专利名称：一种海洋油污微生物菌群的筛选和驯化方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属海水处理领域，涉及一种海洋油污微生物菌群的筛选和驯化方法，适合海洋油污废水和污泥生物修复和生物处理。
背景技术：
石油是非常宝贵的燃料、润滑剂和化工原料。随着经济和社会的迅速发展，油类及其产品广泛地用于国民经济的各个领域和人类的日常生活中，而且其使用量与日俱增。随着世界对石油及其制品日益增长的需求，在海上开采、运输、装卸以及利用石油过程中溢油事故日益增多，使大量石油进入水体、流入海洋。油类污染物质已经成为海洋的主要污染物之一。石油进入海洋水体后，对水生态环境造成严重破坏，使大量水生生物死亡，并对水资源、生物资源和养殖、旅游业带来巨大损失[C. J . Camphuysen, M Heubeek. Marine oil pollution and beached bird surveys :thedevelopment of a sensitive monitoring h3stnnment 们.Environmental pollution. 2001，443-461]。目前，海洋石油污染治理己被列入“21世纪重大议程”，成为当今环境工作者研究的热点问题。目前海洋油污处理方法主要有物理方法，化学方法和生物方法。物理方法适用于较厚油层的回收处理，但其对于厚度小于0. 3cm的薄油层和乳化油效果较差，且受风浪和石油性质等因素的限制。化学方法成本高，且容易造成二次污染。与传统的物理、化学方法相比，生物修复方法能够更有效地清除海洋石油污染，对人和环境造成的影响小，它能够使污染物最终分解为二氧化碳和水，而且生物修复过程迅速，费用低，修复费用仅为传统物理、化学修复的 30%-50% [Hicksbn. Caplanja, Bioremediati =Anatural solution [J]. Pollution Engineering,1993,25(2) :30-33]。通过近些年的研究虽然已发现了大量的可降解石油微生物，但最大问题缺少稳定和适应性强的菌株，并且某一种类的微生物只能对特定的石油组分有降解作用。在目前的海洋石油降解菌群筛选中，主要存在着驯化时间长，盐度适应不够和筛选过程繁琐等问题。 因此，针对海水的高盐度，研究高效石油降解混合菌群对海洋油污的生物修复和生物处理具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种海洋油污微生物菌群的筛选和驯化方法，通过以下步骤实现
1.装置设计设计一种用于模拟海滩溢油生物修复的装置，由缸体、隔板、右温度计、 左温度计、造浪器、控温装置和照明装置组成，缸体底部两边设有右出水管口和左出水管口，并相应设有右水阀和左水阀，在缸体中间设有一可卸载的隔板，将缸体分隔成左右2个空间，在缸体左右两侧分别安装左温度计和右温度计，从外部可观察到温度计的读数，缸体右侧安装有可卸载的人工造浪器，造浪器通过吸盘吸住缸体内壁，控温装置也通过吸盘吸住缸体内壁以固定，可卸载照明装置安装在缸体上部，人工造浪器和控温装置、照明装置分
4别通过插头连接外接电源。缸体材料选用透明的普通玻璃或有机材料。2.菌源样品采集从静水层中收集水样，从油污泥表层中采集0. 5-1. Okg污泥样， 分别置于无菌器皿中，在M小时内进行步骤(3 )富集培养或4°C下密封保存。3.菌群富集
取水样IOml和污泥样品0. 5g放于500ml —代富集培养基中，在25°C，140rpm下进行摇床富集培养一天时间，即获得一代富集菌群培养液；
经过第一步的富集培养后，按照一代富集菌群培养液二代富集培养基=1:10的比例， 将一代富集菌群培养液添加到二代富集培养基中，在25°C，140rpm下继续富集培养一天， 至油水混合现象出现，即获得二代富集菌群培养液；
然后取二代富集菌群培养液，按照二代富集菌群培养液三代富集培养基=1:10的比例添加到三代富集培养基中，在25°C，140rpm下继续富集培养，至油水混合现象出现，至此富集完毕，得到三代富集菌群培养液。其中一代富集培养基组成
酵母提取物(Yeast extract)1 g/L
蛋白胨(P印tone)5 g/L
尿素1.6 g/L
K2HPO48 g/L
油污(原油柴油=1:5)5 g/L
海水1 L
pH7.0 士 0.5 温度25 °C。
二代富集培养基组成
酵母提取物(Yeast extract)1 g/L
蛋白胨(P印tone)5 g/L
尿素1.6 g/L
K2HPO48 g/L
油污(原油柴油=1:5)10 g/L
海水1 L
pH7.0 士 0.5 温度25 °C。
三代富集培养基组成
酵母提取物(Yeast extract)1 g/L
蛋白胨(P印tone)5 g/L
尿素1.6 g/L
K2HPO48 g/L
油污(原油柴油=1:5)20 g/L
海水1 L
pH7.0 士 0.5 温度25V。
5
(4)菌群驯化
将步骤(3)得到的三代富集培养菌群培养液按照体积比为1:100的比例加到盛有含油量质量体积比1%的油污废水的模拟装置右侧的油污废水中，同时按照浓度比生化需氧量 尿素磷酸二氢钾=100:5:1将尿素和磷酸二氢钾混合，温度25°C，进行驯化处理，连续换水三次后，缸体底部即为驯化好的微生物菌群。本发明的另一个目的是提供上述方法在海洋油污事故地区的油污生物降解中的应用。本发明提供的方法是一种，经济，高效的海洋油污降解微生物的筛选及驯化方法， 菌群在驯化后可快速适应油污环境、生态安全，无污染。本技术菌群筛选快速，适应高盐度， 适用于海洋油污的原位修复。本发明的特点主要有1.经济，成本低菌源取自污染区及附近，同时无需大型设备投资和试剂费用，成本低，利于推广。2.效率高筛选出的菌群比单株石油降解菌株效果好，菌群内部各菌株协同作用，高效降解油污。3.快速适应一般筛选出的菌群1-2天就可迅速在污染区快速繁殖，且由于本身菌群适应一定盐度，所以可以更快的应用于海洋油污事故。本发明快速，经济，高效，环保，是海洋油污微生物筛选驯化方法的理想选择。
图1是使用本发明方法进行菌群驯化的模拟装置结构示意图。图2为本发明使用状态结构示意图。图3为通过本方法筛选出的菌群一、菌群二与单菌3XG-1，L2, 1中 XS, 2XS-2, 3XS-1, 2中XD-16株单菌降解率的比较。
具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例1
参见图1，一种模拟海滩溢油生物修复的装置，主要由缸体11、隔板3、右温度计4、左温度计5、造浪器6、控温装置7和照明装置8组成，缸体11底部两边设有右出水管口 1和左出水管口 9，并相应设有右水阀2和左水阀10，在缸体中间设有一可卸载的隔板3，将缸体 11分隔成左右2个空间，在缸体左右两侧分别安装左温度计5和右温度计4，从外部可观察到温度计的读数，缸体11右侧安装有可卸载的VP-201人工造浪器6，造浪器6通过吸盘吸住缸体内壁，HT-75W控温装置7也通过吸盘吸住缸体内壁以固定。在缸体上部安装对可卸载照明装置8，人工造浪器6和控温装置7、照明装置8分别通过插头连接外接电源。缸体 11材料选用透明的普通玻璃或有机材料。实施例2 (1)菌源样品获得
水样采集采用无菌蓝口瓶静水层中收集水样约500ml，污泥样采集是从油污泥表层采集约0. 5-1. Okg置于无菌器皿中，所有样品均应该在Mh内进行富集培养或4°C下密封保存。研究发现，海洋油污发生地及周边以前发生过海洋油污事故的地区降解油污菌种资源丰富，这些菌种承担着消除海洋油污的重任。本发明的菌源筛选样品来自舟山码头清洗船舶后产生的油污废水和污泥，这些废弃物含盐度大，上层漂浮一层浮油。(2)菌群富集
取水样IOml和污泥样品0. 5g放于500ml —代富集培养基中，在25°C，140rpm下进行摇床富集培养约一天时间，即可获得一代富集菌群培养液；
经过第一步的富集培养后，按照一代富集菌群培养液二代富集培养基=1:10的比例， 将一代富集液添加到二代富集培养基中，在25°C，140rpm下继续富集培养约一天，至油水混合现象出现，即可获得二代富集菌群培养液；
然后取二代富集菌群培养液按照上述1 10的比例添加到三代富集培养基中，在25°C， 140rpm下继续富集培养，至油水混合现象出现，至此富集完毕，得到三代富集菌群培养液。所述一代富集培养组成如下
Yeast extract1 g/L
Peptone5 g/L
尿素1.6 g/L
8 g/L 5 g/L 1 L
7. 0 士 0. 5，
K2HPO4
油污(原油柴油=1:5) 海水 PH
温度25°C。所述二代富集培养基组成如下 Yeast extract1 g/L Peptone 5 g/L 尿素 1.6 g/L K2HPO4 8 g/L 油污(原油柴油=1:5) 10 g/L 海水 1 L
pH7.0 士 0· 5
温度25 °C。所述三代富集培养基组成如下
Yeast extract1g/LPeptone5g/L尿素1.6 g/K2HPO4 g/L油污(原油柴油=1:5)20g/L海水1L
pH7.0 士 0.5
温度25 °C。
(3)菌群驯化
参见图2，使用时，在缸体11由隔板3隔成的左侧空间底部铺满普通沙土，高度为缸体
7U高度的一半，然后在其上部填充含油量约为1%质量比的含油沙土，使得夹角α为30°， 用来模拟含油海滩。由进水管口 1进海水至最高水位二4小时不间断开动造浪器6，以模拟海浪，通过控温装置7调温度至25°C，同时实时监测右温度计4和左温度计5的温度变化。 每12小时开动照明装置8，模拟光照。同时通过控制出水阀门9，使水位在12小时左右降至最低水位，模拟海水涨潮退潮，每12个小时进一次海水。 将步骤(2)得到的三代富集培养菌群培养液按照体积比1:100的比例加到盛有含油量质量体积比1%的油污废水的模拟装置右侧的油污废水中，同时按照浓度比生化需氧量(COD):尿素磷酸二氢钾=100 5 1将尿素和磷酸二氢钾营养物质混合，控制温度25°C， 进行驯化处理。连续换水三次，缸体11右侧底部即为驯化好的微生物菌群。筛选好的菌群直接撒至海洋油污事故地区(溢油现场)水面上的油污生物降解，进行生物修复。表1为现场菌种培养后降解率比较。图3是通过本方法筛选出的菌群一、菌群二与单菌3XG-1，L2，1 中XS, 2XS-2, 3XS-1, 2中XD-16株单菌降解率的比较。
表权利要求
1. 一种海洋油污微生物菌群的筛选和驯化方法，通过以下步骤实现 (I )装置设计装置由缸体(11)、隔板(3)、右温度计(4)、左温度计(5)、造浪器(6)、控温装置(7)和照明装置(8)组成，缸体(11)底部两边设有右出水管口(1)和左出水管口(9)， 并相应设有右水阀(2 )和左水阀(10 )，在缸体中间设有一可卸载的隔板(3 )，将缸体(11)分隔成左右2个空间，在缸体两侧分别安装左温度计(5)和右温度计(4)，缸体(11)右侧安装有可卸载的人工造浪器(6)和控温装置(7)，造浪器(6)和控温装置(7)通过吸盘吸住缸体内壁，照明装置(8)安装在缸体上部，人工造浪器(6)、控温装置(7)和照明装置(8)分别通过插头连接外接电源；(II)菌源样品采集从静水层中收集水样，从油污泥表层中采集0.5-1. Okg污泥样，分别置于无菌器皿中，在M小时内进行步骤(3)富集培养或4°C下密封保存；(III)菌群富集取水样IOml和污泥样品0. 5g放于500ml —代富集培养基中，在25°C，140rpm下进行摇床富集培养一天时间，即获得一代富集菌群培养液；经过第一步的富集培养后，按照一代富集菌群培养液二代富集培养基=1:10的比例， 将一代富集菌群培养液添加到二代富集培养基中，在25°C，140rpm下继续富集培养一天， 至油水混合现象出现，即获得二代富集菌群培养液；然后取二代富集菌群培养液，按照二代富集菌群培养液三代富集培养基=1:10的比例添加到三代富集培养基中，在25°C，140rpm下继续富集培养，至油水混合现象出现，至此富集完毕，得到三代富集菌群培养液；其中一代富集培养基组成酵母提取物1 g/L蛋白胨5 g/L尿素1.6 g/LK2HPO48 g/L油污5 g/L海水1 LpH7.0 士 0.5温度25 °C ；ニ代富集培养基组成酵母提取物1 g/L蛋白胨5 g/L尿素1.6 g/LK2HPO48 g/L油污10 g/L海水1 LpH7.0 士 0.5温度25 °C ；三代富集培养基组成酵母提取物1 g/L蛋白胨5 g/L尿素1.6 g/LK2HPO48 g/L油污20 g/L海水1 LpH7.0 士 0.5温度25 °C ； (IV)菌群驯化将步骤(3)得到的三代富集培养菌群培养液按照体积比为1:100的比例加到盛有含油量质量体积比1%的油污废水的模拟装置右侧的油污废水中，同时按照浓度比生化需氧量 尿素磷酸二氢钾=100:5:1将尿素和磷酸二氢钾混合，温度25°C，进行驯化处理，连续换水三次后，缸体(11)底部即为驯化好的微生物菌群。
2.根据权利要求1所述的一种海洋油污微生物菌群的筛选和驯化方法，其特征在于， 步骤(I )所述缸体(11)材料选用透明的普通玻璃或有机材料。
3.根据权利要求1所述的一种海洋油污微生物菌群的筛选和驯化方法在海滩溢油生物修复和驯化石油降解菌群中的应用。
全文摘要
本发明提供一种海洋油污微生物菌群的筛选和驯化方法，通过海洋油污发生地区获得菌源样品，而后经过一代，二代，三代富集培养，获得培养液，通过筛选富集，并经过一代，二代，三代富集培养获得富集培养液，再利用设计的装置，添加营养物质进行驯化处理后获得得到驯化微生物菌群，筛选好的菌群可用于海洋油污事故地区的油污生物降解。可在海滩溢油生物修复和驯化石油降解菌群中的应用。本发明方法具有快速，经济，高效，环保的特点，可以更快的应用于海洋油污事故，是海洋油污微生物筛选驯化方法的理想选择。
文档编号C12N1/00GK102433260SQ20111032451
公开日2012年5月2日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者张文武, 杨志坚, 肖金星, 郑刚 申请人:浙江大学舟山海洋研究中心