一种检测牛腺病毒3型的荧光定量pcr试剂盒及应用的制作方法

专利名称：：一种检测牛腺病毒3型的荧光定量pcr试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，涉及一种检测牛腺病毒3型的荧光定量PCR试剂盒，同时还涉及荧光定量PCR试剂盒的用途，适用于对血清制品中的牛腺病毒3型污染进行实时监控，同时广泛用于该病毒感染的流行病学调査，还可以为相关基础研究提供技术支持。
背景技术：
：牛腺病毒3型属于腺病毒属腺病毒科，基因组是双链的DNA分子，主要引起牛的呼吸道和肠道疾病。其主要特征为肺炎、肠炎、结膜炎和多发性关节炎，是犊牛死亡的重要原因之一，病和隐性感染的牛均可排毒，并能使与其接触的易感牛感染。其易感和潜伏性给畜牧业及其国际贸易带来严重的经济损失。因此，该病历来都是国际社会最为关注的传染病之一。牛腺病毒的快速检测是控制和消灭该病的前提，但腺病毒的常规检测方法有一些不足之处，检测技术一般来说有血清学诊断技术、生物学试验、分子生物学诊断技术三类1.血清学诊断技术包括补体结合实验、中和实验、凝集实验、免疫扩散、沉淀实验、免疫电泳技术、免疫荧光技术、放射免疫试验和免疫电镜技术等。在这些方法中得到普遍承认、采用并且广泛应用的有补体结合实验、间接血凝实验、琼脂扩散实验、中和实验。但由于所有实验均用到抗血清和抗原免疫反应，反应时间长，材料多，准备周期长，检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而且重复性差。2.生物学试验包括动物实验、鸡胚接种和细胞培养。这种检测方法存在不敏感问题，而且有些样品中存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本高，周期长，浪费生物资源和人力物力。3.分子生物学诊断技术包括核酸杂交、等电点聚焦电泳、寡核苷酸指纹图谱分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚合酶链式反应、单克隆抗体技术等。核酸杂交、等电点聚焦电泳、寡核苷酸指纹图谱分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳等检测方法更适用于对病毒特性进行更加深入的研究，由于整个系统操作复杂，过程繁多，成本高，不适宜同时迸行大批量检测，因而受到很大限制。相比之下，普通PCR方法特异性好，检测灵敏度高，不但可以检测活病毒核酸，也能直接检测灭活的核酸片段。样品可以是牛血清，也可以是扁桃体、淋巴结、脊髓、肌肉和皮肤等组织，这是免疫学方法无法替代的。但这种传统的定量方法测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。因此，如何快速、准确测定牛腺病毒是面临的主要难题之一。近年来发展起来的荧光定量PCR(FluorogeneticQuantitativePCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析(NellemannC,VinggaardAM，DalgaardM，etal,QuantificationofAntiandrogenEffectDeterminedbyLightCyclerTechnology[J].Toxicology,2001，163:29-38)、病原体的定性(McGoldrickA,LowingsJP,IbataG，etal.ANovelApproachtotheDetectionofClassicalSwineFeverVimsbyRT-PCRwithaFluorogenicProbe(TaqMan)[J].J.Virol.Methods,1998，72:125-135.;BhudeviB，WeinstockD.FluorogenicRT-PCRassay(TaqMan)forDetectionandClassificationofBovineViralDiarrheaVirus[J].Vet.Microbiol.,2001,83:1-10.)和定量检测(KathyF丄Tang,JunWang,DonaldV丄ightner.QuantitationofTaurasyndromevirusbyreal-timeRT-PCRwithaTaqManassay[J].J.Virol.Methods,115(2004)109-114.;MichaelaSchwaiger,PascalCassinotti.Developmentofaquantitativereal-timeRT-PCRassaywithinternalcontrolforthelaboratorydetectionoftickborneencephalitisvirus(TBEV)RNA[J].J.Clin.Microbiol"27(2003)136-145.;R.FrankCook"，S丄Cooka,etal.Developmentofamultiplexreal-timereversetranscriptase-polymerasechainreactionforequineinfectiousanemiavirus(EIAN)[J].丄Virol.Methods,105(2002)171-179.;BirgitLiss*.Improvedquantitativereal-timeRT-PCRforexpressionprofilingofindividualcells[J].NucleicAcidsRes"2002，Vol.30No.17e89.;FranckHousseaualimberlyR丄indseya,1，etal.Quantitativereal-timeRT陽PCRasamethodformonitoringTlymphocytereactivitytofull-lengthtyrosinaseproteininvaccinatedmelanomapatients[J].J.Immunol.Methods266(2002)87-103.;DesireN，DeheeA，SchneiderV，etal,QuantificationofHumanImmunodeficiencyVirusType1ProviralLoadbyaTaqManReal-TimePCRAssay[J].J.Clin.Microbiol,2001,39:1303-1310.;MartellM，GomezJ,EstebanJI,etal.High-ThroughputReal-TimeReverseTranscription-PCRQuantitationofHepatitisCVirusRNA[J].J.Clin.Microbiol,1999,37:327-332.;KearnsAM,TurnerAJL,EltringhamGJA，etal.RapidDetectionandQuantificationofCMVDNAinUrineusingLightcycler-basedReal-timePCR[J].J.Clin.Virol,2002,24:131-134;FlorenceKP,GlauciaPB,MireilleS，etal.QuantitationofHCVRNAusingreal-timePCRandfluorimetry[J].J.Virol.Methods,2001,95:111-119;ZakhartchoukA,ConnorsW,vanKesselA，etal.Bovineadenovirustype3containingheterologousproteinintheC-terminusofminorcapsidproteinIX.Virology,2004,320(2):291-300.)等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定量主要方法，国内目前已有关于丙肝、乙肝、支原体、艾滋病、结核定量检测的试剂盒上市。
发明内容本发明的目的是在于提供了一种检测牛腺病毒3型的荧光定量PCR试剂盒，该PCR试剂盒适用于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高、定量快速准确、检测范围广，稳定性好。本发明的另一个目的是在于提供了一种检测牛腺病毒3型的荧光定量PCR试剂盒在奶牛感染腺病毒3型流行病学调査中的应用，可高效方便地对血清制品中的牛腺病毒3型污染进行实时监控，同时可广泛用于该病毒感染的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持。为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施，该荧光定量PCR试剂盒包括a)DNA提取试剂，b)热启动TaqDNA聚合酶，c)引物和TaqMan探针，d)标准阳性DNA模板，e)PCR荧光定量反应液，其特征在于引物序列分别为正义引物(FP):5'-CCTGAATTCTCTTGCAGCCAGA-3'，反义引物(RT):5'-CCTACCGAACCGACGCAGAT-3'，扩增子大小为100bp，荧光探针序列为5'-FAM-TGAGAAGGTACTCCTCGTCGCTGGACCA-TAMRA-3'(SEQIDNO:3)，探针的5'端标记荧光发射基团FAM,靠近3'端标记荧光淬灭基团TAMRA，标准阳性DNA模板由已插入腺病毒3型pol蛋白100bp片段的pGEM-T载体(购自Promega公司)转化大肠杆菌DH5a(购自Invitrogen公司，普通大肠杆菌DH5a)，增殖后提取质粒制备，并于紫外分光光度计测A26o定量并10倍梯度稀释。所述的PCR荧光定量反应液由10xbuffer、10pM的正义引物和反义引物、l(HiM的荧光探针和热启动TaqDNA聚合酶、无核酸酶的无菌水组成。所述的标准阳性模板DNA序列为GGTAG。在本发明的一个优选方案中，荧光定量反应液由正义引物(FP)，反义引物(RT)，荧光探针(TaqMan),10xbuffer溶液，热启动TaqDNA聚合酶，无核酸酶的灭菌双蒸水组成；在本发明的一个具体方案中，荧光定量反应液由10xbuffer溶液2.5pl,10pmol/L正义(FP)、反义(RP)引物各3nl，10(imol/L荧光探针0.75|nl，dNTPs(10mM)1^1，热启动TaqDNA聚合酶0.25|nl，Mg2SO4(50mM)0.5^1，无核酸酶的灭菌双蒸水9^1组成。其中荧光探针为(SEQIDNO:3)所示的核苷酸序列，荧光探针5'端标记的荧光报告基团是FAM，3'端标记荧光淬灭基团TAMRA。在本发明的一个优选方案中，标准阳性DNA模板由含有插入目的片段的pGEM-T(购自Promega公司)载体制备，于紫外分光光度计测A，定量并10倍梯度稀释。实验所用的标准品制备过程为PCR产物电泳后切下含有目的片段的凝胶，用Omega公司的凝胶纯化试剂盒纯化，与pGEM-T载体(购自promega公司)4'C过夜连接，转化感受态细胞，转化产物涂平板培养，挑取白斑PCR鉴定阳性后送英骏生物技术有限公司测序，根据测序结果将筛选的阳性克隆菌接种到含氨卞的LB培养基过夜培养，用SDS碱裂解法制备质粒DNA，经Omega公司的凝胶纯化试剂盒纯化后，于紫外分光光度计测A260定量，并稀释至梯度109-102拷贝/&，一7(TC保存，所用一切物品均无核酸酶。在本发明提供检测牛腺病毒3型的荧光定量PCR试剂盒中，有一条一端标记有荧光报告基团另一端标记有荧光淬灭基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5'端报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3'端淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，TaqDNA聚合酶利用其5'-3'外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的FRET，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，所以荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对BAV-3的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，ThresholdCycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环数，Ct值与起始模数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。在本发明提供检测牛腺病毒3型的荧光定量PCR试剂盒中，针对牛腺病毒3型的基因组的耙片段特殊性，将反应体系(引物和探针浓度、Mg^浓度、扩增程序等)的优化，并将FQ-PCR技术和定量检测系统(包括LigthCycler系统，Roche，ABIPrism系统，PEAppliedBioasystems)相结合，将其用于各种来源的牛腺病毒3型样品的定量检测。通过优化方案，反复实验，以及与传统检测方法进行比较，建立了定量检测BAV-3的方法，并研制出牛腺病毒3型的定量检测试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出100个水平的病毒基因拷贝数，检测范围可以达到八个数量级，是其它任何方法无法比拟的。在本发明的另外一个方面，还提供了一种检测牛腺病毒3型的荧光定量PCR试剂盒在奶牛感染腺病毒3型流行病学调查中的应用，荧光定量PCR试剂盒对牛腺病毒3型进行检测的方法，该方法包括下列步骤A)用e)标准阳性DNA模板由插入目的片段的pGEM-T(购自Promega公司)载体制备，并用紫外分光光度计定量；B)用a)DNA抽提液从待测标本和阴阳性标准品中提取DNA，然后加C)e)PCR荧光定量反应液及其优化试剂，b)热启动TaqDNA聚合酶，c)引物和TaqMan探针；D)将C)步中已加入了标准品及待测样品的荧光定量反应液PCR反应体系上机，用荧光定量检测仪进行PCR检测；E)通过比较待测样品和标准品的循环域值根据标准曲线计算出待测样品的起始拷贝数。7在本发明中提供的检测牛腺病毒3型的荧光定量PCR试剂盒可对各种来源的牛血清样品进行准确定量检测，从而可对疫情进行实时监控，可广泛用于动物产品的进出口及动物食品的安全检测和质量监控，可为相关基础研究提供技术支持。本发明与现有技术相比具有以下优点和效果1.与传统定量方法相比，此实时荧光定量PCR具有高灵敏性，高特异性和高准确性的特点，直接对PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定Ct値，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上DNA定量。2.检测范围广，在10M0Vr浓度范围内有极好的线性关系(R=0.999)，检测范围可以达到八个数量级，已达到国际先进水平，其灵敏度可检测100copies水平，是其它任何方法无法比拟的。3.适用于各种型号的荧光定量扩增仪，一次实验中三个重复样品相应的变异系数(CV)小于2%，说明其极高的重复性和稳定性。4.该实时荧光定量PCR利用外标准曲线，是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，广泛用于血清制品中的病毒污染、流行病检査和基础研究等领域。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如精编分子生物学指南，F.M.奥斯柏等主编，科学出版社，1995，分子克隆实验指南(第三版)；D丄.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。实施例1牛腺病毒3型的荧光定量PCR试剂盒组成及其反应条件A).试剂盒组成a)试剂盒组成如下(IO次反应)DNA提取液A(4ml/管)DNA提取液B(2ml/管)DNA提取液C(2.6ml/管)DNA提取液D(2.5ml/管)RNaseA(衡l滑)蛋白酶K溶液(2ml/管)PCR扩增反应液(220nl/管)强阳性标准品(IOO倍稀释定值准品20pl/管，共四管)阴性标准品(50)tU/管)热启动TaqDNA聚合酶(2.75(il/管)PCR反应管(无菌、无RNA酶和DNA酶)无核酸酶H20(2ml/管)临界阳性标准品(50)il/管)(DNA提取液A、B、C、D为TIANGEN公司产品。b)热启动TaqDNA聚合酶(2UV1)、c)PCR反应液购自Takara公司)B).荧光定量反应液(反应总体积是25pl):10xbuffer2.5pl，正义引物FP(SEQIDNO:l)和反义引物RP(SEQIDNO:2)各3pl(10nmol/L)，荧光探针0.75nl(10nmol/L)，dNTPs(10mM)1^1，Mg2SO4(50mM)0.5|ul，热启动TaqDNA聚合酶0.25^1，抽提的标准品或待测样品均为5|_U，无核酸酶的灭菌双蒸水9nl组成。其中荧光探针为(SEQIDNO:3)所示的核苷酸序列，荧光探针5'端标记的荧光报告基团是FAM，3'端标记荧光淬灭基团TAMRA。C).反应条件如下(采用两步法)PCR:94。C2min在每个循环的第二步结束时进行荧光检测。对BAV-3的定量可通过与标准品的循环域值(Ct,ThresholdCycle)相比较并根据标准曲线计算出待测样品的起始拷贝数。D).荧光定量PCR试剂盒检测腺病毒3型的灵敏度、检测范围及稳定性的用途取标准品DNA109-1020/^d浓度范围，每个浓度三个重复，分别加入对应编号的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为94'C预变性5min;94°C30s，60°C90s，扩增40个循环。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，检测波长为518nm。循环结束后，运用仪器自带分析软件，读取待检样品拷贝数。结果为Cycle<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>100copies，且稳定性好，一次实验中三个重复样品相应的变异系数(CV)小于2%，说明其极高的重复性，适用于各种型号的荧光定量扩增仪，是其它任何方法无法比拟的。实施例2荧光定量PCR试剂盒在奶牛感染腺病毒3型流行病学调查中的应用A).试剂盒组成a)试剂盒组成如下(IO次反应)DNA提取液A(4ml/管)DNA提取液B(2ml/管)DNA提取液C(2.6ml/管)DNA提取液D(2.5ml/管)RNaseA(40ul/管)蛋白酶K溶液(2ml/管)PCR扩增反应液(220ili1/管)热启动TaqDNA聚合酶(2.75pl/管)强阳性标准品(100倍稀PCR反应管(无菌、无RNA酶和DNA酶)释定值准品20pl/管，共四管)无核酸酶H20(2ml/管)阴性标准品(50pl/管)临界阳性标准品(50pl/管)(DNA提取液A、B、C、D为TIANGEN公司产品。b)热启动TaqDNA聚合酶(2U/pl)、c)PCR反应液购自Takara公司)B).荧光定量反应液(反应总体积是25pl):10xbuffer2.5(il，正义引物FP(SEQIDN0:1)和反义引物RP(SEQIDN0:2)各3pl(10pmol/L)，荧光探针0,75pl(10^miol/L)，dNTPs(10mM)lpl，Mg2SO4(50mM)0.5nl，热启动TaqDNA聚合酶0.25^1，抽提的标准品或待测样品均为5pl，无核酸酶的灭菌双蒸水9^1组成。其中荧光探针为(SEQIDNO:3)所示的核苷酸序列，荧光探针5'端标记的荧光报告基团是FAM，3'端标记荧光淬灭基团TAMRA。C).反应条件如下(采用两步法)PCR:94。C2min94°C30s}4060°C90sCycle在每个循环的第二步结束时进行荧光检测。对BAV-3的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，ThresholdCycle)相比较并根据标准曲线计算出待测样品的起始拷贝数。D).荧光定量PCR试剂盒检测腺病毒3型(1)不同来源的奶牛血清原料样本，经0.2pM滤器过滤后，分别配制成5%(体积比)FBSMEM的培养基(lmlFBS加入19mlMEM)，分别编号为A卜A25;(2)将状态良好的原代牛肾细胞BKC接入6孔板，汇合度约25%,待细胞贴壁后(约6h)，更换为待检的5。/。FBSMEM样本，同时设阴性对照和阳性对照，37°C，5%(体积比)C02培养箱中培养4天；2000rpm离心5min收集细胞；(3)上述收集得到的细胞，倒尽上清，加入20(HdDNA提取液A，振荡至彻底悬浮，加入4plRNaseA(100mg/ml)，振荡15s，室温(20~25°C)5min;(4)加入20nl蛋白酶K，混匀(5至20次)；7(TC放置10min，至溶液变清亮，瞬时离心，去除管内壁的水珠；(5)加入200pd无水乙醇，充分混匀15s，瞬时离心；(6)将上一步溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，12000rpm离心30s，弃废液；(7)吸附柱中加入500nlDNA提取液C(使用前加入3.4ml无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃废液；(8)吸附柱中加入70(^1DNA提取液D(使用前加入10ml无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃废液；(9)吸附柱中加入500^1DNA提取液D，12000rpm离心30s，弃废液；(10)空离吸附柱，12000rpm离心2min，凉干；(11)20(^1无核酸酶水加入吸附柱，室温2-5min,12000rpm离心2min;(12)得到的DNA用于下游的FQ-PCR实验。E)取D步所提DNA5^1,荧光定量反应液(反应总体积是25^1):10xbuffer2.5^1，正义引物FP(SEQIDNO:l)和反义引物RP(SEQIDNO:2)各3|^1(10pmol/L)，荧光探针0.75pl(10pmol/L)，dNTPs(10mM)l|al，Mg2SO4(50mM)0.5pl，热启动TaqDNA聚合酶0.25|il，抽提的标准品或待测样品均为5pl，无核酸酶的灭菌双蒸水9pl，分别加入对应编号的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为94。C预变性2min;94。C30s，60°C90s，扩增40个循环。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行,检测波长为518nm。循环结束后，运用仪器自带分析软件，读取待检样品拷贝数。结果为:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(copies/ml)Al6-905-A24-042-A32-082-A403-6116-A56-730-A62-147-A7114-A82-009-A96-065-A102-034-All7-021-A126-256-A135-189-A145-148-A157-134-A166-312(L69士0.54)x1050.30A175-177-A182-149-A19106-A205-188-A216-248-A222-067-A236-237C2.05士1.27)x1052.01A242-257-A25601-阴性对照-阳性对照(3.90士1.05)x10100.19以上结果表明，奶牛编号为6-312，6-237的奶牛血清中含有BAV-3，表明13牛携带BAV-3,同时证实了牛腺病毒3型荧光定量PCR试剂盒能成功应用于BAV-3流行病学调査，牛血清以及牛血液制品的监测，重复性好，CV值均小于2X。实施例3荧光定量PCR试剂盒在市售牛血清产品中质量监测的应用A).试剂盒组成a)试剂盒组成如下(IO次反应)DNA提取液A(4ml/管)DNA提取液B(2ml/管)DNA提取液C(2.6ml/管)DNA提取液D(2.5ml/管)RNaseA(40ul/管)蛋白酶K溶液(2ml/管)PCR扩增反应液(220pl/管)热启动TaqDNA聚合酶(2.75^/管)强阳性标准品(IOO倍稀PCR反应管(无菌、无RNA酶和DNA酶)释定值准品20pl/管，共四管)无核酸酶H20(2ml/管)阴性标准品(50pl/管)临界阳性标准品(50nl/管)(DNA提取液A、B、C、D为TIANGEN公司产品。b)热启动TaqDNA聚合酶(2U/pl)、c)PCR反应液购自Takara公司)B).荧光定量反应液(反应总体积是25iil):10xbuffer2.5pl，正义引物FP(SEQIDNO:l)和反义引物RP(SEQIDNO:2)各3pl(10pmol/L)，荧光探针0,75|il(10|imol/L)，dNTPs(10mM)lpl，Mg2SO4(50mM)0.5^1，热启动TaqDNA聚合酶0.25^1，抽提的标准品或待测样品均为5pl，无核酸酶的灭菌双蒸水9^1组成。其中荧光探针为(SEQIDNO:3)所示的核苷酸序列，荧光探针5'端标记的荧光报告基团是FAM，3'端标记荧光淬灭基团TAMRA。C).反应条件如下(采用两步法)PCR:94°C2min94。C30s}4060。C90sCycle在每个循环的第二步结束时进行荧光检测。对BAV-3的定量可通过与标准品的循环域值(Ct，ThresholdCycle)相比较并根据标准曲线计算出待测样品的起始拷贝数。D).荧光定量PCR试剂盒检Gibco、Hyclone、杭州四季青、武汉三利生物技术有限公司四个产家的血清是否污染有牛腺病毒3型:1)待检血清的批号<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2)实验方法(1)培养的原代牛肾细胞铺制6孔板x4块，2ml/L，50%(面积比)汇合度；(2)待检血清用MEM配制为5%(体积比)工作浓度；(3)细胞贴壁后，更换为待检血清配制的培养基，2ml/孔；(4)同时设阴性和阳性对照，阳性对照加含有BAV的5%(体积比)FBSMEM;(5)37°C，5%(体积比)C02培养箱中培养，并观察是否有CPE的产生。(6)细胞收集72h后，观察到阳性对照产生了显著的CPE，收集细胞，包括脱壁的细胞，2000rpm离心5min暂存于-8(TC。其余样品同样方法处理。提取细胞的总DNA，作为FQ-PCR的模板。3)细胞中总DNA的提取(1)上述收集得到的细胞，倒尽上清，加入200^1DNA提取液A，振荡至彻底悬浮，加入4nlRNaseA(100mg/ml)，振荡15s，室温(20~25°C)5min;(2)加入20pl蛋白酶K，混匀(5至20次)；7(TC放置10min，至溶液变清亮，瞬时离心，去除管内壁的水珠；(4)加入200^1无水乙醇，充分混匀15s，瞬时离心；(5)将上一步溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，12000rpm离心30s，弃废液；(6)吸附柱中加入500plDNA提取液C(使用前加入3.4ml无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃废液；(7)吸附柱中加入700^dDNA提取液D(使用前加入10ml无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃废液；(8)吸附柱中加入50(^1DNA提取液D，12000rpm离心30s，弃废液；(9)空离吸附柱，12000rpm离心2min，凉千；(10)20|_U无核酸酶水加入吸附柱，室温2-5min，12000rpm离心2min;(11)得到的DNA用于下游的FQ-PCR实验。E)取D步所提DNA5pl，荧光定量反应液(反应总体积是25^1):10xbuffer2,5nl，正义引物FP(SEQIDNO:l)和反义引物RP(SEQIDNO:2)各3pl(10(imol/L),荧光探针0.75pl(10[imol/L)，dNTPs(10mM)l|il，Mg2SO4(50mM)0.5^1，热启动TaqDNA聚合酶0.25^1，抽提的标准品或待测样品均为5pl，无核酸酶的灭菌双蒸水9pl，分别加入对应编号的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。循环条件为94。C预变性2min;94。C30s，60°C卯s，扩增40个循环。把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行,检测波长为518nm。循环结束后，运用仪器自带分析软件，读取待检样品拷贝数。结果为公司名称血清批号BAV-3(copies/ml)Gibco749154-949184-719321-719351-7685959D-HycloneNSF0081-NSF0071-NSF0061-NSF0051-NSF0021-杭州四季青0803045.65x105080504-080426-080228-080408-武汉三利20080701-060604-16<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>以上结果表明杭州四季青公司，批号为080304的血清中污染了少量的BAV-3，其它公司待检批号的血清均表现为BAV-3阴性，同时表明该试剂盒能用于检测细胞样品中的病毒。SEQUENCELISTING<110>武汉三利生物技术有限公司<120>—种检测牛腺病毒3型的荧光定量PCR试剂盒及应用〈130〉一种检测牛腺病毒3型的荧光定量PCR试剂盒及应用〈160>3<170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉22<212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉1CCTGAATTCTCTTGCAGCCAGA22〈210〉2<2U>20〈212〉腿〈213>人工合成<400〉2CCTACCGAACCGACGCAGAT20〈210〉3<211>28<212〉DNA〈213〉人工合成<400〉3TGAGAAGGTACTCCTCGTCGCTGGACCA28权利要求1、一种检测牛腺病毒3型的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有a)DNA提取试剂，b)热启动TaqDNA聚合酶，c)引物和TaqMan探针，d)标准阳性DNA模板，e)PCR荧光定量反应液，其特征是引物序列分别为正义引物5′-CCTGAATTCTCTTGCAGCCAGA-3′，反义引物5′-CCTACCGAACCGACGCAGAT-3′，扩增子大小为100bp，荧光探针序列为5′-FAM-TGAGAAGGTACTCCTCGTCGCTGGACCA-TAMRA-3′，探针的5′端标记荧光发射基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团TAMRA，标准阳性DNA模板由已插入腺病毒3型pol蛋白100bp片段的pGEM-T载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒制备，并于紫外分光光度计测A260定量并10倍梯度稀释。2、根据权利要求1所述的一种检测牛腺病毒3型的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于所述的PCR荧光定量反应液由10xbuffer、10|iM的正义引物和反义引物、10pM的荧光探针和热启动TaqDNA聚合酶、无核酸酶的无菌水组成。3、根据权利要求1所述的一种检测牛腺病毒3型的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于所述的标准阳性模板DNA序列为GGTAG4、权利要求1所述的一种检测牛腺病毒3型的荧光定量PCR试剂盒在奶牛感染腺病毒3型流行病学调査中的应用。全文摘要本发明公开了一种检测牛腺病毒3型的荧光定量PCR试剂盒及应用，该试剂盒含有a)DNA提取试剂，b)热启动TaqDNA聚合酶，c)引物和TaqMan探针，d)标准阳性DNA模板，e)PCR荧光定量反应液，其特征是引物序列分别为正义引物5′-CCTGAATTCTCTTGCAGCCAGA-3′，反义引物5′-CCTACCGAACCGACGCAGAT-3′，扩增子大小为100bp，荧光探针序列为5′-FAM-TGAGAAGGTACTCCTCGTCGCTGGACCA-TAMRA-3′，探针的5′端标记荧光发射基团FAM，靠近3′端标记荧光淬灭基团TAMRA，标准阳性DNA模板由已插入腺病毒3型pol蛋白100bp片段的pGEM-T载体转化大肠杆菌DH5α，增殖后提取质粒制备，并于紫外分光光度计测A₂₆₀定量并10倍梯度稀释。高效方便地对血清制品中的牛腺病毒3型污染进行实时监控，可广泛用于该病毒感染的流行病学调查，还能为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。文档编号C12Q1/68GK101560573SQ20091006209公开日2009年10月21日申请日期2009年5月15日优先权日2009年5月15日发明者张国荣,郑从义,佳郭申请人:武汉三利生物技术有限公司