专利名称：基于coi特异引物的螺旋粉虱分子鉴定技术的制作方法
技术领域：
本发明属于应用生物技术领域，具体地说涉及应用于螺旋粉虱分子鉴定的专用引物及鉴定螺旋粉虱的方法。
背景技术：
粉虱是农林重要害虫之一，属于同翅目，粉虱科Homoptera =Aleyrodidae,是一类体型微小的植食性刺吸类害虫，粉虱体型最大不超过3mm。成虫两性均有翅，翅面覆白色蜡粉。粉虱分布于世界各大动物区，主要是热带和亚热带，粉虱的寄主植物很广泛，寄主植物多为木本植物，也包括许多农作物，成幼虫主要寄生于植物叶背面。粉虱的为害包括直接和间接两个方面。直接为害即是从寄主植物叶内大量吸取汁液造成寄主营养缺乏，影响寄主的正常生理活动；粉虱的间接为害方式一方面是其排出的大量蜜露招致灰尘污染叶面和霉菌寄生，影响寄主的光合作用和外观品质，在蔬菜花卉生产上更是严重的问题；另一方面是粉虱作为植物病毒的传播媒介引起病毒病的大发生，如烟粉虱可传播棉花烟草胡椒等的卷叶病毒在温室大棚中粉虱传播的病毒病似乎是比粉虱本身为害更严重的问题螺旋粉虱属粉虱科Family Aleyrodidae,复孔粉虱属Aleurodicus，英文名为 Spirallingwhitefly，是一种危险性入侵害虫，正向世界各热带地区扩散。原产于中美洲和加勒比地区。1905年在西印度群岛的马提尼克岛的番石榴上首次被记录，此后分别向东、西蔓延，随后几年在古巴、巴西、厄瓜多尔、秘鲁，非洲西北角的加纳利群岛等地陆续被发现， 再分别逐渐蔓延至太平洋地区及非洲西岸地区。1978年在夏威夷瓦胡岛(Oahu)首次在榄仁树上发现螺旋粉虱，1981年在夏威夷的所有主要岛屿上都有此虫，其寄主多达64种植物，包括椰子树、石榴和柑桔等。同年在萨摩亚和关岛发现此虫。1983年菲律宾发现此虫。 1985年在马来西亚的沙捞越该虫大爆发，主要危害水果和蔬菜。1987年巴布亚新几内亚报道此虫危害番石榴和芒果。1988年台湾省高雄县大寮乡番石榴植株上发现螺旋粉虱，该虫入侵台湾后快速扩散，每到一处便造成该地植物受损，蔬菜、果树、行道树及景观树种都被危害。1989年该虫在印度尼西亚发现，可危害大豆等14科22种植物。1992年在非洲大陆首先于尼日利亚发现此虫，然后到达多哥，在西班牙柠檬上也大爆发，在西班牙该虫不是柑桔的主要害虫，但可以危害棕榈和香蕉。1993年传到贝宁、加纳和刚果。印度于1993 1994年的旱季螺旋粉虱大规模发生，危害木薯。2006年4月，在中国海南省陵水县椰林镇首次发现了螺旋粉虱寄生于番石榴(Psidium guajavaL.)和印度紫檀(Pterocarpus indicus Willd.)。随后进行广泛调查，发现这种粉虱几乎已遍布海南各市县。目前在中国大陆地区和香港尚未发现有此虫出现的报道。鉴于螺旋粉虱的寄主植物广泛，已经报道的寄主植物多达109科743种，包括蔬菜、果树、观赏植物和行道树等，为害广，繁殖快，给人们造成严重损失，防治也比较困难。目前在中国的为害还仅限于台湾和海南，严格植物检疫，防止此虫的进一步扩散是防治该虫的一项重要措施。但由于粉虱科昆虫是一类体型微小的植食性昆虫。与其它昆虫类群相比， 目前的粉虱分类比较困难，粉虱的分类系统和种类鉴定，是依据于第四龄幼虫；粉虱的一些种类，形态变异很大，其形态随寄主不同而改变，不易区分。一些近缘种从外部形态上极难区分，必须依靠非形态特征进行鉴别。粉虱是世界性的害虫，其直接造成的为害和所传播病毒病造成的损失是非常严重的，准确识别和鉴定粉虱种类是采取治理对策的基础。由于粉虱体型微小，识别比较困难，螺旋粉虱在热带及亚热带地区传播甚快，造成严重危害，在我国螺旋粉虱被列为检疫性有害生物。张桂芬等报道了基于RAPD技术研制的螺旋粉虱的特异性SCAR引物及其检测方法 (CN101693924A)，但其针对的是单头昆虫，其试用的粉虱类的种类较少，且其灵敏度也没有报道，因此研究建立一种高效、快速、准确、灵敏且专一性强的螺旋粉虱的鉴别方法仍然十分必要迫在眉睫。
发明内容
本发明克服以往粉虱科昆虫鉴定方法存在的缺陷，提高螺旋粉虱鉴定结果的准确度，是一种易于操作、灵敏度高的螺旋粉虱的检测和诊断方法。该方法可以直接应用于生产实践，对于螺旋粉虱的鉴定和控制具有十分重要的意义。本发明的技术方案如下首先从采集的各种粉虱科昆虫提取总DNA，利用一对引物进行PCR扩增一段COI基因片段，通过克隆转化后对该DNA片段进行序列分析，建立各种类粉虱科昆虫的序列数据库，在比较数据库DNA的基础上，设计一种螺旋粉虱的特异引物， 通过分析在特定条件下的聚合酶链式反应的产物结果，从而达到快速，准确鉴定螺旋粉虱的目的。对需要鉴定的粉虱科昆虫样品，提取其总DNA，在给定的条件下，用设计的特异引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳比较PCR扩增产物结果，可以鉴定出螺旋粉虱。螺旋粉虱可以在443bp处产生一条清晰地条带，而非螺旋粉虱昆虫不能产生条带，或者不能产生清晰地条带。本发明设计的用于鉴别螺旋粉虱的分子鉴定方法，采用如下步骤1.粉虱科昆虫的总DNA提前，按常规昆虫DNA提取方法进行，用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到0. 1 μ g/ml-0. 4 μ g/ml.2.扩增DNA片段，进行聚合酶链式反应，即用特异的引物进行扩增，特异的引物对序列为Pl:5，-AAGATATATTTTCCAATTTTATCCC-3，P2 5，-TCGTATAGAATTAAGAATGTTAGGT-3，3.进行琼脂糖凝胶电泳分析，使用DNA marker检测PCR片段大小4.鉴定结果的判断若出现明显清晰的443bp大小的条带，则可判断为是螺旋粉虱，反之若无此条带或条带不清楚，则非螺旋粉虱类昆虫本发明的效果是可解决判断螺旋粉虱和其它粉虱科昆虫判断的难题，即使是在多头粉虱科昆虫里面混有一头昆虫，通过总DNA的提取，用本方法仍然可以检测出来，提高一对螺旋粉虱鉴定所需的特异引物，PCR反应条件，以及一段螺旋粉虱的特征DNA碱基序列。通过对螺旋粉虱DNA浓度的测定，研究发现在DNA稀释到Ing/μ 1的浓度条件下，仍然能够检测出来，灵敏度高。粉虱科昆虫由于体型较小，在多种粉虱科昆虫混在一起的条件下，通过形态很难判断是哪类昆虫，尤其对于非昆虫专业人士更加难以区别，急需找到一种可靠的鉴别方法。本发明利用螺旋粉虱和其它粉虱科昆虫DNA碱基序列的差异，建立一种快速、简便得分子鉴别方法，对于螺旋粉虱的防治以及检疫具有重大价值。
图1是用特异性引物扩增粉虱科昆虫电泳检测图谱，其中泳道M为DNA Marker, 泳道Fl为螺旋粉虱，泳道F2 F15按顺序依次为黑剌粉虱Aleurocmthus sp,柑桔剌 粉風 Aleurocanthus citriperdus，双钩果粉風 Paraleyrodes pseudonaranjae Martin， ——点红イ白粉成 Bemisia emiliae，粉威 Trialeurodes vaporariorum, Pentaleyrodes cinnamomi (Takahasni)，俾盘粉虫し Palaealeurodicus machili (Takahashiノ，粉背氺Il 粉 虫 1 Aleurocanthus inceratus Silvestri,九里香裸粉 i Dialeurodes sp,番為权槽 粉風 Aleurotracnelus anonae Corbett,柑柏‘粉風 Dialeurodes citri (Ashmead)，克 氏丰朱粉^I Dialeurodes Kirkaldyi (Kotinsky)，Tuberaleyrodes sp.，烟粉風 Bemisia tabaci(bennadiuso图2为螺旋粉虱特异性扩增灵敏度测定电泳检测图谱，其中泳道M为DNA marker ； 泳道400、200、100、50、25、12. 5、5、2和1分别表示扩增螺旋粉虱DNA使用浓度为400ng/ U l,200ng/u 1，100ng/u l、50ng/ii l、25ng/ii 1U2. 5ng/u l、5ng/ii l、2ng/ii 1 禾ロ □ lng/ U I。
具体实施例方式1.粉虱科昆虫的总DNA提前，按常规方法进行，用灭菌的去离子水将样品的DNA浓 度稀释到 0. lug/ml-O. 4ug/ml.2 聚合酶链式反应(一)聚合酶链式反应以20ul为參考，各物品的用量分别为
IOXPCR反应缓冲液2 Ul
MgCl2 (25mM)2 u 1
dNTP (各 IOmM)1. 6 y 1
引物 Pl 和 P2 (IOuM)各 0.8 u 1
供试用DNA模板0.4 Ul
Taq DNA 聚合酶0. 2 y 1
灭菌去离子水补齐至总量为20 u 1(ニ)PCR反应条件反应在PCR仪上进行，反应条件如下94°C预变性5min，然后按以下条件进行观个循环。94°C预变性 50秒60°C退火 30 秒72°C 延伸 50 秒循环结束后，在72°C保持7分钟补齐，反应结束后在4°C保存。(三)PCR反应的电泳监测取上述反应液4ill与1 ill载样缓冲液混合，用2 %的琼脂糖进行电泳，EB染色，用凝胶成像系统进行自卫检测。 4.鉴定结果的判断若出现明显清晰的443bp大小的条带，则可判断为是螺旋粉虱，反之若无此条带或条带不清楚，则非螺旋粉虱类昆虫。
权利要求
1.一对螺旋粉虱快速分子检测的特异性引物，其特征在于引物DNA的序列为Pl :5’ -AAGATATATTTTCCAATTTTATCCC-3’ ；P2 :5’ -TCGTATAGAATTAAGAATGTTAGGT-3’ 上述的引物对在螺旋粉虱总DNA中可以特异性扩增出443bp大小的产物。
2.螺旋粉虱鉴定方法，步骤包括权利要求1所述螺旋粉虱快速分子检测特异性引物用法包括(1)粉虱科昆虫的总DNA提前，按常规方法进行，用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到 0. 1 μ g/ml 0. 4 μ g/ml。(2)聚合酶链式反应扩增用引物Pl和P2，进行聚合酶链式反应，得到聚合酶链式反应产物(3)PCR反应产物的电泳分析。(4)鉴定结果的判断根据电泳显示的PCR扩增条带的有无来判断，若有明显清晰的 443bp大小的条带，则可判断为是螺旋粉虱，反之若无此条带或条带不清楚，或片段大小非 443bp大小，则非螺旋粉虱类昆虫。
全文摘要
本发明属于应用生物技术领域，本发明提供一种当前危害和扩散很快的入侵昆虫螺旋粉虱的快速鉴定的专用引物及其螺旋粉虱分子鉴定的使用方法。本发明提供的螺旋粉虱特异性引物对，其上游序列为P15’-AAGATATATTTTCCAATTTTATCCC-3’；下游引物为P25’-TCGTATAGAATTAAGAATGTTAGGT-3’，可以用来对螺旋粉虱与其它粉虱科昆虫的鉴别，本发明的技术方案不仅能提高螺旋粉虱鉴别的效率和准确性，同时操作简便快捷，具有广泛的适用性，不仅可以用于单头昆虫的鉴定，同时可用于多种昆虫混杂在一起检测。检测灵敏度高，检测限可达DNA浓度1ng/μl，通过本发明方法能够快速准确判断粉虱科昆虫中是否混有螺旋粉虱的存在，具有重要的理论意义和实用价值。
文档编号C12N15/11GK102433381SQ20111037916
公开日2012年5月2日 申请日期2011年11月25日 优先权日2011年11月25日
发明者代鹏, 张敬宝, 张方平, 朱文静, 牛黎明, 符悦冠, 胡好远, 韩冬银, 马光昌, 黄武仁 申请人:中国热带农业科学院环境与植物保护研究所