施方式是制备胡伐他汀的方法，其包括以下步骤混合经水解的普伐他汀四醇；在LovD酰基转移酶存在下将酰基部分提供给经水解普伐他汀四醇的CS羟基的酰基硫酯；和SEQ ID NO: I所示LovD酰基转移酶多肽的某变体，所述LovD多肽变体包括在以下氨基酸残基位置的氨基酸取代A10 ；D12 ；K26 ；C40 ；C60 ；A86 ；A190 ；H161 ；K227 ；G275 ;V334和/或L361 ;然后允许所述LovD多肽变体利用来自酰基硫酯的酰基来区域选择性酰化经水解普伐他汀四醇的CS羟基；从而制得胡伐他汀。本发明的相关实施方式是物质组合物，其包含经水解的普伐他汀四醇；在LovD酰基转移酶存在下将酰基部分提供给经水解普伐他汀四醇的C8羟基的酰基硫酯；SEQ ID NO: I所示LovD酰基转移酶多肽的某变体，所述LovD多肽变体包括在以下氨基酸残基位置的氨基酸取代A10，D12，K26，C40，C60，A86, A190, H161, K227, G275，V334和/或L361 ;以及胡伐他汀。可选该LovD多肽变体包含氨基酸取代D12G、C40A、C60N、A86V、A190T 和 G275S ;D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T 和 G275S ;或 D12G、K26E、C40A、C60N、A86V、H161Y、A190T ；G275S 和 V334F。本发明的某些实施方式中，可将其它组分和/或方法步骤与上述的一种或多种方法和材料联用。例如，上述方法还可包含利用高细胞密度发酵来提高用于制备辛伐他汀和/或胡伐他汀的一种或多种LovD酰基转移酶变体的有效浓度，以及优化发酵条件或提高LovD酰基转移酶催化效率等。很多其它组分或方法可用于提高辛伐他汀或能促进辛伐他汀和/或胡伐他汀生成的中间体或相关化合物的制备。本发明的实施方式还包括设计用于促进本发明方法的制品和/或试剂盒。此类试剂盒通常包括根据本发明所述方法使用盒中元件的说明。此类试剂盒可包含经区域化的载体用具以在封闭限制件中容纳一种或多种容器用具如小瓶、管等，各容器用具包含一种待用于本方法的单独元件。一种所述容器可包括小瓶，例如含有编码LovD酰基转移酶变体的质粒，所述质粒可选在微生物宿主如大肠杆菌或土曲霉中，而另一管瓶含有硫酯化合物或类似物，两者均可添加至发酵混合物中以产生辛伐他汀和/或胡伐他汀或类似物。下面描述本发明的补充实施方式。附图简要说明
图I.过量表达酰基转移酶LovD的大肠杆菌菌株用作生物催化剂将红麴素J (MJ)酸和DMB-S-MMP —步转化成辛伐他汀。辛伐他汀酸形式将在低pH下自动转化成内酯形式，而该内酯则在高PH条件下转化成酸形式。野生型LovD的k-为0.6分钟 ' 体内实验显示大肠杆菌YT2中表达的野生型LovD可在12小时内将15mM MJ酸转化成辛伐他汀。图2. (a) SDS-PAGE 凝胶来自大肠杆菌 BL21 (DE3) /pAW31 的 LovD 蛋白(WT) ； (b)分别为LovD蛋白(WT)和A1-A8的天然凝胶，对所有样品DTT固定为2mM。Al相比WT具有稍低的寡聚体；A3消除了大多数寡聚体；A2、A6和A8与WT非常相似；突变体A4、A5和A7因不稳定性而显示较少蛋白；A9因为没有可溶性蛋白而未包括在内。该结果表明只有Cl和C3可引起分子间二硫键。图3.基于从MJ酸和DMB-S-MMP转化的全细胞生物催化活性(灰色柱)和野生型LovD与突变体间可溶性蛋白表达水平的比较(黑色柱)。对于全细胞活性,将LB培养物浓缩10倍以模拟高密度发酵，用15mM MJ酸和18mM DMB-S-MMP比较转化。采用基于8小时的转化来比较野生型LovD和突变体间的全细胞活性。野生型LovD转化归一化至100%，数据点为两次的均值。对于蛋白表达水平试验，从50ml LB培养物中表达蛋白并用Ni-NTA柱纯化。通过Bradford法测定浓度。也将野生型LovD表达水平归一化至100%。突变体的全细胞活性与可溶表达的蛋白质成比例，因此溶解度可能是影响全细胞活性的唯一原因。图4.含第一或第三半胱氨酸改变的突变体与野生型LovD之间基于8小时转化的全细胞LovD活性。野生型LovD转化归一化至100%，数据点为两次的均值。Al显示转化高于其它在第一半胱氨酸位置处的突变体，而N3则在第三半胱氨酸位置中最高。Al和N3都显示全细胞活性比野生型高 25%。图5.辛伐他汀转化随着时间变化。试验条件同前。YT2/A1N3( )结合了 Al和N3的益处，是最快的突变体，转化在8小时内完成。YT2/A1和YT2/N3在10小时内完成反应，YT2/A1的转化稍高于YT2/N3。YT2/pAW31是野生型，其在12小时内转化15mM MJ酸。全细胞活性更高导致反应时间更短。与野生型相比，YT2/A1和YT2/N3都将时间缩短 20%，而YT2/A1N3将时间缩短 50%。图6. YT2/pAW31和YT2/A1N的高细胞密度发酵。对这两个菌株，先将细胞在37° C生长至OD6tltl约为20，然后将温度降至25° C并添加500iU IMIPTG以诱导蛋白质表达。蛋白表达 12小时后，停止葡萄糖补料，pH调至7. 8，缓慢添加15g MJ酸和15ml DMB-S-MMP以开始转化。用HPLC检查转化，一旦反应完成或恒定，即终止反应。通过下游纯化方法回收辛伐他汀。添加底物后细胞密度的极大下降可通过缓慢添加底物降至最小。转化速率最初保持恒定，随时间延长可能LovD蛋白被灭活而缓慢下降。 图7.由LovD催化的反应。LovD负责将MJA经a -S-甲基丁酸侧链的酰化转化成LVA，且还可用DMB-SMMP作为酰基供体合成SVA。图8. LovD的晶体结构及其与EstB的关系。(A) LovD与EstB之间基于结构的序列比对。在序列上方显示指定自LovD结构的二级结构元件。颜色从N末端处的蓝色过渡到C末端处的红色。EstB中的活性位点残基由氨基酸下方的星号标出。⑶显示G5’-LVA复合体的带状图。(C)LovD的结构。绿色突出显示EstB中非保守的区段。投射在活性位点周围的5个环如同接球手手套中的手指。(D)EstB的结构。红紫色突出显示LovD中非保守的区段。(E) LovD和EstB结构的重叠图。注意到LovD上缺失了 EstB中覆盖活性位点的一 个环(残基244_260)。图9. LovD作为辛伐他汀合成酶的定向进化。(A)用基于琼脂扩散的试验在全细胞活性试验中定量SVA的量。在点样反应混合物前将粗糙链孢霉(N. crassa)包埋在琼脂中。编号(1-8)表示添加MJA和DMB-SMMP至表达野生型LovD的大肠杆菌后的不同孵育时间2. 5，4，5. 5，7，8，9，10，12小时。(B) LovD突变体向更高全细胞活性的定向进化。共有7代LovD突变体。4代源自随机诱变，包括Gl, G2. 1，G2. 2，G4. 1，G4. 2和G6。包括G3和G5的2代源自前代突变体的有益突变。G7通过G6在V334和L361位置的饱和诱变衍生得到。含2个氨基酸变化的所有突变体进行定点突变以确定有益或有害突变(G2. I、G4. I和G4. 2)。(X)表明突变体具有比前代降低的全细胞活性。(V )表明突变体具有比前代更高的全细胞活性。

图10. G5突变体的结构提供对于改善催化的认识。在有改善突变体G5中存在的氨基酸变化位置，突出了其通常离活性位点距离远。距离是从氨基酸a碳到LVA的亲核性羟基(C8)。图11. 5种LovD结构重叠的侧视图。该图表明两个结构域间由于G5突变和存在结合键而有铰链旋转。(A)可稳定铰链闭合的两个重要残基(Val86和Leul34)显示为球体。(B)另2个残基(Val334和Asp320)彼此直接接触。G6中的V334D突变可导致Asp334和Asp320间的静电推斥，而G7中的V334F突变可导致苯基侧链和Asp320间的空间位阻。两者都能稳定铰链的闭合。图12.比较结合不同配体的LovD活性位点。(A)G5与底物MJA复合。(B)G5’与产物LVA复合。(C) G5’与产物SVA复合。(D) 3种结构的重叠显示构型变化，特别是在亲核性丝氨酸处，与结合不同配体相关联。虚线代表氢键。活性位点入口在各图的顶部。一些参与配体结合的残基未显示。图13.为了仔细研究引起全细胞活性增加的原因，鉴定并列举了所有改良突变体的动力学参数(keat，Km)、可溶蛋白水平与热稳定性。将LovD突变体的全细胞活性与GO比较，GO的转化速率为I. 7mM/小时，并标准化至I。tMJA的Km于25°C在DMB-SMMP固定在2mM时获得。$ DMB-SMMP的Km在MJA固定于2mM时获得。§可溶蛋白的量从纯化的蛋白水平测定。TTm由圆二色性测量。所有结果表示三次测定的均值土SD。图14. LovD GO和突变体的全细胞活性。在25°C下，GO以每小时 I. 7mM的速率产生SVA。在32°C下，GO, Gl, G2. 1，G2. 2和G3未显示任何活性。在25°C下，G7显示活性比野生型稍高。在37°C下，只有G7保持每小时 0. 4mM SVA的残余活性。图15. LovD突变体的动力学特征。LovD突变体的转换率，针对利用DMB-SMMP为底物生物合成SVA( ，蓝线，keat于左y轴)，利用MB-SMMP( ■，粉线，kcat于左y轴)或LovF( ▲，红线，表观转换率于右Y轴)为底物生物合成LVA。图16. LovD G5’结合于LVA和MJA0 (A) LovD的结构，从N-末端(蓝色)到C-末端(红色)的二级结构元件，以及Lo vD 二级结构的拓扑图(箭头表示￠-片层，长方形表示a -螺旋)。LVA显示为灰色棒形。(B)通向LovD活性位点的带正电通道和带正电脊(圈示区域)可与LovF的ACP结构域和pPant臂相互作用。(C)疏水和芳族氨基酸参与MJA结合口袋。图17.与突变相关关键残基和在结合配体后的移动(A)迭合GO-Semet、G5和G5-MJA的大结构域(残基14-92和204-405)以表示与MJA相互作用的一些关键残基的移动。自GO-Semet到G5的结构域转动关闭Argl73的胍基和MJA的C15羧基之间的缺口，这有利于结合MJA。在G5中Phel48和Tyrl88也更靠近MJA。(B) LovD活性位点中LVA和SVA结合之间的区别。在SVA中添加额外的a-甲基通过接触Phel48产生结构域间的铰链开□。图18就G5中有益突变提出的机制。(A) K26E突变可能通过打散螺旋A表面上成片带正电残基(R22、K23、K26和R28)来改善酶稳定性。该片区在GO-Semet和G5中都圈出以突出显示。(B)G275S突变看来通过添加螺旋I上S278的氢键改善酶的稳定性。图19. LovD的催化残基和提出的LVA生物合成机制。(A)提出的参与LovD反应的残基。(B)LovD(灰色)和EstB(紫红色)之间活性位点残基的迭合。(C)利用MJA和MB-LovF ACP为底物生物合成LVA。Ser76起催化亲核体的作用来催化酯交换反应。Ser76和MJA (C8)的羟基被Tyrl88脱质子化，Tyrl88由Lys79稳定化。图20. X-射线数据采集和原子精修的统计(括号内数字指数据的边界)。
=E |I_〈I>|2/E I2，其中I是观察的强度。两项求和都包括所有输入反射，对超过一种对称等价物取平均。Rut=E If0I-IfcI I/ E |f。!，其中F。和F。分别指观察到和计算所得结构因子。Riis类似于R工#，但基于反射的子集，该子集被保留不用于精密化以供交叉验证(Brunger, A. T. (1992) Nature, 355，472-474)。缩写 R. M. S.表示均方根值。
具体实施例方式本文所述或所引用的技术和过程通常已充分了解并常采用本领域技术人员的常规方法，例如，Ausubel等在威利科学出版社(Wiley Interscience Publishers) 1995年的Current Protocols in Molecular Biology (《最新分子生物学方法》)中描述的广泛应用的分子克隆方法。适用时，除非另有说明，涉及使用市售可得的试剂盒和试剂的过程通常按生产商给出的方案和/或参数进行。除非另外定义，本文使用的所有术语、符号和其它科学术语旨在具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。在一些情况中，本文出于清楚和/或便于引用对具有常规理解含义的术语加以限定，本文中包括此类限定不应理解为表示与本领域常规理解的显著区别。描述适用于本文所公开发明实施方式的方法和材料的公开内容包括，例如，国际
发明者唐奕, 谢新开, 高雪 申请人:加利福尼亚大学董事会