专利名称：检测和/或鉴定腺伴随病毒(aav)序列以及分离所鉴定的新型序列的方法
技术领域：
本发明提供了从组织或细胞来源样品的DNA中检测和分类AAV序列的方法。本发明还提供了用该方法鉴定的AAV序列以及用这些序列构建的载体。
背景技术：
腺伴随病毒(AVV)是细小病毒家族的一个成员，是一个小的无包膜的二十面体， 其基因组为4. 7kb-6kb的单链线性DNA分子。AVV开始时被归为依赖病毒，因为这个病毒是作为纯化的腺病毒株中的污染物而被发现的。AVV的生命周期包括潜伏期和感染期，在潜伏期内，AVV基因组在感染后以位点特异性的方式整合到宿主染色体内，在感染期内，伴随着腺病毒或单纯疱疹病毒的感染，整合的病毒基因组随后恢复、复制并包装成具有感染性的病毒颗粒。AVV因其具有非致病性、广泛的宿主范围包括非分裂细胞以及位点特异性整合等特征而成为一个极具吸引力的基因转移工具。
最近的研究表明，AVV载体是一个优选的基因治疗工具。到目前为止，已经有6个不同血清型的AVV被从人或非人灵长类动物(NHP)体内分离出来并被鉴定。其中，人血清2 型首先被开发为基因转移工具，现已被广泛用于在不同靶组织和动物模型中进行基因转移试验。利用AVV2来源的载体治疗某些人类疾病的临床试验也在进行之中，其中包括囊性纤维化和血友病B。我们所想要的是用于基因转移的AAV来源的载体。
发明内容
本发明的一个方面涉及根据在缺少辅助病毒共感染的情况下AVV的潜伏和整合特性，利用生物信息学分析、PCR扩增以及克隆技术从各种人源及非人灵长类动物(NHP)组织的细胞DNA中检测和鉴定AVV序列的新方法。
本发明的另外一个方面涉及利用本发明的上述方法所检测到的AVV序列的分离方法。本发明还包括利用这些新的AVV血清型制备载体的方法，仅仅根据衣壳的基因序列和i^p/cap基因连接处的结构就可以用这些载体进行血清学和基因转移的研究。
本发明的另外一个方面涉及利用本发明所描述的试剂，如通用引物对/探针和定量实时PCR进行血清学、流行病学、生物分布及传播模式的研究。
本发明的另外一个方面涉及利用RACE和其他分子技术从不同来源的细胞DNA中分离新AVV血清型的完整且有感染性的基因组的方法。
本发明还涉及利用不同来源的辅助腺病毒从人或NHP细胞系中恢复新的AVV血清型基因组的方法。
3 本发明的另一个方面涉及新的AVV血清型、含该血清型的载体及利用该血清型的方法。
从下面对发明的详细描述中可以很容易地理解本发明的这些方面及其他方面。
图IA到IAAAR描述的是至少编码AAV cap蛋白的核酸序列的比对。这些图列出了包含ITR、r印区和衣壳区的如下新型AAV血清型的全长序列新型AAV血清型7 [SEQ IDNO 1],以及以前报道的 AAVl [SEQ IN NO :6]，AAV2 [SEQ ID NO 7]禾口 AAV3[SEQ IDNO :8]。新型AAV血清型AAV8 [SEQ ID NO 4]和AAV9[SEQ ID NO 5]是该共同提交的申请的主题。这个比对中所涉及的本发明的其他新型克隆包括42-2[SEQ ID NO 9], 42-8 [SEQ ID NO 27], 42-15[SEQ ID NO :28]，42_5b[SEQ ID NO :29]，42_lb[SEQ IDNO :30] ；42-13[SEQ ID NO: 31]，42-3a[SEQ ID NO :32]，42-4[SEQ ID NO :33]，42_5a[SEQID NO 34],42-10[SEQ ID NO: 35],42-3b[SEQ ID NO :36]，42-11[SEQ ID NO 37], 42-6b[SEQ ID NO :38]，43-1[SEQ ID NO :39]，43-5 [SEQ ID NO :40]，43-12 [SEQ IDNO :41]，43-20 [SEQ ID NO :42]，43-21 [SEQ ID NO :43]，43-23[SEQ ID NO :44]，43-25[SEQ ID NO :45]，44. 1[SEQ ID NO :47]，44. 5[SEQ ID NO :47]，223. 10[SEQ IDNO 48],223. 2[SEQ ID NO :49]，223. 4[SEQ ID NO :50]，223. 5[SEQ ID NO :51]，223. 6[SEQ ID NO :52]，223. 7[SEQ ID NO 53],A3. 4[SEQ ID NO :54]，A3. 5[SEQ IDNO 55],A3. 7[SEQ ID NO :56]，A3. 3[SEQ ID NO :57]，42. 12[SEQ ID NO :58]，44. 2[SEQID NO :59]。AAVlO [SEQ ID NO :117]，AAVll [SEQ ID NO :118]和 AAV12[SEQ ID NO :119]的特征区域序列也列在图中。AAV基因组结构中的关键标记也在图中标识出来。断裂的空间用黑点表示。AAV1[SEQ ID NO 6]的3，ITR用与以前报道的序列同样的结构表示。TRS代表末端进化位点。要注意的是AAV7是所报道的唯一利用GTG作为VP3起始密码子的AAV。
图2A到2F显示的是以前所报道的AAV血清型1 [SEQ ID NO 64], AAV2 [SEQ IDNO 70], AAV3 [SEQ ID NO :71]，AAV4 [SEQ ID NO :63]，AAV5 [SEQ ID NO :114]，和 AAV6[SEQ ID NO 65]以及本发明的新型AAV序列的vpl衣壳蛋白的氨基酸序列的比对，本发明的新型 AAV序列包括Cl [SEQ ID NO :60]，C2 [SEQ ID NO :61]，C5 [SEQ IDNO 62], A3-3 [SEQ ID N0: 66], A3-7 [SEQ ID NO :67]，A3_4[SEQ ID NO :68]，A3-5 [SEQID NO :69]，3. 3b [SEQ ID NO: 62]，223.4[SEQ ID NO :73]，223-5[SEQ ID NO :74]，223-10[SEQ ID NO 75],223-2[SEQ ID NO :76] ,223-7 [SEQ ID NO :77]，223-6 [SEQID NO :78]，44-1 [SEQ ID NO :79]，44-5 [SEQ ID NO :80]，44-2[SEQ ID NO :81]，42-15[SEQID NO :84]，42-8[SEQ ID NO :85]，42-13[SEQ ID NO :86],42-3A[SEQ ID NO :87]，42-4[SEQ ID NO :88]，42_5A[SEQ ID NO :89]，42-1B[SEQ ID NO :90],42-5B[SEQ IDNO :91]，43-1[SEQ ID NO :92]，43-12[SEQ ID NO :93]，43-5[SEQ ID NO :94]，43-21[SEQID NO :96]，43-25[SEQ ID NO :97]，43-20[SEQ ID NO :99]，24. 1[SEQ ID NO :101]，42. 2[SEQ ID NO 102],7.2[SEQ ID NO :103]，27. 3[SEQ ID NO : 104]，16. 3[SEQ IDNO :105]，42.10[SEQ ID NO : 106]，42-3B[SEQ ID NO : 107]，42-11[SEQ ID NO: 108]， Fl[SEQ ID NO :109]，F5[SEQ ID NO :110]，F3[SEQ ID NO :111]，42_6B[SEQ ID NO :112]， 42-12[SEQ ID NO :113] 新血清型 AAV8[SEQ ID NO :95]和 AAV9[SEQ ID NO :100]是此共同提交的专利申请的主题。
图3A到3C显示的是AAV7 rep蛋白[SEQ ID NO 3]的氨基酸序列。
具体实施例方式在本发明中，发明者发现了一种方法可以利用腺伴随病毒(AVV)在缺少辅助病毒共感染的情况下具有穿过细胞核整合到细胞DNA并达到潜伏感染的能力。该方法利用聚合酶链式反应(PCR)为基础的技术可以从人和非人灵长类动物来源的或其他来源的组织DNA 内检测、鉴定和/或分离AVV序列。另外，该方法还适于检测、鉴定和/或分离如下所描述的其他整合的病毒及非病毒序列。
本发明还涉及利用本发明的方法所鉴定的核酸序列。其中一种腺伴随病毒是一个新的血清型，本文中被称为血清型7 (AVV7)。本文所涉及的其他新型腺伴随病毒血清型包括 AAVlO, AVVll和AVV12。其他利用本发明的方法所鉴定的新型AVV血清型也包括在本说明书中。参见附图和所列的序列，本文已纳入作为参考。
本发明还涉及这些AAV序列的片段。其中特别有意义的AAV片段是cap蛋白，包括vpl、vp2、vp3和超变区，rep蛋白，其中包括r印78、r印68、rep52和r印40，以及编码这些蛋白的序列。这些片段都可被用于各种载体系统和宿主细胞中。这种片段可以单独使用， 也可以和其他AAV序列或片段、或者其他AAV或非AAV病毒序列的元件联合使用。在一个特别优选的实施方式中，载体含有本发明的AAV cap和/或rep序列。
如本文所描述，核酸序列是用任何一种公用的或商业的多序列比对程序如 "Clustal W”来比对的，这些程序可从互联网的服务器上下载。另外，还使用了 VectorNTI 程序。还可以使用本领域所熟知的许多算法来测算核苷酸序列的同一性，其中包括那些上面所描述的程序中的序列。另外，多聚核苷酸序列还可用i^asta进行比较，这是GCG 6. 1版本中的一个程序。Fasta能将所查询的序列与所检索到的序列之间最佳重叠区域进行比对并计算出其序列同一性的百分率。例如，两个核酸序列之间同一性的百分率可以利用Fasta 软件，参考GCG 6. 1版本中所提供的默认参数(字号为6，评分矩阵采用NOPAM因子)来确定，本文已纳入作为参考。氨基酸序列也可用相似的程序来处理，如“Clustal X”程序。一般来说，这些程序的设置都是默认的，但是如果有必要本领域的技术人员也可以改变这些设置。另外，本领域的技术人员也可以使用其他的算法或计算机程序，只要这些程序能如参考算法和程序一样测算序列的同一性或比对核酸序列。
术语“基本同源”或“基本一致”用于核酸或核酸片段时是指在一个核酸序列中适当插入或删除一些核苷酸后与另一个核酸序列比较，其核苷酸序列同一性至少占到所比较序列的95%到99%。当称两个序列同源时必须比较其全长序列、其开放阅读框架或至少含 15个核苷酸的适宜核酸片段。适宜核酸片段的例子在本文中有描述。
术语“基本同源”或“基本一致”用于氨基酸或其片段时是指在一个氨基酸片段中适当插入或删除一些氨基酸后与另一个氨基酸片段比较，其氨基酸序列同一性至少占到所比较序列的95%到99%。当称两个序列同源时必须比较其全长序列、其蛋白质如cap蛋白、I^P蛋白，或至少含8个氨基酸的适宜片段，较好的是含15个氨基酸的片段。适宜片段的例子在本文中有描述。
术语“高度保守的，，是指至少80 %的序列同一性，优选的为至少90 %的序列同一性，更优选的为超过97%的序列同一性。本领域的技术人员可以很容易地通过本领域所熟知的算法和计算机程序来确定序列的同一性。
术语“序列同一性百分率”或“一致的”用于核酸序列时是指当将两个序列一起比对时其核苷酸残基是一样的。序列同一性比较的长度可以超过基因组的全长，基因编码序列的全长，或至少约含500-5000个核苷酸的片段。但是，也可以比较小片段之间的同一性， 如约含9个核苷酸的片段，通常含至少约20-M个核苷酸、至少约观-32个核苷酸、至少约 36个或更多个核苷酸。同样，“序列同一性百分率”也可以用于确定氨基酸序列，确定全长蛋白质或其片段的同一性。适宜的片段至少约含8个氨基酸，也可以最多达700个氨基酸。 适宜片段的例子在本文中也有描述。
AAV序列及其片段可用于制备rAAV，也可作为反义转移载体、基因治疗载体或疫苗载体。本发明还涉及核酸分子、基因转移载体以及含本发明的AAV序列的宿主细胞。
如本文所描述，含本发明所述的AAV衣壳蛋白的本发明的载体特别适用于利用中和抗体消除AAV血清型来源载体以及其他病毒载体的效应。本发明的rAAV载体特别适合 rAAV再注射和重复的基因治疗。
本发明的这些和其他实施方式以及优点下面有更详细的描述。如本说明书和权利要求书中所描述的，术语“含有”和“包括”以及其他类似的词语是指还可以包含其他的部分、元件、整体、步骤等。相反的，术语“由...组成”及其类似的词语是指不包含其他的部分、元件、整体、步骤等。
I.本发明的方法 A.通过分子克隆技术检测序列 本发明的一个方面涉及检测和/或鉴定样品中靶核酸序列的方法。该方法特别适于检测整合到细胞染色体上的病毒序列，如腺伴随病毒(AAV)和逆转录病毒等。本说明书以AAV为参照，以它为例子进行说明。但是，根据本说明书，本领域的技术人员也可以很容易地利用逆转录病毒(如猫白血病病毒(O^eLVhHTLVI和HTLVII)和慢病毒(如人免疫缺陷病毒(HIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马感染性贫血病毒、以及泡沫病毒)等来实施本发明。另外，本发明的方法还可用于检测整合到宿主细胞染色体内或未整合到宿主细胞染色体内的其他病毒或非病毒序列。
本文所描述的样品可以是任何含核酸的样品，如组织、组织培养物、细胞、细胞培养物、以及生物液体，其中包括而不限于尿液和血液。这些核酸序列可以是质粒来源的DNA 或RNA、任何来源的天然DNA或RNA，其中包括细菌、酵母、病毒、以及较高等的生物如植物或动物。DNA或RNA的提取可以使用本领域技术人员所熟知的任何方法，如Sambrook编写的“分子克隆实验室手册”(Molecular Cloning =ALaboratory Manual)(纽约冷泉港实验室)所描述的方法。样品的来源以及提取核酸的方法并不是对本发明所作出的限制。另外，本发明的方法可以直接用于含DNA的样品或从该样品中得到(或提取)的核酸。
本发明的方法包括利用聚合酶链式反应(PCR)扩增含DNA的样品，所用的第一组引物是双链核酸序列第一区特异性的，因此可以得到扩增序列。
如本文所描述，每个区域都是基于至少两个血清型(即AAV)或病毒株(即慢病毒)的核酸序列的比对而确定的，其中所述每个区所含有的序列5’末端高度保守，中间部分优选可变的但不是必须的，3’末端也是高度保守的，这些序列保守或可变是相对于至少两个比对的AAV血清型的序列而言的。5’和/或3’高度保守的核苷酸至少约有9个，较好的是至少有18个碱基对。对于可变区来说，不需要有保守的序列，这些序列可以是相对保守的，即比对的血清型或病毒株之间具有小于90^^80%或70%的同一性。
每个区可以跨越约IOObp到101Λ碱基对的长度，但是特别优选的是其中一个被称为特征区域的，即该区具有足够的独特性，能用来鉴定靶组织来源的扩增序列。例如，在一个实施方式中，第一区是一个约250bp的片段，与任何已知的AAV序列都能区别开，该序列是AAV来源的经正性鉴定的扩增区。而且，该区内的各种序列都具有足够的独特性，可用于鉴定扩增序列所来源的血清型。一旦被扩增(及被检测)后，序列可用常规的限制性酶切他任何经本发明鉴定的新血清型内该区的限制性酶切图谱比较就可以鉴定该序列。上述血清型都是本发明所鉴定和涉及的。
根据本文所描述的方法，本领域的技术人员可以很容易地鉴定其他整合病毒上的这种区，并且易于检测和鉴定这些序列。因此，一对理想的通用引物应被设计在高度保守的末端，这组引物可用于扩增样品中所选择的区。本发明的这一方面可用于设计检测靶序列 (如AAV)是否存在以及鉴定AAV血清型的诊断试剂盒，所用的判断标准可以包括本文所描述的或利用本文所描述的技术分离出的血清型的限制性酶切图谱。例如，PCR产物的快速鉴定或分子血清型的确定可以通过酶切PCR产物并与限制性酶切图谱比较来完成。
因此，在一个实施方式中，AAV的“特征区域”可能跨越AAV 1 [SEQ ID NO 6]的约 2800到3200区域，以及AAV 2、AAV3、AAV4、AAV5和AAV6上的相应区域。优选的区域约为 250bp，位于 AAV 1[SEQ ID NO 6]的 2886 到 3143 区，以及 AAV 2 [SEQ IDNO 7], AAV3 [SEQ ID NO 8]以及其他AAV血清型上的相应区域。见图1。为了快速检测样品中的AAV，所用的引物为该特征区域特异性的。但是，本发明并不仅限于那些与本文所鉴定的AAV特征区域完全相配的序列，本领域的技术人员可以对这个区加以改动，使之成为比特征区域短点或长点的片段。
PCR引物是用本领域技术人员所熟知的方法合成的。每对PCR引物都由5’引物和 3’引物组成，见Sambrook等，本文已引用。术语“引物”指一个寡核苷酸片段，在适当的条件下，与核酸链互补的引物延伸产物在该点开始合成。但是，也可以使用双链引物，只要在制备延伸产物前将其处理使之分开就可以了。引物含有约15到25个或更多个核苷酸，优选至少18个核苷酸。但是在某些情况下较短的如7到15个核苷酸也可以使用。
引物要选择与所要扩增的特定序列的不同链足够互补的序列，并且还能与其各自的链杂交。因此，引物序列并不需要是所要扩增区域的精确序列。例如，可以将一段非互补的核苷酸片段连接到引物的5’末端，但是剩余的引物部分要与该链完全互补。另外，非互补碱基或较长的序列可以分散在引物内，只要引物序列与所要扩增的序列足够互补，能与之杂交，该链可以作为模板来合成引物的延伸产物就可以了。
根据本发明，特征区域的PCR引物是基于两个或多个比对序列(即两个或多个AAV 血清型)的高度保守区而设计的。引物的序列在5’末端或中间可以加以改动，并不一定要和两个或多个比对的AAV血清型完全互补。但是，引物的3’末端至少要有5个以上的核苷酸是与两个或多个比对的AAV血清型完全互补的，优选9个以上的碱基对完全互补，更优选的是18个碱基对完全互补。这样，引物的3’末端由至少5个与比对序列100%—致的核苷酸组成。但是，也可以在引物的3’末端加上1、2、或多个变性的核苷酸。
例如，AAV特征区域的引物对是基于AAV衣壳内的如下特异区而设计的。5’弓丨物是基于 AAV2[SEQ ID NO 7]的 nt 28674891，5，-GGTAATTCCTCCGGAAATTGGCATT3，，见图 1。 3，引物是基于 AAV2[SEQ ID NO 7]的 nt 2867-2891,5'-GACTCATCAACAACAACTGGGGATTC-3‘ 。但是，本领域的技术人员可以基于MV 1^4￥3，狀￥4^4￥5^4￥6的相应区域，或基于4八￥7， AAV10, AAVl 1, AAV12或本发明的其他AAV所提供的信息来设计引物对。另外，还可以利用本领域技术人员所熟知的方法设计其他的引物对来扩增这个特征区域。
B.靶序列的分离 如本文所描述，本发明的第一引物对用于特异性地扩增靶序列即AAV血清型的特征区域，以便于检测该靶序列。如果还需要检测其他的序列，即，如果需要鉴定一个新的血清型，那么特征区域需要延伸，这样，本发明还需要一个或多个附加的引物对。这些引物对适宜设计成包含第一引物对的5’引物或3’引物和该引物对独特的第二引物，这样，该引物对可以扩增出特征区域的5’区或3’区，该序列与特征区域的5’末端或3’末端互补。例如，第一引物对由5’引物Pl和3’引物P2组成以扩增特征区域。为了延伸特征区域的3’ 末端，第二引物对应由引物Pl和3’引物P4组成，该引物对可以扩增特征区域及其下游的序列。为了延伸特征区域的5’末端，第三引物对应由5’引物P5和引物P2组成，该引物对可以扩增特征区域及其上游的序列。如果需要，这些延伸步骤可以重复(或同时进行)。因此，从这些扩增步骤中得到的产物与常规步骤所得到的产物接合就得到了所需要长度的独立序列。
第二和第三引物对与特征区域的引物对一起用于扩增比对序列上的高度保守区。 本文所用的术语“第二”或“第三”引物对只是为了便于描述，并不表示这些引物添加到反应混合物中或用于扩增的顺序。第二引物对所扩增的区域是经过选择的，这样一旦扩增出来后其5’末端就可以与特征区域的3’末端互补杂交。同样，第三引物对所扩增的区域也是经过选择的，这样一旦扩增出来后其3’末端就可以与特征区域的5’末端互补杂交。还可以设计出其他的引物对，这些引物对所扩增的区域可以与第二或第三引物对以及下面的引物对扩增产物的5’末端或3’末端互补杂交。
例如，如果以AAV为靶序列，第一引物对(Pl和P2)用于从样品中扩增特征区域。 在一个优选实施方式中，特征区域位于AAV衣壳之内。第二引物对(Pl和P4)用于将特征区域的3’末端延伸到AAV序列3’ ITR之前的区域，即以特征区域为锚扩增出含AAV衣壳整个3，末端的产物。在一个实施方式中，P4引物位于AAV2[SEQ ID NO 7]的nt 4435-4462， 以及其他AAV血清型的相应序列上。结果得到一个约1. 6kb的产物，该产物含有0. 25kb的特征区域。第三引物对(P3和P2)用于将特征区域的5’末端延伸到AAV序列rep基因的 3’末端，即以特征区域为锚扩增出含AAV衣壳整个5’末端的产物。在一个实施方式中，P3 引物位于AAV2[SEQ ID NO 7]的nt 1384-1409，以及其他AAV血清型的相应序列上。结果得到一个约1. 7kb的产物，该产物含有0. 25kb的特征区域。另外，第四引物对用于将含AAV 衣壳整个5’末端的延伸产物进一步延长到包含rep序列。在一个实施方式中，P5引物位于 AAV2 [SEQ ID NO 7]的nt 108-133，以及其他AAV血清型的相应序列上，与P2引物合用。
完成了所希望数量的延伸步骤之后，利用特征区域为锚或标记将各种延伸产物连接起来就得到了一个完整的序列。在本文所描述的一个实施例中，至少含有一个完整的AAV cap基因的AAV序列被扩增出来，当然也可以扩增出更大的序列，这要根据所进行的扩增步骤的多少。
8 将延伸产物组装成一个完整的AAV序列所用的方法是本领域技术人员所熟知的。 例如，用DraIII消化扩增产物，可以在特征区域的DraIII位点上将其裂解，得到一个限制性酶切片段，将此片段与含完整AAV cap基因分产物从新连接起来。但是也可以利用其他合适的技术将延伸产物组装成一个完整的序列，见Sambrook等，本文已引用。
除了上面所描述的多步骤延伸方法，本发明的另外一个实施方式是直接扩增出一个3. Ikb的片段，该片段含有全长的cap序列。为了从NHP组织或血液DNA中直接扩增3. Ikb的全长cap片段，需要鉴定AAV基因组中其他两个高度保守区以便于用PCR方法扩增这个大片段。保守区内的一个引物位于r印基因的中间(AVlns 5，GCTGCGTCAACTGGACCAATGAGAAC 3，，SEQ ID NO 6 的 nt)，另一个引物位于 cap 基因下游的另一个保守区内(AV2cas :5，CGCAGAGACCAAAGTTCAACTGAAACGA 3，，SEQ IDNO :7)，而这结合可以扩增出含全长cap基因的AAV序列。一般来说，扩增完成以后，产物经克隆和测序其准确率都可以达到99. 9以上。利用该方法，发明者至少分离出50个衣壳克隆并随之进行了鉴定。其中37个克隆来源于猕猴(rh. 1-rh. 37)，6个克隆来源于短尾猴(cy. 1-cy. 6),2 个克隆来源于狒狒(bb. 1和bb. 2)，5个克隆来源于黑猩猩(ch. 1-ch. 5)。这些克隆在说明书的其他地方也作了鉴定，连同其来源的物种以及存在新型序列的动物组织。
C.分离新型AAV的其他方法 本发明的另外一个方面涉及从细胞中分离新型AAV的其他方法。该方法包括用具有AAV辅助病毒功能的载体感染细胞；分离含AAV的感染克隆 ’分离AAV的测序；以及将分离的AAV序列与已知的AAV血清型进行比较，如果分离的AAV与已知的AAV血清型序列有区别就说明存在新型AAV。
在一个实施方式中，具有辅助功能的载体提供了腺病毒的基本功能，包括如Ela， Elb，E2a，E40RF6。在一个实施方式中，辅助功能是由腺病毒提供。腺病毒可以是野生型的， 可以是人源的也可以是非人源的，最好是非人灵长类动物(NHP)来源的。各种腺病毒的DNA 序列可以从Genbank上找到，包括Ad5型[Genbank登录号M73^0]。腺病毒序列可从已知的任何类型的腺病毒中获得，如血清型2，3，4，7，12和40，还包括任何本发明已经鉴定的人源类型[见Horwitz，上面已引用]。同样，已知可以感染非人动物(如黑猩猩)的腺病毒也可用于构建本发明的载体。见美国专利No. 6，083，716。除了野生型腺病毒之外，具有必须辅助功能的重组病毒或非病毒载体(如质粒、游离体等)也可使用。这些重组病毒是本领域所熟知的，可以通过已发表的方法制备。见美国专利No. 5，871，982和6，251，677，其中描述了一种杂合的Ad/AAV病毒。对腺病毒类型的选择并不预示着对下列发明的限制。从美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection, Manassas, Virginia)可以得到各种腺病毒株，另外也可以从各种商业机构或研究机构获得。而且，许多这种病毒株的序列都可以从各种数据库中查询到，如PubMed和GenBank。
另外，感染性AAV可以用基因组步行技术(Siebert等，1995，Nucleic Acid Research,23 :1087-1088, Friezner-Degen φ,1986, J.Biol.Chem. 261 :6972-6985, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)分离。基因组步行技术特别适于鉴定和分离与本发明方法所鉴定的新型序列相邻的序列。例如，这个技术可用于分离新型AAV血清型的反向末端重复序列(ITR)，其根据就是用本发明的方法鉴定的新型AAV的衣壳和/或rep序列。该技术也可用于分离与本发明所鉴定和分离的其他AAV或非AAV序列相邻的序列。见实施例3和4。
本发明的方法可用于各种流行病学研究，生物分布研究、通过AAV载体或其他整合病毒来源的载体进行基因治疗的检测。因此，这些方法可用于制备预包装的试剂盒便于临床医生、研究人员和流行病学家使用。
II.诊断试剂盒 本发明的另外一个方面涉及检测样品中是否已知的或未知的腺伴随病毒(AAV)。 这种试剂盒包括AAV核酸序列特征区域特异性的第一对5’和3’PCR引物。另外，该试剂盒还可以包含3. Ikb片段特异性的第一对5’和3’ PCR引物，该片段含有本文所鉴定的全长 AAV衣壳核酸序列(即AVlns和AV2cas引物)。试剂盒还可以任选添加本文所描述的两对或多对5’和3’弓丨物，以及PCR探针。这些引物和探针按照本发明可用于扩增每种AAV血清型的特征区域，如用定量PCR方法。
本发明还涉及用于鉴定用本发明的方法检测到的AAV血清型，和/或将新的血清型与已知的血清型区别开来。这种试剂盒还包含一种或多种限制性内切酶，AAV血清型的标准以用于“标记的限制性酶切分析”，和/或其他确定所检测到的AAV血清型的试剂。
另外，本发明的试剂盒还包含说明书、阴性和/或阳性对照、容器、样品的稀释液和缓冲液、标记比较的对照表、一次性手套、防污染说明、加样棒或容器、样品制备试管、以及其他任何需要的试剂，如介质、洗涤试剂和浓缩试剂。这些试剂可从本文所描述的试剂中选择，液可以从常规的试剂中选择。在一个优选实施方式中，洗涤试剂是等渗盐溶液，可用于缓冲生理pH，如磷酸缓冲盐(PBS)；洗脱试剂是含0.4M NaCl的PBS，以及浓缩试剂和设备。例如，本发明的技术人员都知道可以使用试剂如聚乙烯甘油(PEG)或NH4SO4，设备如过滤装置。例如，含有100K膜的过滤装置可以浓缩rAAV。
本发明的试剂盒可用于实现本文所描述的方法，也可用于生物分布、流行病学、新型AAV病毒在人和NHP传播模式的研究。
因此，本发明的方法和试剂盒可用于靶病毒序列的检测、鉴定和分离。该方法和试剂盒特别适用于检测、鉴定和分离AAV序列，其中包括新的AAV血清型。
在一个值得注意的实施例中，发明者利用本发明的方法促进了对克隆AAV序列的分析，结果显示不同动物来源的克隆片段之间的原病毒序列具有异质性，所有的序列都与已知的6个AAV血清型不同，其变异区主要集中在衣壳蛋白的超变区。令人吃惊的是AAV 序列的分散性在从一个短尾猴的单一组织如淋巴结中分离出来的克隆中特别明显。这种异质性的最好解释是动物个体内AAV序列存在明显的进化，部分可能是由于有限数目的共感染亲本病毒之间发生同源重组。这些研究说明天然AAV感染过程中广泛传播病毒的序列进化可能导致了一群准种的形成，这种准种在衣壳超变区的比对上是互不相同的。这是第一个DNA病毒发生快速分子进化的例子，这种方式以前被认为只发生于RNA病毒。
本文描述了几种用本发明的方法鉴定的新型AAV血清型及其特征。
III.新型AAV血清型 A.核酸序列 本文描述了用本发明的方法所鉴定的新型AAV血清型的核酸序列。见SEQ IDNO 1,9-59,以及117-120，本文已纳入作为参考。也可参见图1和表中所列的序列。
新血清型AAV7的全长序列，包括AAV 5’ ITR，衣壳，r印，和AAV 3’ ITR显示在SEQ
10ID NO 1 中。
对于本发明的其他新的AAV血清型，本文描述了按照本发明的方法分离的约 3. Ikb的片段。该片段含有编码全长衣壳蛋白的序列和编码！·印蛋白的全部或部分序列。 这些序列包括下面所鉴定的克隆。
对于其他的新AAV血清型来说，本文描述了编码衣壳蛋白的特征区域。例如，本发明的AAVlO核酸序列包含了图1所显示的序列[见SEQ ID NO :117，255bp长]。本发明的 AAVll核酸序列包含了图1所显示的序列[见SEQ ID NO :118，258bp长]。本发明的AAV12 核酸序列包含了图1所显示的序列[见SEQ ID N0:119，255bp长]。利用本文所描述的方法，AAV10、AAV11和AAV12序列可以很容易地被鉴定，并用于各种目的，如AAV7和本文所描述的其他新血清型所用的各种目的。
图1显示的是本发明的非人灵长类(NHP)AAV核酸序列，以前文献所报道的AAV血清型 AAV 1[SEQ ID NO :6]、AAV2[SEQ ID NO 7]和 AAV3[SEQ ID NO 8]与其一起比对。这些新型NHP序列包括下面表1中所列的序列，该序列是通过克隆数目来鉴定的。
表 1
权利要求
1.一种腺伴随病毒(AAV)载体，所述载体包括AAV衣壳，该衣壳包含至少一个AAV 8 vp3衣壳蛋白，该蛋白具有包含SEQ ID NO :95的氨基酸203-738的序列或者与其有至少 95%同一性的氨基酸序列，所述衣壳具有包封在其中的具有AAV反向末端重复序列和与调节序列操作性连接的异源基因的小基因，所述调节序列指导所述异源基因在宿主细胞内表达。
2.如权利要求1所述的AAV，其特征在于，所述AAV衣壳包含氨基酸序列vp2衣壳蛋白， SEQ ID NO 95 的 aa 138-738。
3.如权利要求1所述的AAV，其特征在于，所述AAV衣壳包含氨基酸序列vpl衣壳蛋白， SEQ ID NO 95 的 aa 1-738。
4.如权利要求1所述的AAV，其特征在于，所述AAV衣壳由选自以下的核酸序列编码vpl, nt 2121-4335 ；vp2, nt 2532-4335 ；和vp3, nt 2730-4335 ；其中所述核苷酸编号是AAV8，SEQ ID NO 4的。
5.如权利要求1所述的AAV，其特征在于，所述AAV衣壳是还包含与AAV8vp3异源的氨基酸序列的人工衣壳。
6.如权利要求1所述的AAV，其特征在于，所述AAV通过重组方法制得。
7.如权利要求1所述的AAV，其特征在于，所述反向末端重复序列来自AAV8以外的 AAV,由此提供假型AAV。
8.如权利要求1所述的AAV，其特征在于，所述异源基因选自因子VIII序列、α-1抗胰蛋白酶序列和HIV序列。
9.如权利要求1所述的AAV，其特征在于，所述表达控制元件包括组织特异性启动子。
10.如权利要求9所述的AAV，其特征在于，所述组织特异性启动子是肝脏特异性启动子。
11.一种制备如权利要求1-10中任一项所述的包含AAV血清型衣壳的重组腺伴随病毒 (AAV)的方法，所述方法包括培养宿主细胞的步骤，该宿主细胞包含(a)编码AAV衣壳的分子，所述AAV衣壳包含至少一个AAV8 vp3衣壳蛋白，该蛋白具有包含SEQ ID NO :95的氨基酸203-738的序列或者与其有至少95%同一性的氨基酸序列；(b)功能性r印基因；(c)包含AAV反向末端重复序列(ITR)和转基因的小基因；以及(d)能将该小基因包装到AAV衣壳蛋白中的足够的辅助功能。
12.一种用于制备如权利要求1-10中任一项所述重组腺伴随病毒(AAV)的包装宿主细胞，所述宿主细胞包含编码AAV衣壳蛋白的分子，所述AAV衣壳蛋白具有AAV8 vp3衣壳蛋白，该蛋白具有包含SEQ ID NO :95的氨基酸203-738的序列或者与其有至少95%同一性的氨基酸序列；具有AAV反向末端重复序列和与调节序列操作性连接的异源基因的小基因，所述调节序列指导所述异源基因在宿主细胞内表达；和功能性rep基因。
13.—种在包含如权利要求1-10中任一项所述腺伴随病毒的培养基中的宿主细胞。
14.一种包含如权利要求1-10中任一项所述AAV和生理相容性载体的组合物。
15.如权利要求1-10中任一项所述腺伴随病毒在制备用于将转基因递送到细胞的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了从组织或细胞来源样品的DNA中检测和分类AAV序列的方法。本发明还提供了用该方法鉴定的AAV序列以及用这些序列构建的载体。
文档编号C12R1/93GK102181480SQ20111008189
公开日2011年9月14日 申请日期2002年11月12日 优先权日2001年11月13日
发明者G·高, J·M·威尔森, M·阿尔维拉 申请人:宾夕法尼亚州立大学托管会