专利名称：：一种重组腺相关病毒载体感染滴度的测定方法一种重组腺相关病毒载体感染滴度的测定方法由2型腺相关病毒(Adeno-associatedVirusType2,AAV2)改造而来的重组腺相关病毒载体(简称rAAV2、或AAV2)是一种安全、有效的基因转移载体，被广泛用于人类基因治疗研究和基因功能研究中。[1][2]AAV2载体的滴度测定通常分物理滴度和感染滴度。物理滴度通常采用点杂交(dot-blothybridization)或定量PCR的方法，测定病毒载体的基因组(vectorgenome,vg)[3][4]，或采用光密度法测定纯化后的AAV2载体W。感染滴度(又称活性滴度)测定方法比较复杂，由于AAV2感染细胞不会像腺病毒等病毒那样引起细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE)，因此无法用噬斑法测定AAV2载体的活性(感染滴度)。目前常用的AAV2感染滴度测定方法为"感染中心法"(infectiouscenterassay,ICA)，将梯度稀释的AAV2载体和野生型腺病毒(wtAd5)共同感染携带AAV2的rep-c叩基因的重组Hela细胞株，培养一定时间后，将细胞转移到膜上，用3￥标记的探针进行原位杂交，通过对杂交阳性细胞的计数得到病毒的感染滴度。ICA法的主要缺点是，对单个杂交阳性细胞的逐一计数误差较大，另外，细胞转膜杂交技术的稳定性较差[7J。本文建立了一种新的AAV2感染滴度的测定方法，其原理是利用我们以前构建的一株携带AAV2的rep-cap基因的人l型单纯疱疹病毒(HerpesSimplexVirustype1,HSVI)HSVl-rc/AUL2[8][9](HSVl-rc/AUL2是我们用于AAV2载体生产的辅助病毒，又称HSVl—re,中国专利号ZL98120033.8)，毒种保藏号CGMCC2161。HSVl-rc/AUL2和待测滴度的AAV2载体样品共同感染BHK-21细胞(也可以是其它HSV1敏感细胞，比如HEK-293、Hela、Vero、A549等)，前者支持AAV2载体基因组在细胞中复制，通过对AAV2载体基因组的增殖倍数的比较，得到载体的感染滴度。具体方法是，AAV2载体样品经过梯度稀释，分别感染96孔板中的BHK-21细胞，同时感染HSVl-rc/AUL2，48小时后裂解细胞，释放DNA，将裂解液转膜，经过DNA探针杂交，通过与AAV2载体标准品比较，得到待测AAV2样品的相对感染滴度。本文方法首次报道用携带rep-cap基因的辅助病毒取代野生型腺病毒HSVl-rc/AUL2和携带AAV2的rep-cap基因的重组Hela细胞株，进行AAV2感染滴度检测的方法。与ICA法相比，由辅助病毒携带的rep和cap基因的表达量在理论上远高于整合在细胞基因组中的rep和cap的表达量，AAV2基因组的扩增数理论上会有较大幅度提高，从而提高检测的灵敏度。另外，对细胞进行整体裂解释放AAV2载体基因组DNA，并用梯度稀释及终点判断的方法取代了杂交阳性细胞计数，减少了系统误差，操作更简单、实验结果更稳定。除了目力判断终点外，还可以采用扫描后软件(比如BandScan软件等)自动计算的方式对滴度进行定量。本方法对待检样品的纯度和剂量等要求较低，可以对细胞裂解液、培养基上清、生产中间样品、终产品等各种样品进行AAV2滴度的相对定量测定。除了AAV2载体，本方法还可用于所有使用AAV2的ITR的AAV杂合载体(比如AAV2/1、AAV2/3、AAV2/4、AAV2/5、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8等)的活性滴度检测。本方法已经在AAV2生产服务中得到了迅速应用，其中包括高产细胞筛选、产量预测、生产工艺优化等，均取得了良好的效果，促进了AAV2载体生产水平的提高，该方法的应用仍在不断开发中。实施例实施例lAAV2载体的生产和纯化文中所有AAV2载体的生产均采用上文提到的HSVl-rc/AUL2辅助病毒生产系统[9]和与之相配套的分离粗纯化方法[1()]，并通过柱层析精纯化得到。具体方法是，构建含目的基因的载体质粒，将其转染入BHK-21细胞，通过G418筛选得到稳定整合载体质粒的细胞株，经过扩大培养，用HSVl-rc/AUL2感染该细胞株，收获的AAV2采用氯仿处理(灭活辅助病毒及初步纯化)、PEG/NaCl沉淀、氯仿抽提三步粗纯化，并通过阳离子交换层析(S印haroseSPFastFlow)精纯化，用PBS(pH=7.4)透析。产品用点杂交方法检测基因组物理滴度(vg/ml)[11]。荧光细胞计数法测定AAV2-EGFP的感染活性将BHK-21细胞接种至24孔板，37。C，5%0)2培养箱中培养过夜。将AAV2-EGFP用无血清培养基稀释并感染BHK-21细胞(vg/cell=105)，同时加入丁酸钠(终浓度40mM)，继续培养24小时后，荧光显微镜下观察，估算荧光细胞占总细胞的比例，作为AAV2-EGFP的感染活性指标。实施例2HSVl-rc/AUL2病毒的扩增将HSV1^丛1^2按照]/101=1感染BHK-21细胞，细胞继续培养38小时，收获细胞培养上清，按此方法将HSVl-rc/AUL2扩增三代后，用噬斑法测定其感染滴度(PFU/ml)，作为工作毒种备用o实施例3HSVl-rc/AUL2加入量(MOI)的确定将BHK-21细胞接种至一块96孔板(接种量1.5X10"个细胞/孔)，37°C，5%0)2培养箱中培养20小时。将AAV2-EGFP(批号20051127，滴度lX1012vg/ml)10倍比稀释(取20(ilAAV2-EGFP于180pl无血清培养基中，混匀后，再取20ial往下稀释)，分别取100ial感染96孔板中BHK-21细胞，再按照MOIK)、1、10、50、100分别ira入HSVl-rc/AUL2(批号2FD06014，滴度为1X108pfu/ml)，37°C，5%C02培养箱中感染90分钟，换上含5。/。FBS的DMEM培养基，继续培养48h后，各孔加入1/10体积的10X裂解液(4MNaOH,50MmEDTA,10(ag/mlSalmontestesDNA)，65'C孵育30分钟，使细胞完全裂解。裂解液全部转移至96微孔转移器(Bio-Dot，170-6545)中，用阳离子尼龙膜，真空抽滤。将膜取出，经2XSSC漂洗后，用地高辛标记的CMV探针进行杂交、显色。如图1所示，HSVl-rc/AUL2以不同M01(MOI=l、10、50、100)分别感染，检测同一批样品(AAV2-EGFP)，其灵敏度不同，其中MOI40时的检测灵敏度最高，杂交信号阳性的最高稀释度均为1(T7;MOI=50灵敏度次之，约低10倍，为1(T6;MOI=1和MO》100灵敏度比MOI-10低约100倍，为10—5。分析原因，MO》l吋，HSVl-rc/AUL2处于不饱和状态，导致AAV2复制不充分，而MOP50和100时，HSVl-rc/AUL2处于过饱和状态，导致细胞过快凋亡，同样也导致AAV2复制不足。而MOI40时，HSVl-rc/AUL2比较适量，AAV2复制最充分。另外，不加HSVl-rc/AUL2的AAV2复制非常低，以至在10"稀释条件下，也几乎没有杂交信号，从此结果推算，HSVl-rc/AUL2的加入(MOI=10)，导致AAV2基因组的含量至少提高了106倍。实施例4感染后培养时间的确定同上方法，用选定的HSVl-rc/AUL2的MOI进行试验，与AAV2-EGFP(批号20051127，滴度lX10^vg/ml)共同感染BHK-21细胞，分别培养24、48、72、96h后裂解细胞，转膜，杂交、显色。本实验目的是选择感染后的最佳培养时间。HSVl-rc/AUL2以MC^0.1、1、10，与经10倍比稀释后的AAV2-EGFP，共同感染BHK-21细胞，分别培养24、48、72、96h后裂解细胞，转膜，杂交、显色。结果显示(见图2)，HSVl-rc/AUL2感染M0^10、感染后培养48小时及以上灵敏度均较好，达到10—7，因此选择HSVl-rc/AUL2感染MOK0，感染48小时为本方法的标准实验条件。实施例5方法验证为了验证本方法的准确性和可靠性，我们用本方法对3批次已知EGFP表达活性的AAV2-EGFP产品进行了感染滴度的检测。上述3批AAV2-EGFP样品各取50fil，加入450pl无血清培养液中，混匀后，取50)Ltl进行系列稀释至l(r5，从10—5连续2倍比稀释12个稀释度，按上述方法分别感染96孔板中细胞，同时感染HSVl-rc/AUL2(MOI=10)，48小时后，裂解细胞、转膜、探针杂交并显色。表l:不同批次AAV2-EGFP感染活性验证实验结果统计<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>结果分析(见图3和表1)，l号样品(批号20060314-1)与3号样品(批号20051127)阳性孔的最高稀释倍数均为3.2X10—6，2号样品(批号20060612)最高稀释倍数为8X10—5。l号与3号样品的感染滴度比2号高约4倍，结果与荧光计数法测得的感染活性结果相符(见表l)。实施例5产量预测我们挑选2株携带不同目的基因的重组BHK-21细胞(BHK-AAV2/l-6，BHK-AAV2-hCGRP)，将它们分别扩增至U6孔板中，按照生产规定的M0I加入HSVl-rc/AUL2，培养72小时后，刮下细胞，反复冻融三次，用本文方法检测其中AAV2的感染滴度。结果分析图中(见图4)l号(AAV2/l-6)的4X10—3稀释度(左起第3孔)、2号(AAV2-hCGRP)的2X10—3稀释度(左起第2L)与阳性对照病毒AAV2-EGFP的1.6X10—6稀释度的杂交信号强度基本相同，以此计算，1号和2号的AAV2滴度分别比AAV2-EGFP低400和800倍，艮卩2.5X10g和1.3Xl()9vg。以6孔板每孔细胞数为1.0X106、培养液3ml计，l号样品的细胞单产量为2.5X109X3/1.0X106=7.5X103vg/cell，2号样品的细胞单产量为3.9X103vg/cel1。1、2号样品经过正式生产，得到的终产品换算成细胞单产分别为3Xl(^vg/cdl，1.75X103vg/cell。(见下表2)排除到中间环节的损失的影响，预测产量与实际产量之间是存在对应关系的。表2AAV产品产量预测与实际产量比较<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例6AAV2生产细胞株的单克隆筛选产品AAV2-6078经数次生产，产量较低(产量2X1011vg)，为了提高产量，尝试对生产细胞株进行单克隆筛选。我们挑取了ll株单克隆细胞，将它们分别扩增到6孔板中，按照生产规定的M0I加入HSVl-rc/AUL2，培养72小时后，刮下细胞，反复冻融三次，用本文方法检测其中AAV2的感染滴度。从结果分析(见图5)，11个细胞株中只有3株(1F7，2H2，4A10)滴度较高，其它均未测到滴度，说明不同单克隆的AAV2产量存在明显差异。我们选择4A10细胞株进行批量生产，得到的产量比未挑选单克隆的物理滴度(vg)高约5倍(1.0Xl(^vs2.0Xl()Uvg)。事实证明通过挑选单克隆，可以获得相对高产的AAV2生产细胞株，本文的AAV2活性测定方法大大节省了人力、物力和时间，非常适用于对高产细胞株的挑选。本文采用梯度稀释和终点判定的方法，通过与已知滴度的对照AAV2病毒的阳性斑点对比，获得待测样品的感染滴度，因此得到的是相对活性滴度。如果采取类似腺病毒TCID50测定的方法，对每个稀释度做810个复孔，统计每个稀释度的阳性孔数，用Karber公式m可以计算出病毒的绝对滴度。另外，如果用同位素等更灵敏的方法标记探针，用计算机扫描、软件检测光密度等，有望进一步提高本方法的灵敏度和重复性。图l:HSVl-rc/AUL2不同加入量(MOI)的灵敏度比较从左到右为AAV2-EGFP样品以10—^10—12稀释后感染由上到下为HSVl-rc/AUL2分别以M01^、1、10、50、IOO感染。图2:感染后不同培养时间的比较1/2/3:24h,HSVl-rc/AUL2，MOI=0.1/1/104/5/6:48h,HSVl-rc/AUL2，MOI=0.1/1/107/8/9:72h,HSVl陽rc/AUL2，MOI=0,1/1/1010/11/12:96h,HSVl-rc/AUL2，MOI=0.1/1/10从左向右，AAV2-EGFP稀释度分别为1(T4、l(T5、l(T6、IO入l(T8、l(T9图3:方法验证杂交结果A1~B4:20060314-1(稀释倍数依次为1(T5、2X1(T5、4X1(T5、8X1(T5、1.6X1(T6、3.2X10-6、6.4X10-6、1.3X10-7、2.6X10-7、5.2X10-7、l.OXl(T8、2.0XKT8);B5C8:20060612(稀释倍数同上)；D1E4:20051127(稀释倍数同上)；E6E8:BHK细胞(阴性对照)图4:2株细胞株产量预测结果l:AAV2/l-6，稀释倍数从左至右l(T3、2X1(T3、4X10-3、8X1(T3、1.6X1(T4、3.2X1(T4、6.4X1(T4、1.3X1(T5)2:AAV2-hCGRP，稀释倍数从左至右l(T3、2X10-3、4X1(T3、8X10-3、1.6X1(T4、3.2X10-4、6.4X10-4、1.3X10-5)3:阳性对照AAV2-EGFP(批号20051127，滴度lX1012vg/ml)，稀释倍数从左至右l(T5、2X10-5、4X10.5、8X10—5、1.6X10—6、3.2X10—6、6.4X10.6、1.3X10-7图5:筛选BHK-AAV2-6078单克隆细胞株结果1~11:细胞编号分别为1F32、1F7、2H2、3A9、3B11、4A10、4E12、4F9、5C7、4G5、5H1012:阳性对照AAV2-EGFP(批号20051127，滴度1X1012vg/ml)注112所有样品的稀释倍数自上而下均为:l(T5、2X10-5、4X10—5、8X10-5、1.6X10-6、3.2X10-6、6.4X1(T6、1.3X10-7参考文献1、High,K.A.AAV-mediatedgenetransferforhemophilia.Ann.N.Y.Acad.Sci.2001,953，64~742、Pfeifer，A.,andVerma，I.M.,Genetherapy:Promisesandproblems.Annu,Rev.GenomicsHum-Genet.2001,2,1772113、Clark,K.R.，Voulgaropoulou，F.,Fraley,D,M.，andJohnson,P.R.,Celllinesfortheproductionofrecombinantadeno-associatedvirus.Hum.GeneTher.1995,6,132913414、ClarkK.R.,Liu,X.，McGrath,J.P,,andJohnson,P.R.，Highlypurifiedrecombinantadeno-associatedvirusvectorsarebiologicallyactiveandfreeofdetectablehelperandwild-typeviruses.Hum.GeneTher.1999,10，103110395、Sommer，J.M.，Smith,P.H.,Parthasarathy，S.，Iasaacs,J.,Vijay,S,,Kieran,J.,Powell,S.K.,McClelland,A.,and^Vright,J，F.,Quantificationofadeno-associatedvirusparticlesandemptycapsidsbyopticaldensitymeasurement.Mol.Ther.2003,7,122-128.6、Zolotukhin,S.,Byrne，B.,Mason，E.,Zolotukhin,I.,Potter，M.,Ches皿t，K.,Summerford，C.,Samulski，R.，andMuzyczka，N.Recombinantadeno-associatedviruspurificationusingnovelmethodsimprovesinfectioustiterandyield.GeneTher"6:973—985,1999.7、ZhuZhen，YeroEspinoza,ThieuBleu，JurgM.Sommer，andJ.FraserWright,Infectioustiterassayforadeno-associatedvirusvectorswithsensitivitysufficienttodetectsingleinfectiousevents,Hum.GeneTher,2004,15:709715.8、伍志坚、吴小兵、侯云德，具有AAV载体包装功能的重组HSV的产生，科学通报，1999，44(5)506~5099、伍志坚、吴小兵、曹晖、董小岩、王宏、侯云德，一种高效的重组腺伴随病毒载体生产系统，中国科学C辑，2001，31(5)42343010、吴小兵、董小岩、伍志坚、屈建国、侯云德，一种快速高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法，科学通报，2000，15(19)2071207511、彭建强、彭闵、谭淑萍、曹晖、连忠辉、董小岩、吴小兵，一种高效快速浓縮腺相关病毒载体的方法，病毒学报，2005，21(1):111权利要求1.一种重组腺相关病毒载体(rAAV)的感染滴度检测方法，其特征是该方法的主要包括以下步骤1)重组腺相关病毒载体(rAAV)样品经过梯度稀释，分别感染96孔板中的HSV1敏感细胞株BHK-21细胞，同时感染HSV1-rc/ΔUL2；2)48小时后裂解细胞，收集释放的DNA，将含DNA的裂解液转膜，经过DNA探针杂交，通过与AAV2载体标准品比较，得到待测AAV2样品的相对感染滴度。2.根据权利要求l，HSV1敏感细胞株还可以是HEK-293、Hela、Vero、A549细胞。3.根据权利要求l，该感染滴度检测方法可以用于基于AAV病毒而改造的AAV2载体的感染滴度的检测，具体是可以用于AAV2/1、AAV2/3、AAV2/4、AAV2/5、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8的活性滴度检测。全文摘要本发明提出了一种新的AAV2感染滴度检测方法，采用一株携带AAV2的rep-cap基因的重组HSV1病毒(HSV1-rc)作为辅助病毒，HSV1-rc和待测滴度的AAV2载体样品共同感染BHK-21细胞(也可以是其它HSV1敏感细胞，比如HEK-293、Hela、Vero、A549等)，前者支持AAV2载体基因组在细胞中复制和产生子代AAV2载体，通过对AAV2载体基因组的梯度稀释和核酸探针杂交显色，得到载体的感染滴度。文档编号C12Q1/70GK101386891SQ20071014947公开日2009年3月18日申请日期2007年9月13日优先权日2007年9月13日发明者晖曹,王宏伟,蒋立新,谭淑萍申请人:本元正阳基因技术有限公司