专利名称：预测吉非替尼疗效的fas-670a/g基因分型检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种预测吉非替尼疗效的FAS-670A/G基因分型检测试剂盒。
背景技术：
肺癌是最常见、死亡率最高的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率还在逐年增加。其中非小细胞肺癌(NSCLC)占整个肺癌的80%以上，并且大部分患者在诊断时已经是晚期。 化疗曾经是晚期非小细胞肺癌最主要的治疗手段，但即便是最好的化疗方案，目前治疗的总有效率也不足50%，1年生存率仅40%左右。靶向治疗药物的出现改变了非小细胞肺癌的治疗现状，显著地提高了患者的生存期。其中吉非替尼(Gefitinib，ZD1839)是最早上市、目前临床应用最为广泛的非小细胞肺癌靶向治疗药物，属于一种选择性、可逆性EGFR(表皮生长因子受体)酪氨酸激酶抑制剂， 目前在包括中国在内的许多国家已经上市，商品名为易瑞沙(Iressa)。吉非替尼治疗非小细胞肺癌的客观有效率差异很大，文献报道从8. 9-69%不等。 其中在IDEALl临床研究中，日本人的有效率为27%，而美国人则仅为12%。而在EAP研究中，中国人的有效率约为30%。以上均提示吉非替尼治疗非小细胞肺癌的临床疗效存在着显著的个体差异。由于晚期非小细胞肺癌患者生存期很有限，因此尽早选择最可能有效的药物治疗对延长患者生存尤为重要。加之吉非替尼为代表的靶向治疗药物比较昂贵，价格是普通化疗的数十倍，从卫生经济学的角度也要求选择最可能获益的患者接受靶向治疗。 因此，寻找吉非替尼疗效预测指标，指导个体化靶向治疗，是目前亟待解决的关键性临床问题。目前最常用于预测吉非替尼疗效的生物标记物为EGFR基因的突变，主要为外显子19的碱基缺失(G2235-A2249缺失)和外显子21的点突变(L858R)。一项针对ISEL国际多中心III期临床研究的生物标记物回顾性分析发现，存在EGFR基因突变的16例NSCLC 患者接受吉非替尼治疗后的有效率为37.5%，而EGFR基因野生型的116例患者吉非替尼的有效率仅为2.6%。但是EGFR基因突变作为吉非替尼疗效预测的生物标记物，存在一定的不足①突变的检测需要肿瘤组织，而大部分肺癌在初次诊断时已经是晚期，失去手术获得肿瘤标本的机会，即便是少部分患者有可能活检取得标本，也会因为检出率有限和活检标本量限制，难以进行突变检测，目前临床上能够满足突变检测要求的患者比例少于20% (ISEL研究中约为17% )；②基因突变受肿瘤异质性的影响，同一患者在不同部位或者疾病不同阶段获得的肿瘤标本，其突变检测结果可能存在差异，因此检测到的结果可能不能代表全身和全程的肿瘤特点；③突变检测的流程复杂，仪器设备的要求高，一般实验室难以开展，同时检测成本也高，影响了其广泛的临床应用；④突变作为疗效预测指标，其敏感性不高(ISEL研究中为68.8%)，而针对吉非替尼这样昂贵的治疗药物，敏感性高的临床指导意义更大。基于以上EGFR基因突变的不足之处，开发更理想的疗效预测生物标记物及其检测方法的临床需求显得更为迫切。
发明内容
本发明的目的是提供一种预测吉非替尼疗效的FAS-670A/G基因分型检测试剂盒。本发明提供了辅助预测非小细胞肺癌患者吉非替尼疗效的专用引物，是PCR扩增包括序列表的序列3自5'末端第301位脱氧核糖核苷酸(FAS-670A/G)在内的DNA片段所用的引物对。所述专用引物可为PCR扩增包括序列表的序列3所示核苷酸在内的DNA片段所用的引物对。所述专用引物具体可为由序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2 所示DNA片段组成的引物对。本发明还保护所述专用引物在制备辅助预测非小细胞肺癌患者吉非替尼疗效的试剂盒中的应用。本发明还保护所述专用引物和限制性内切酶krF I在制备辅助预测非小细胞肺癌患者吉非替尼疗效的试剂盒中的应用。本发明还保护一种辅助预测非小细胞肺癌患者吉非替尼疗效的试剂盒，包括所述专用引物。所述试剂盒还可包括限制性内切酶krF I。以待测非小细胞肺癌患者的基因组DNA为模板，用所述专用引物进行PCR扩增，用限制性内切酶krF I酶切所述PCR扩增的产物，得到酶切产物；如果酶切产物为136bp和 57bp的片段，所述患者的基因型为GG;如果酶切产物为193bp的片段，所述患者的基因型为 AA ；如果酶切产物为193bp+136bp和57bp的片段，所述患者的基因型为GA。如果待测患者为非GG基因型(AA基因型或GA基因型)，待测患者为候选的应用吉非替尼治疗有效的患者；如果待测患者为GG基因型，待测患者为候选的应用吉非替尼治疗无效的患者。发明人研究发现，FAS基因单核苷酸多态(FAS-670A/G)是一种可预测吉非替尼治疗非小细胞肺癌疗效的生物指标。FAS基因(TNF receptor superfamily, member 6) 属于 TNF 受体家族，有时又称为 APT1、CD95、FASU APO-U FASTM、ALPS1A、TNFRSF6。FAS 基因在NCBI GENBANK中的序列号为NG_009089. 2 (range :5001. . 30255)。单核苷酸多态 (FAS-670A/G)位于FAS基因上游(启动子区)，见序列表的序列3。(FAS-670A/G)的rs号为 rsl800682o以FAS-670A/G基因多态检测作为吉非替尼疗效预测指标，能在一定程度上克服现行预测指标(EGFR基因突变)的部分缺点①FAS-670A/G检测的标本可以来源自任何正常或肿瘤组织的有核细胞，最简便的方法是2ml外周血即可，因此几乎所有患者均可以获得检测标本；②FAS-670A/G属于遗传变异，检测结果不受肿瘤异质性的影响，在患者一生中任何时候取得标本，或者取自任何部位标本，其检测结果应保持一致；③FAS-670A/G检测流程相对简便、设备要求低、成本低廉，有利于临床推广；④FAS-670A/G作为疗效预测指标，其敏感性显著高于基因突变，检测结果对预测患者获益的把握性更高，因此更适合中国当前的卫生经济学要求。EGFR基因突变预测疗效和FAS-670A/G预测疗效的对比见表1。表1 EGFR基因突变预测疗效和FAS-670A/G预测疗效的对比
权利要求
1.辅助预测非小细胞肺癌患者吉非替尼疗效的专用引物，是PCR扩增包括序列表的序列3自5'末端第301位脱氧核糖核苷酸在内的DNA片段所用的引物对。
2.如权利要求1所示的引物对，其特征在于所述专用引物是PCR扩增包括序列表的序列3所示核苷酸在内的DNA片段所用的引物对。
3.如权利要求2所述的专用引物，其特征在于所述专用引物是由序列表的序列1所示DNA片段和序列表的序列2所示DNA片段组成的引物对。
4.权利要求1至3中任一所述专用引物在制备辅助预测非小细胞肺癌患者吉非替尼疗效的试剂盒中的应用。
5.权利要求1至3中任一所述专用引物和限制性内切I在制备辅助预测非小细胞肺癌患者吉非替尼疗效的试剂盒中的应用。
6.辅助预测非小细胞肺癌患者吉非替尼疗效的试剂盒，包括权利要求1至3中任一所述专用引物。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括限制性内切酶义评I。
全文摘要
本发明公开了一种预测吉非替尼疗效的FAS-670A/G基因分型检测试剂盒。本发明提供了一种专用引物，是PCR扩增包括FAS-670A/G在内的片段所用的引物对，具体可为由序列1所示DNA片段和序列2所示DNA片段组成的引物对。应用本发明的专用引物辅助预测患者应用吉非替尼治疗非小细胞肺癌疗效具有如下优点①检测的标本可来自任何正常或肿瘤组织的有核细胞，因此几乎所有患者均可以获得检测标本；②FAS-670A/G属于遗传变异，检测结果不受取材时机或取材部位的任何影响；③检测流程相对简便、设备要求低、成本低廉；④敏感性显著高于基因突变，检测结果对预测患者获益的把握性更高，因此更适合中国当前的卫生经济学要求。
文档编号C12Q1/68GK102230012SQ20111016570
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月20日 优先权日2011年6月20日
发明者马飞 申请人:中国医学科学院肿瘤医院