专利名称：球虫细胞培养模型及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞培养模型，尤其涉及一种球虫细胞培养模型及其应用。
背景技术：
鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于鸡肠道上皮细胞引起的一种原虫病，广泛分布于世界各地，是目前危害养鸡业的重要疾病之一。其生活史较为复杂，需经历孢子生殖、裂殖生殖、配子生殖等发育阶段。细胞培养能为球虫研究提供洁净无污染的环境，同时使人们渴望在“无控”和“透明”环境下研究抗球虫药物的作用机制、活性以及球虫的发育、行为、 结构、免疫、遗传、细胞化学和生物化学等的梦想成为现实。球虫的传代细胞培养是球虫在体外合适的传代细胞体系中进行发育的过程，目前多集中于柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)培养方面，子孢子入侵细胞后只能发育为第1代裂殖子或第2代裂殖体阶段，但这并不妨碍传代细胞培养模型在鸡球虫研究领域中的应用。子孢子入侵宿主细胞进行裂殖生殖是球虫感染的关键，是理想的抗球虫药物作用的最佳阶段。此外，球虫的传代细胞培养模型还可以直观呈现虫体(子孢子)入侵宿主细胞后发育的动态变化过程，成为基因或蛋白功能研究有效的展示平台，被广泛用于基因和蛋白功能的研究。但是，目前缺乏高效、应用广泛的球虫细胞培养模型。鸡胚成纤维细胞系(ChickenEmbryo Fibroblast Cell line, DF-1)是一种稳定的传代细胞系，来源于East Lansing Line (ELL-O)鸡胚成纤维细胞，主要用于病毒研究领域，如病毒疫苗生产，重组病毒或蛋白的表达载体。到目前为止，还没有出现将该DF-I细胞培养体系应用于球虫细胞培养并建立球虫细胞培养模型的公开报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种球虫细胞培养模型，该细胞培养模型是首次将DF-I细胞培养体系用于球虫细胞培养而建立的球虫细胞培养模型，其应用广泛、效果好。此外，还需要提供一种上述球虫细胞培养模型的应用。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一个方面，提供了一种球虫细胞培养模型，所述球虫细胞培养模型是通过将柔嫩艾美耳球虫子孢子接种入鸡胚成纤维细胞系DF-I细胞，并使其在DF-I细胞中发育至第一代裂殖子而建成。在本发明的另一方面，提供了一种球虫细胞培养方法，包括以下步骤将柔嫩艾美耳球虫子孢子接种入DF-I细胞，并使其在DF-I细胞中发育至第一代裂殖子。优选的，所述DF-I细胞在接入子孢子之前，该DF-I细胞以1 50万个细胞/孔的细胞铺板剂量铺被微孔板。更优选的，所述DF-I细胞在接入子孢子之前，以10万个细胞 /孔的细胞铺板剂量铺被微孔板。因为随着DF-I细胞铺板剂量增大，子孢子的入侵率有所降低，结合流式细胞仪检测所需细胞数量考虑，确定最佳铺板剂量为10万个细胞/孔。优选的，所述柔嫩艾美耳球虫子孢子的接种剂量为1 50万个/孔。更优选的， 所述柔嫩艾美耳球虫子孢子的接种剂量为30万个/孔。随着子孢子的接种剂量增大，子孢子的入侵率逐渐增大，但当子孢子接种剂量为30万/孔时，子孢子入侵率的增加趋势平缓， 因此确定子孢子的最佳接种剂量为30万个/孔。优选的，所述DF-I细胞在接入子孢子之后，细胞培养基中添加浓度小于等于5% 的血清。当培养基中血清浓度为5%时，子孢子的入侵率最高，但随着血清浓度的增大，子孢子的入侵率逐渐降低，因此确定子孢子接种后培养基中的血清添加浓度不应大于5%。在本发明的另一方面，还提供了一种球虫子孢子入侵活力的检测方法，包括以下步骤用荧光探针标记柔嫩艾美耳球虫子孢子；将荧光标记的子孢子接种入DF-I细胞培养；用流式细胞仪检测球虫子孢子的入侵细胞数，并用下述公式计算出子孢子的入侵率，子孢子的入侵率=100% X [入侵细胞数/(未入侵细胞数+入侵细胞数)]。优选的，在荧光标记的子孢子接种入DF-I细胞后8 12小时，用流式细胞仪检测该球虫子孢子的入侵细胞数。子孢子在接种DF-I细胞后8h时入侵率最高，但随着入侵时间的变长，子孢子的入侵率逐渐降低，因此选择在子孢子接种细胞后8-12h检测子孢子的
入侵率。优选的，所述子孢子在荧光标记后的48小时内用于接种DF-I细胞。因为随着标记子孢子保存时间的延长，入侵活力逐渐降低。在本发明的另一方面，还提供了一种上述球虫细胞培养模型的应用，用于筛选抗球虫药物。本发明的球虫细胞培养模型，子孢子对DF-I细胞的入侵能力强，可用于建立客观衡量子孢子入侵活力的检测方法。该球虫细胞培养模型不仅适用于抗球虫药物的筛选，而且适用于对球虫发育过程中的基因或蛋白功能的研究。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。图1是本发明实施例2接种柔嫩艾美耳球虫子孢子的DF-I细胞图；图2是本发明实施例3建立柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵活力检测体系的荧光显微镜图及流式细胞仪检测结果图；图3是本发明实施例3柔嫩艾美耳球虫子孢子接种DF-I细胞后不同检测时间的子孢子入侵率曲线图；图4是本发明实施例3柔嫩艾美耳球虫子孢子保存时间与入侵活力的曲线图；图5是本发明实施例3柔嫩艾美耳球虫子孢子在37°C和41°C培养温度下对五种细胞的入侵率柱状图；图6是本发明实施例4四种培养基对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵率的影响的柱状4
图7是本发明实施例4细胞铺板量对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵率的影响的曲线图；图8是本发明实施例4柔嫩艾美耳球虫子孢子接种剂量对入侵率的影响的曲线图；图9是本发明实施例4培养基中添加血清量对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵率的影响的曲线图；图10是本发明实施例5不同浓度的子孢子多抗对子孢子入侵的免疫抑制作用曲线图；图11是本发明实施例6不同浓度的三元代吡咯类药物对子孢子入侵的抑制作用曲线图。
具体实施例方式本发明首次将鸡胚成纤维细胞培养体系(DF-I)应用于球虫体外细胞培养，发育至第1代裂殖子，建立了新的适合柔嫩艾美耳球虫发育的体外细胞培养模型，并将其作为研究子孢子入侵活力检测的平台进行培养条件优化，应用于球虫子孢子的入侵功能研究。 本发明球虫体外细胞培养模型可用于抗球虫药物的筛选，也可用于对球虫发育过程中的基因或蛋白功能的研究。实施例1柔嫩艾美耳球虫子孢子的收集和纯化卵囊的纯化参照《高级寄生虫学实验指导》球虫卵囊的分离纯化技术，在实验操作过程中略做修改(索勋等，2006)。(1)将柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊按IX IO4个/只接种14日龄无球虫雏鸡，在感染后第8天剖杀鸡取盲肠收集未孢子化卵囊，28°C培养至完全孢子化，收集孢子化卵囊置于4°C保存，保存期为1-2月。(2)4°C保存的E. tenella孢子化卵囊，室温，2500r/min离心lOmin。去除重铬酸钾后，沉淀中加入适量的蒸馏水，悬浮沉淀，2500r/min离心lOmin，去上清液。重复几次，以
尽量除去残留的重铬酸钾。(3)弃上清，沉淀中加入30%的次氯酸钠，搅拌均勻后室温下静止30min，吸取液体上方的白色悬浮物。(4)力卩 10 倍量的灭菌 HBBS (KCl 0. 4g/L, KH2PO4O. 06g/L, NaCl 8. Og/L, NaHCO3O. 35g/L)稀释，3500r/min离心lOmin，沉淀用灭菌HBBS洗涤2 3次后，除去次氯酸钠，收集孢子化卵囊。子孢子的制备参照宋翠萍等(1998)建立的方法，在操作过程中做了相应的修改。(1)将纯化的孢子化卵囊，用玻璃勻浆器破碎卵囊，PBS洗涤离心后收集孢子囊， 收集的孢子囊用HBBS悬浮后加入5 % 10 %的鸡胆汁和0. 25 % 1 %的胰蛋白酶，混勻后 41°C水浴至90%的子孢子溢出。(2)离心收集含子孢子的粗提液，HBBS悬浮后，用G3砂芯漏斗过滤，收集滤液， 2000r/min离心5min，收集沉淀，用IOmLHBBS悬浮子孢子，用血球计数板对子孢子进行计数。(3)取定量后的子孢子，2000r/min离心5min，用含500U双抗的DMEM培养基(血清含量为10% )悬浮子孢子，置于37°C孵育Ih后备用。实施例2柔嫩艾美耳球虫DF-I细胞培养模型的建立用0. 25 %的胰酶消化生长状态良好的DF-I细胞，2 4min后收集细胞，用细胞计数板计数后，用含10%的DMEM稀释后，以1 X IO5铺被24孔板，37°C，5% CO2培养24h (见图1A)，每孔接入1父105个子孢子，411，5% CO2培养，可见子孢子可在24h内入侵DF-I细胞(如图1B)，在60h内发育为第1代裂殖体(见图1C)，在72h是可在细胞上清中观察到大量的游离的第1代裂殖子(见图1D)，小部分裂殖子可以继续入侵DF-I细胞，但未见裂殖子继续发育为卵囊。实施例3柔嫩艾美耳球虫DF-I细胞模型在建立子孢子入侵活力检测方法中的应用1.柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵活力检测方法的建立将纯化后的柔嫩艾美耳球虫子孢子进行计数，按CFDA SE细胞增殖与示踪检测试剂盒操作步骤标记子孢子，接种DF-I细胞培养，检测前用PBS清洗2次，胰酶消化收集细胞，用流式细胞仪检测球虫子孢子的入侵细胞数，从而计算出子孢子的入侵率，公式为子孢子的入侵率=100% X [入侵细胞数/(未入侵细胞数+入侵细胞数)]。试验设立正常 DF-I细胞和CFDA SE (荧光探针5 (6)-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯)标记的子孢子对照组。可见用CFDA SE标记的子孢子荧光非常均勻和稳定(见图2A)，将标记后的子孢子接入DF-I细胞，在显微镜可见荧光标记的子孢子入侵DF-I细胞(见图2B)，利用流式细胞仪和RXP分析软件可明显区分游离的子孢子、正常的DF-I细胞和子孢子入侵的DF-I细胞 (见图2C、D、E)，从而得出子孢子入侵率，对子孢子入侵活力进行量化。在图2中，A =CFDA SE标记后的子孢子；B 荧光标记子孢子接入20h时的DF-I细胞；C =CFDA SE标记后的子孢子流式细胞仪检测结果；D =DF-I正常细胞的流式细胞仪检测结果；E 荧光标记子孢子接入 20h时DF-I细胞的流式细胞仪检测结果。2.子孢子入侵的最佳检测时间的确定由于子孢子在细胞内发育时，标记的CFDA SE荧光会减弱，确定流式细胞仪的最佳检测时间有利于观察到最强的荧光信号，保证获得数据的准确性。将标记后的子孢子接种 DF-I细胞，分别收取4h、8h、12h、16h、20h、24h时间段的细胞，比较不同时间的子孢子入侵率变化。结果发现子孢子在8h时入侵率最高(39%)，随着入侵时间的变长，子孢子的入侵率逐渐降低，因此选择在子孢子接种细胞后8-12h检测子孢子的入侵率(见图3)。3.柔嫩艾美耳球虫子孢子保存时间将标记后的子孢子置于4°C避光保存，间隔24h取样接种DF-I细胞，测定子孢子入侵细胞活力，确定荧光标记的子孢子保存时间。结果可见随着子孢子保存时间的延长，入侵活力逐渐降低，因此标记后48h小时内的子孢子可用于入侵活力的检测(见图4)。4.柔嫩艾美耳球虫对五种培养细胞的入侵活力比较分别在37°C和41°C培养条件下，用已建立的检测方法比较子孢子对DF-1、MDBK、 MDCK、VERO、BHK五种细胞的入侵活力。结果可见DF-I细胞在两种温度下的入侵率均高于其他细胞，其次是MDBK细胞和BHK细胞，VERO细胞和MDCK细胞的入侵率较低(见图5)。实施例4促进DF-I细胞培养体系中虫体入侵的培养条件优化1.培养基的选择
分别用1640、F22、M199、DMEM(Gibco)为基础培养基用于DF-1的培养，接种子孢子后，比较四种培养基对子孢子入侵活力的影响。结果可见DMEM对细胞的培养效果优于其他培养基，因此选用DMEM作为DF-I细胞的基础培养基(见图6)。2.细胞铺板剂量的优化分别以50万、40万、30万、20万、10万、5万、1万的DF-I细胞铺被24孔板，37°C， 5% CO2培养24h，每孔接种1 X IO5个子孢子，研究细胞铺板剂量对子孢子入侵率的影响。结果可见随着细胞铺板剂量增大，子孢子的入侵率有所降低，结合流式细胞仪检测所需细胞数量考虑，确定最佳铺板剂量为10万(见图7)。3.子孢子接种剂量的优化以确定的DF-I细胞铺板剂量进行铺被24孔板，接入不同剂量的子孢子，分别为 50万、40万、30万、20万、10万、5万、1万，研究子孢子接种剂量对子孢子入侵率的影响。结果可见随着子孢子的接种剂量增大，子孢子的入侵率逐渐增大，但当子孢子接种剂量为30 万/孔时，子孢子入侵率的增加趋势平缓，因此确定子孢子的最佳接种剂量为30万/孔(见图8)。4.培养基血清浓度的优化以确定的DF-I细胞铺板剂量进行铺被24孔板，接入确定最佳接种剂量的子孢子后，分别在基础培养基DMEM中添加的胎牛血清，含量为20%、15%、10%、5%、2%、1%，研究培养基中不同血清浓度对子孢子入侵率的影响。结果可见培养基中血清浓度为5%时，子孢子的入侵率最高。但随着血清浓度的增大，子孢子的入侵率逐渐降低(见图9)，因此确定子孢子接种后培养基中的血清添加浓度不应大于5%。实施例5柔嫩艾美耳球虫DF-I细胞模型在子孢子入侵抑制方面的应用利用本实验室制备的兔抗子孢子蛋白多抗，进行子孢子入侵的免疫抑制试验，评价在优化后的培养条件下，新细胞模型DF-I细胞的应用效果。多抗血清使用前经Protein A Agarose纯化，再用不同浓度纯化的多抗分别与⑶FA SE标记的子孢子在37°C共孵育2h， 4000r/min离心去除未作用的抗体，将子孢子接种DF-I细胞，测定子孢子的入侵率，同时设立未加抗体的阳性对照组，计算公式为抗体的免疫抑制率=100% X[l_(抗体作用的子孢子入侵率/未经抗体作用的子孢子入侵率)]。抗子孢子多抗对子孢子入侵细胞的免疫抑制率，随着抗体浓度的增大而增大，当抗体浓度达到200 μ g时，对子孢子的抑制效率基本保持不变(见图10)。实施例6柔嫩艾美耳球虫DF-I细胞模型在筛选抗球虫药物方面的应用三元代吡咯类药物对弓形虫和球虫入侵宿主细胞有明显的抑制作用，因此本研究利用市场上现有的三元代吡咯类药物在DF-I细胞中进行球虫子孢子的入侵抑制试验， 评价DF-I细胞模型在抗球虫药物筛选方面的应用效果，用不同浓度(10 μ mol/L, 1 μ mol/ L，0. 1 μ mol/L,0. 01 μ mol/L,0. 001 μ mol/L)的三元代吡咯类药物分别与CDFA SE标记的子孢子在37°C共孵育2h，4000r/min离心去除多余的药物，将子孢子接种DF-I细胞， 测定子孢子的细胞入侵率，同时设立未加药物的阳性对照组，计算公式为药物抑制率= 100% X [1_(药物作用的子孢子入侵率/未经药物作用的子孢子入侵率)]。可见子孢子的细胞入侵抑制率随药物浓度的增大而增大，当药物浓度小于0. 01 μ mol/L时，对子孢子的入侵细胞基本没有影响，因此可以确定该药物的有效药物浓度应大于0. 01 μ mol/L(见图
711)。 以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
权利要求
1.一种球虫细胞培养模型，其特征在于，所述球虫细胞培养模型是通过将柔嫩艾美耳球虫子孢子接种入鸡胚成纤维细胞系DF-I细胞，并使其在DF-I细胞中发育至第一代裂殖子而建成。
2.一种球虫细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤将柔嫩艾美耳球虫子孢子接种入DF-I细胞，并使其在DF-I细胞中发育至第一代裂殖子。
3.根据权利要求2所述的球虫细胞培养方法，其特征在于，所述DF-I细胞在接入子孢子之前，该DF-I细胞以1 50万个细胞/孔的细胞铺板剂量铺被微孔板。
4.根据权利要求3所述的球虫细胞培养方法，其特征在于，所述DF-I细胞在接入子孢子之前，该DF-I细胞以10万个细胞/孔的细胞铺板剂量铺被微孔板。
5.根据权利要求3所述的球虫细胞培养方法，其特征在于，所述柔嫩艾美耳球虫子孢子的接种剂量为30万个/孔。
6.根据权利要求2所述的球虫细胞培养方法，其特征在于，所述DF-I细胞在接入子孢子之后，细胞培养基中添加浓度小于等于5%的血清。
7.—种球虫子孢子入侵活力的检测方法，其特征在于，包括以下步骤 用荧光探针标记柔嫩艾美耳球虫子孢子；将荧光标记的子孢子接种入DF-I细胞培养；用流式细胞仪检测球虫子孢子的入侵细胞数，并用下述公式计算出子孢子的入侵率， 子孢子的入侵率=100% X [入侵细胞数/(未入侵细胞数+入侵细胞数)]。
8.根据权利要求7所述的球虫子孢子入侵活力的检测方法，其特征在于，在荧光标记的子孢子接种入DF-I细胞后8 12小时，用流式细胞仪检测该球虫子孢子的入侵细胞数。
9.根据权利要求7所述的球虫子孢子入侵活力的检测方法，其特征在于，所述子孢子在荧光标记后的48小时内用于接种DF-I细胞。
10.权利要求1所述球虫细胞培养模型的应用，其特征在于，用于筛选抗球虫药物。
全文摘要
本发明公开了一种球虫细胞培养模型，所述球虫细胞培养模型是通过将柔嫩艾美耳球虫子孢子接种入鸡胚成纤维细胞系DF-1细胞，并使其在DF-1细胞中发育至第一代裂殖子而建成。本发明还公开了上述球虫细胞培养模型在筛选抗球虫药物中的应用。本发明球虫细胞培养模型，可用于建立客观衡量子孢子入侵活力的检测方法，不仅适用于抗球虫药物的筛选，而且适用于对球虫发育过程中的基因或蛋白功能的研究。
文档编号C12Q1/02GK102220279SQ20111011593
公开日2011年10月19日 申请日期2011年5月5日 优先权日2011年5月5日
发明者姜连连, 孔春林, 曾艳波, 朱顺海, 李婷, 程军, 董辉, 赵其平, 韩红玉, 马卫娇, 黄兵 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所