专利名称：酵母展示脂肪酶催化合成l-抗坏血酸棕榈酸酯的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯的方法。
背景技术：
BHA、BHT、PG、TBHQ等合成抗氧化剂广泛用于食品工业，但是由于存在致癌，体内消化后有毒性等安全隐患，其食用越来越受质疑，天然抗氧化剂也因此备受青睐。L-抗坏血酸 (维生素C)是目前使用最多的天然抗氧化剂之一，随着两步发酵法生产维生素C技术的不断成熟，我国生产维生素C产量已居世界之首，生产成本也相对较低。然而，维生素C是水溶性的天然抗氧化剂，只能在水相体系发挥作用，但食品体系往往是油相或者是多相的，这就大大局限了维生素C的使用范围。将合适的亲油性基团“嫁接”到维生素C上合成脂溶性衍生物，从而改变其亲水性及溶解性可有效解决这一问题。L-抗坏血酸棕榈酸酯(L-ascorbyl palmitate)是维生素C上“嫁接”棕榈酸的衍生物，它是已被FDA及中国食品添加剂委员会批准使用的营养型抗氧化剂，在婴幼儿配方奶粉等食品行业中得到广泛应用。目前实现这一“嫁接”有化学法和生物酶法，由于化学法存在转化条件苛刻(强酸、碱催化、高温高压)、无特异性、产物复杂、副产物多、分离难、安全性差等弊端，生物酶法越来越受青睐。脂肪酶是目前维生素酯合成中使用最广泛的酶，但是生产成本高、固定化过程繁杂费时大大局限了其商业化应用。
发明内容
本发明提供了一种酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯的方法，可显著降低L-抗坏血酸棕榈酸酯生产成本，同时达到较高的酯化反应效率和产率。一种酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯的方法，包括将L-抗坏血酸和棕榈酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，无氧条件下于 50 60°C反应4 8小时，分离、纯化制得L-抗坏血酸棕榈酸酯。优选的，所述的有机溶剂为四氢呋喃。优选的，每升有机溶剂中L-抗坏血酸、棕榈酸和酵母展示脂肪酶的加入量分别为 15 35g、200 500g、50 100g。搅拌速率为200 250转/分钟。优选的，在分离纯化前加入分子筛，继续搅拌反应10 12h，锁住水分，促进酯化
反应进一步进行。所述的分离、纯化为离心取上清液，旋转蒸发除去有机溶剂，水洗后溶于正己烷，
重结晶。所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia paStoriS)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72 144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体PPIC9K中MF α 1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。所述的脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列，毕赤酵母(Pichia paStoriS)GS115为商业化产品，可从^witrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的 Genbank 号为]\C8164。载体PPIC9K为商业化产品(如hvitrogen公司)，它存在MF α 1信号肽序列(Genbank号Μ17301)，同时该载体内信号肽序列上游存在AOXl启动子(Genbank号 Ζ46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组，提高表达稳定性。优选的，所述生物印迹所用配体为油酸，它可以诱导酶结构改变，提高转化率。本发明通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115，毕赤酵母细胞诱导培养后，脂肪酶表达并分泌到胞外，同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展示脂肪酶对酯化反应进行催化，不仅提高了操作稳定性、耐热性以及重复性，而且反应产物单一(为6-0-Palmitoyl-L-ascorbic acid)，转化率(以 L-抗坏血酸计)在90%以上，产率高达87%。
具体实施例方式实施例1制备酵母展示脂肪酶通过人工合成的方法，合成米根霉(lihizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank 号AF229435)和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因(Genbank号为Μ28164)，同时在脂肪酶基因C端加上连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS (linker)，连接后得到核苷酸序列 pro-ROL-linker-α -agglutinin,同时在序列两端添加EcoR I和Not I酶切位点，其中 pro-ROL为脂肪酶基因，α-agglutinin为细胞壁α凝集素基因。以上述人工合成序列为模板，利用下述引物对，进行PCR扩增，上游引物5，-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3，；下游引物5，-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3，PCR反应体系为模板DNA为1 μ 1，高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1，dNTP (50mM) 0. 4 μ 1， 上下游引物各0. 5 μ 1，10XPCR缓冲液5 μ 1，加水至50 μ 1。PCR运行条件为94°C 3分钟，；35个循环(94°C 30秒，60°C 1分钟，72°C 30秒)， 72 V 10分钟。用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒，并在T4连接酶的作用下过夜连接形成PPIC9K-R0L质粒，通过电泳检验并回收质粒。为使目的基因与毕赤酵母GS115 发生His 4单位点置换重组，用Ml I对pPIC9K-R0L质粒进行酶切线性化处理。将酶切线性化处理好的目的基因约15 μ 1加入到事先准备好的毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Q，25uF条件下电击10ms，并加入约Iml预冷的山梨醇。将上述混勻的电转产物约400μ 1涂于MD平板上，筛选阳性转化子，然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上，根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株。
将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h，离心收集细胞；再将细胞置于含有0.5% (体积百分比)甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h，离心收集细胞， 用水冲洗后，接种至YGC培养基中30°C培养120h，然后3000g离心分钟收集菌体，蒸馏水洗涤后再用50mM pH7. 0磷酸缓冲液洗涤，然后与2倍体积油酸混合，-80°C下预冻后再经德国 Christ真空冷冻干燥机干燥Mh，用己烷洗涤除去油酸，再进行再真空干燥去除己烷，即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶。实施例2酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯实例1取L-抗坏血酸0. 176g、棕榈酸2. 308g，加入含有IOmL四氢呋喃的磨口三角瓶，混合、预热lOmin，然后加入上述酵母展示脂肪酶0. 5g，充队密封，置于85_1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为250转/分钟，反应温度保持在45°C，反应他后加入0. 5g分子筛(孔径小于2nm)，继续反应1 后停止搅拌，离心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子筛， 取上清液进行旋转蒸发除去四氢呋喃，水洗3次后加入正己烷于4°C结晶得L-抗坏血酸棕榈酸酯产品，烘干、粉碎即可。实例2取L-抗坏血酸0. 352g、棕榈酸4.616g加入含有IOmL四氢呋喃的磨口三角瓶，混合、预热lOmin，然后加入上述酵母展示脂肪酶lg，充队密封，置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为200转/分钟，反应温度保持在50°C，反应他后加入1. 5g分子筛(孔径小于2nm)，继续反应1 后停止搅拌，离心沉淀除去全细胞催化剂及分子筛，取上清液进行旋转蒸发除去四氢呋喃，水洗3次后加入正己烷于4°C结晶得L-抗坏血酸棕榈酸酯产品，烘干、粉碎即可。 实施例3采用传统化学法合成L-抗坏血酸棕榈酸酯实例1取L-抗坏血酸0. 176g、棕榈酸2. 308g，加入含有IOmL四氢呋喃的磨口三角瓶，混合、预热lOmin，充N2密封，置于85_1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为250转 /分钟，反应温度保持在45°C，反应Mi后加入0. 5g分子筛(孔径小于2nm)，继续反应1 后停止搅拌，离心沉淀除去分子筛，取上清液进行旋转蒸发除去四氢呋喃，水洗3次后加入正己烷实施例4测定转化产率和转化率取ImL未分离的反应产物，离心去除催化剂和分子筛，旋转蒸发溶剂，用100%甲醇准确定容至10mL，该溶液经0. 22 μ m有机滤膜过滤后用高效液相色谱(HPLC)测定溶液各组分浓度。HPLC条件如下Agilent Technologies 1200系列高效液相色谱液，色谱柱Grace Prevail Organic Acid5u 150mmX 4. 6mm，柱温40°C，流动相甲醇 / 水 / 磷酸 (85/15/0. 1)，流速lmL/min，进样量10 μ L，检测波长:254nm0产率计算公式如下产率=C ester/ (C L-ascorbic acid+C ester),式中C ester为HPLC测定样品中L_抗坏血酸棕榈酸酯的浓度，CL-ascorbic acid为样品中L-抗坏血酸的浓度。酯化反应效率转化率=CL-ascorbic acid(反应后)/C L-ascorbic acid(反应前)X 100%。通过上述方法检测计算，实施例2中，实例1合成L-抗坏血酸棕榈酸酯的产率和反应效率分别为87%和90%，实例2合成L-抗坏血酸棕榈酸酯的产率和反应效率分别为
588%和87%。而实施例3采用传统化学法合成L-抗坏血酸棕榈酸酯的产率和转化效率分别为68%和75%。
权利要求
1.一种酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯的方法，包括将L-抗坏血酸和棕榈酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，无氧条件下于50 60°C反应4 8小时，分离、纯化制得L-抗坏血酸棕榈酸酯； 所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia paSt0riS)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72 144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；所述的重组质粒由原始载体PPIC9K和依次插入原始载体pPIC9K中MFa 1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以每升有机溶剂计，L-抗坏血酸、棕榈酸和酵母展示脂肪酶的加入量分别为15 35g、200 500g、50 100g。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有机溶剂为四氢呋喃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物印迹中采用的配体为油酸。
全文摘要
本发明公开了一种酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯的方法，包括将L-抗坏血酸和棕榈酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，无氧条件下于50～60℃反应4～8小时，分离、纯化制得L-抗坏血酸棕榈酸酯；将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；本发明通过将脂肪酶展示在细胞外，利用该酶制剂催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯，不仅提高了转化效率，而且缩短了反应时间，降低了生产成本。
文档编号C12N15/63GK102212575SQ20111011043
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月28日 优先权日2011年4月28日
发明者何国庆, 周陈伟, 地里热巴, 徐娟, 林吉恒, 王睿之, 阮晖 申请人:浙江大学