专利名称：一类可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其应用。
背景技术：
养殖业中，每年约有10%的水产养殖动物死于感染性病害，其中弧菌感染导致的疾病占了相当大的比重。虽然化学药品和抗生素可控制其感染，但药物防治常会产生不良后果，如在水产动物体内积累、残留，容易产生耐药菌株，易污染环境等问题，因此建立病原弧菌的快速检测技术，以提早防治病害的发生和流行仍是目前的主要手段。目前弧菌的检测方法主要是根据伯杰氏手册，通过对微生物的生理生化特征进行检测来进行鉴定的，由于需要测试的项目较多，因此该方法工作量较大、操作较繁琐； 16SRNA的分子生物学方法虽有较高的准确性，但需要提取病原菌的16SRNA，手续较繁琐， 且对检测设备有一定要求，难以实现现场的快速检测需要；免疫学方法制备的抗血清虽能实现快速检测，但由于制备的抗血清为多克隆抗体，实际应用中可能会出现假阳性或假阴性，即使采用单克隆抗体，由于制备技术要求较高、周期较长，也使其应用受到限制。指数富集配体进化技术(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)，简称SELEX技术，是近年来新发展起来的一种系统筛选技术。它利用寡核苷酸分子可在空间形成多种多样的三维结构，通过构建的随机寡核苷酸库，从中筛选出与目标靶分子有特异识别作用的高亲和力的寡核苷酸分子——适配子，其分子识别能力可达到甚至超过了单克隆抗体的水平，而制备技术则比单克隆抗体简单、快速。运用该技术目前已筛选出了肿瘤细胞、炭疽杆菌等的适配子，可用于肿瘤细胞和炭疽杆菌的检测、识别。溶藻弧菌是一种广泛分布于世界各地海水及河口处的一种病原微生物，其数量居海水类弧菌之首，存在于多种海洋动物中，是鱼、虾、贝等海水养殖动物的条件致病菌，并可引起人食物中毒、耳部发炎等疾病，对公共卫生安全构成十分严重的威胁。因此，运用SELEX 技术筛选溶藻弧菌适配子，并将其应用于溶藻弧菌的识别鉴定，能大大提高溶藻弧菌检测的灵敏度和特异性，成为本发明的重点。
发明内容
本发明的目的在于提供了一类可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其应用。本发明具有检测快速，操作简单，适配子的稳定性高于抗体的特点，而且制备容易，制备周期较短。为了达成上述目的，本发明的解决方案是
一类可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列，包括SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4四条寡核苷酸序列，且采用其中一条就能完成溶藻弧菌识别检测。 首先合成用于筛选的寡核苷酸文库(5‘ - TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC——N35 ——GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG -3')，然后将该文库与溶藻弧菌混合后进行 SELEX筛选，筛选产物经克隆测序后，从中挑选出有代表性的适配子进行亲和力和特异性的验证，最终获得4条对溶藻弧菌有较好亲和特异性的寡核苷酸序列(适配子)。一种可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列的应用，所述的寡核苷酸序列具有识别检测溶藻弧菌的用途，且采用上述四条寡核苷酸序列中的任意一条就能够单独应用于溶藻弧菌的检测。所述的四条寡核苷酸序列的5'端均标记有地高辛。本发明的有益效果为本发明具有检测快速，操作简单，适配子的稳定性高于抗体的特点，而且制备容易，制备周期较短。
图1为本发明实施例1中5条序列(5个适配子)与溶藻弧菌的亲和力比较图； 图2为本发明实施例1中5条序列(5个适配子)与哈维式弧菌的亲和力比较图； 图3为本发明实施例1中5条序列(5个适配子)与嗜水气单胞菌的亲和力比较图； 图4为本发明实施例1中5条序列(5个适配子)与迟钝爱德华氏菌的亲和力比较图； 图5为本发明实施例1中SEQ ID No. 1适配子对4种不同菌种的识别效果图6为本发明SEQ ID No. 2适配子对4种不同菌种的识别效果图； 图7为本发明SEQ ID No. 3适配子对4种不同菌种的识别效果图； 图8为本发明SEQ ID No. 4适配子对4种不同菌种的识别效果图。图中纵坐标均为亲和力，图1、图2、图3和图4的横坐标为适配子，图5、图6、图7、 图 8 的横坐标为微生物，K斤iidK harveyi、A. hydrophila、E. art/a 分别表示溶藻弧菌、哈维式弧菌、嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌。
具体实施例方式实施例1
本实施例的一类可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列的制备步骤主要包括
1、合成寡核苷酸文库和引物(由上海生工生物工程技术有限公司合成)寡核苷酸文库 (SEQ ID No. 6) 5' - TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC ——N35——GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG -3' (N35为35个随机寡核苷酸序列)
引物 1 (Pl) 5' - TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC -3' (SEQ ID No. 7) 引物 2 (P2)5' - CCC TCT GGG GTC TCC CTC TTG TGC-3‘ (SEQ ID No. 8)
2、SELEX筛选
上面合成的寡核苷酸筛选文库先与靶目标溶藻弧菌(购自中科院微生物研究所)结合， 离心分离弧菌，再通过加热从弧菌上分离出具有亲和力ssDNA，然后通过不对称PCR扩增富集具有亲和力的ssDNA，并作为下一轮的筛选文库。重复筛选15次后，得到具有高亲和力的 4 条适配子文库(SEQ ID No. USEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4)。相应的具体步骤说明如下
1)溶藻弧菌菌液制备
用蒸馏水将培养M h的溶藻弧菌菌落从斜面上洗涤下来，6000 rpm离心5 min，弃上清液。用蒸馏水重悬并稀释菌液到下列浓度范围1 X108f/mL至9X108个/mL。然后取菌液分装20管，每管1 mL的菌液。-20 ！低温保存备用。
2)与弧菌结合
取上述由上海生工生物工程技术有限公司化学合成的100 μ M ssDNA 4 111^，用2父结合缓冲液(20X 结合缓冲液配方1 M NaCl,50 mM KCl,500 mM Tris-HClUO mM MgCl2、pH 7. 4。用时用蒸馏水稀释10倍)稀释至100 yL,95 °C变性5 min，迅速冷却到4 °C, 10 min 后加入100 PL自然室温恢复的菌液，再加入200 μ L生理盐水，摇床结合30 min。然后 6000 rpm离心5 min，弃上清，然后用IX结合缓冲液(将20X结合缓冲液稀释20倍，(配方同上))洗沉淀3次，弃上清。则沉淀部分为弧菌沉淀和与其相结合的ssDNA。3)分离结合的ssDNA
在上述沉淀加入IX结合缓冲液(配方同上)100 UL, 96 °C加热5 min，使与弧菌结合的ssDNA变性，从而与弧菌分离，然后6000 rpm离心10 min,取上清液，再次加热并离心，合并上清液，则可分离得到与弧菌结合的ssDNA。4)不对称 PCR 扩增 ssDNA 不对称PCR扩增体系(40 μ L反应体积) 10XPCR缓冲液4 μ L (购于Fermentas公司) 10ΧΡ1 (10 μΜ) 4 UL (购于上海生物工程公司) 1ΧΡ2 (1 μΜ) 0.8 μ L (购于上海生物工程公司) dNTP (各 2. 5 mM) :2 μ L (购于 Takara 公司) MgCl2 (25 mM) 0. 8 μ L (购于 Fermentas 公司) ssDNA (0. 2 μ g/μ L) 4 μ L
Taq DNA 聚合酶(5 u/μ L) :0·4 μ L (购于 Fermentas 公司) ddH20 24 μ L
PCR反应参数94 °C预变性10 min，然后进行40个循环(94 °C变性30 s，60 °C退火 30 s, 72 °C延伸 40 s)，最后 72 °C延伸 7 min。5)重复筛选
以每一轮不对称PCR的产物作为下一轮的筛选文库，重复上述步骤1)到4)，共进行15 轮筛选，筛选得到适配子的富集文库。6)克隆测序
将上述筛选出的适配子富集文库进行不对称PCR扩增(扩增条件同上)，扩增产物送测序公司进行克隆，并随机挑取82个克隆测序(由上海美吉生物医院科技有限公司完成克隆和测序工作)，得到51条序列(编号为1-51号)。7)序列分析
对获得的51条序列，分别采用DNAMAN、RNA Structure软件进行一级结构和二级结构的分析和分类，得到5个类群，分别从每个类群中选择1条有代表性的序列，共5条序列， 编号为 7 ( SEQ ID No. 5)、8 ( SEQ ID No. 1),10 ( SEQ ID No. 2),37 ( SEQ ID No. 3),46 (SEQ ID No. 4)，分别进行亲和力和特异性的验证鉴定。5条序列如下表1所示 3、亲和特异性验证
1)合成上述5条序列(由上海生工生物工程技术有限公司合成)，并在5’端标记地高辛。2)微生物的准备选取水产养殖环境常见的病原微生物——哈维式弧菌(Vibrio harveyi )、嗜水气单胞菌iAeromonas AxdropAiJa )、迟纯爱德华氏菌(Mdwardsiella tarda )作为对照菌,与溶藻弧菌(K alginolyticus) 一起，在无菌条件下分别接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB) 培养基中，30 1下100 rpm摇床培养约8-10 h。然后取菌液离心，弃上清培养液，再用蒸馏水稀释到1 X IO8个/mL至9 X IO8个/mL，-20 °C低温保存备用。3)亲和力的测定
A与菌结合分别取含有编号为7、8、10、37、46的ssDNA与上述菌种结合，其中ssDNA 各为30 pmol用2X结合缓冲液稀释到100 μ L，95 °C变性5 min，冰浴10 min后，加入菌液200 uL(菌数量约为8X108个)，充分混合，30 °C, 100 rpm摇床结合30 min，然后10000 rpm离心5 min，分离细菌沉淀与上清液。同时做一不加ssDNA (用2 X结合缓冲液代替)的空白。B洗涤将上述细菌沉淀用1 X结合缓冲液100 μ L洗涤2次，10000 rpm离心5 min，弃上清，取菌沉淀。C与辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体结合在空白及实验组菌沉淀中加入 100 UL 1:1000 TBS稀释的过量的辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体(购于北京博奥森生物技术公司)，充分混合后，反应10 min。D洗涤10000 rpm离心5 min,再用1 X结合缓冲液100 μ L洗涤3次，弃上清，
取菌沉淀。E显色加入400 μ L双蒸水重悬菌沉淀，再加入200 μ L TMB显色液，避光显色 10 min后，以2 mol/L H2SO4 200 μ L终止反应，测定OD45tl，该值即反映结合的酶标亲和素的OD值，即为ODg^空白同样进行上述B、C、D、E步骤，得到空白相应的吸光度0Dse。相应适配子的亲和力=OD结合-ODse (结果见图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8所示) 其中图1、图2、图3、图4分别显示了五个适配子分别与四种菌的亲和力比较(柱形上的** 分别代表与空白对照组比较达到极显著水平，P<0. 01)。图5、图6、图7、图8分别显示了四个适配子对不同菌的识别效果(柱形上的*、**分别代表与其它组比较达到显著、极显著水平，p<0. 05 和 p<0. 01)
F数据处理分析
用EXCEL软件中的统计函数进行数据处理，统计指标采用T检验进行统计分析，统计概率p<0. 05为显著差异，p<0. 01为极显著的差异。实验结果
通过SELEX筛选和亲和力测定，只有7号适配子的亲和力未达到显著水平，而8、10、 37,46号适配子对溶藻弧菌均有极显著的亲和力(p<0. 01)，且这4个适配子对溶藻弧菌的亲和力均显著高于对其它3种菌(哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌和迟缓型爱德华氏菌)的亲和力(p<0. 05)，说明这4个适配子对溶藻弧菌都有显著的特异性识别能力，可应用于溶藻弧菌的识别检测。实施例2
寡核苷酸序列具有识别检测溶藻弧菌的用途具体使用步骤如下1)取病鱼的伤口组织粘液，蒸馏水溶解后接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)培养基中，30 °〇下100 rpm 摇床培养约8-10 h。然后取菌液离心，弃上清培养液，再用蒸馏水稀释到IX IO8个/mL至9X108个/mL，-20 ！低温保存备用。然后用5'端标记有地高辛的适配子8 ( SEQ ID No. 1)按前面的亲和力测定方法进行检测，同时做一阳性对照(用溶藻弧菌作阳性对照)和阴性对照(用无菌蒸馏水作阴性对照)，结果显示阳性对照组和实验组颜色变黄，而阴性对照组颜色未变，说明样品中有溶藻弧菌，病鱼感染了溶藻弧菌。2)取感染了弧菌病的养殖水体，按上述方法进行微生物的培养和样品的制备，然后用5'端标记有地高辛的适配子10 ( SEQ ID No. 2)按前面的亲和力测定方法进行检测， 同时做一阳性对照(用溶藻弧菌作阳性对照)和阴性对照(用无菌蒸馏水作阴性对照)，结果显示阳性对照组和实验组颜色变黄，而阴性对照组颜色未变，说明染病水样中含有溶藻弧菌。3)取正常自来水水样，按上述方法进行微生物的培养和样品的制备，然后用5'端标记有地高辛的适配子37 ( SEQ ID No. 3)按前面的亲和力测定方法进行检测，同时做一阳性对照(用溶藻弧菌作阳性对照)和阴性对照(用无菌蒸馏水作阴性对照)，结果显示阳性对照组颜色变黄，而实验组和阴性对照组颜色未变，说明正常自来水中不含溶藻弧菌。4)取市售活鱼的血清，按上述方法进行微生物的培养和样品的制备，然后用5'端标记有地高辛的适配子46 ( SEQ ID No. 4)按前面的亲和力测定方法进行检测，同时做一阳性对照(用溶藻弧菌作阳性对照)和阴性对照(用无菌蒸馏水作阴性对照)，结果显示阳性对照组颜色变黄，而实验组和阴性对照组颜色未变，说明该市售活鱼没有感染溶藻弧菌。
权利要求
1.一类可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列，其特征在于包括SEQ ID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4四条寡核苷酸序列，且采用其中一条就能完成溶藻弧菌识别检测。
2.一种如权利要求1所述的可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列的应用，其特征在于所述的寡核苷酸序列具有识别检测溶藻弧菌的用途，且采用上述四条寡核苷酸序列的任意一条就能够单独应用于溶藻弧菌的检测。
3.如权利要求2所述的一种可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列的应用，其特征在于所述的四条寡核苷酸序列的5'端均标记有地高辛。
全文摘要
本发明公开一类可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其应用，包括SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4四条寡核苷酸序列，且采用其中一条就能完成溶藻弧菌识别检测。本发明具有检测快速，操作简单，适配子的稳定性高于抗体的特点，而且制备容易，制备周期较短。
文档编号C12Q1/04GK102199667SQ201110090419
公开日2011年9月28日 申请日期2011年4月12日 优先权日2011年4月12日
发明者郑江, 郝聚敏 申请人:集美大学