细菌β-内酰胺酶在体外诊断及体内成像、诊断和治疗中的用途的制作方法

专利名称：细菌β-内酰胺酶在体外诊断及体内成像、诊断和治疗中的用途的制作方法
细菌β-内酰胺酶在体外诊断及体内成像、诊断和治疗中的用途
相关申请的交叉参考
本国际申请依据法条35U. S. C. § 120要求享有于2010年6月4日提交的美国序号为 12/802，340 的未决的部分接续申请(continuation-1n-part patent application) 的优先权，其依据法条35U. S.C. § 120要求享有于2009年8月6日提交的美国序号为 12/462,644的未决的非临时申请的优先权，其依据法条35U.S.C. § 119(e)要求享有于 2008年12月24日提交的美国序号为61/203，605的临时申请(目前已放弃)以及于2008年 8月6日提交的美国序号为61/188，112的临时申请(目前已放弃)的优先权，将上述申请的全部内容整体并入文中以供参考。技术领域
本发明通常涉及药物、病原微生物学和成像技术领域。更具体而言，本发明涉及在受试者的体外或体内成像过程中用于检测和定位细菌病原体的化合物和报告子。
背景技术：
在世界范围内，许多细菌感染造成显著的发病率和死亡率，并且许多最重要的细菌物种是β_内酰胺酶阳性的，这使其耐受标准的青霉素样抗生素。许多这种感染和青霉素耐受的出现的诊断通常是困难的，并且在灵敏地测定之前需要大量诊断实验室培养。
例如，目前将近三分之一的世界人口感染了结核病并且其仍然对公共卫生构成严峻的威胁。当意识到在世界范围内持续存在有多药耐药和广泛耐药菌株(其不能够被轻易治疗)时，人们对其的关注度也大大提高。用于量化和评价在实验室中、组织培养细胞中以及动物模型和人类感染过程中的结核病活力的现有方法限于菌落形成单位(CFU)的测定和 /或组织和痰液的显微成像法。这些方法费时，往往难以解释，并且相对不敏感。大多数方法需要侵入性过程，在动物和人的情况下，所述侵入性过程必须在死后进行。无论是在动物模型中还是在患者体内，这些不足均使得所述方法难以跟踪疾病的进展，疫苗的有效性和治疗的结果。光学成像方法将允许直接观察结核病在感染过程中的活力、疗法的有效性以及使用活体动物以非侵入性方式在疾病过程中实时定位细菌。
因此，本领域中公认的需要是用于成像和诊断细菌性疾病的改进方法。更具体而言，现有技术在针对β_内酰胺酶阳性细菌的灵敏度和特异性实时光学成像方法方面存在缺陷，所述β_内酰胺酶阳性细菌能够在体外和活体受试者体内使用来诊断和定位细菌感染、迅速筛选新的疗法以及鉴定新的药物靶标。本发明满足了本领域中这一长期的需要和愿望。发明内容
本发明涉及一种用于实时检测受试者中病原性细菌的方法。该方法包含向受试者或来源于其的生物样品中引入针对病原性细菌β_内酰胺酶的荧光、冷光或比色底 物，并且使受试者或样品的β_内酰胺酶对于底物的活性所得到的产物成像。获取由β_内酰胺酶产物发射的波长信号，从而检测受试者中的病原性细菌。本发明涉及一种相关的方法，其进一步包含建立发射信号的3D重建，以测定受试者中病原性细菌的位置。本发明涉及另一种相关的方法，其进一步包含在发射信号比测量的对照信号的强度大的基础上， 实时诊断与病原性细菌相关的病理生理状况。例如，所述荧光、冷光或比色底物是CNIR2、 CNIR3、CNIR4、CNIR5、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR9、CNIR10、CNIR7-TAT、笼式荧光素(caged luciferin)、比色试剂或其衍生物或类似物。
本发明涉及一种用于实时检测病原性细菌的相关的方法。该方法包含向受试者中引入针对病原性细菌的内酰胺酶的底物或者使所述针对病原性细菌的内酰胺酶的底物接触来自于受试者的或由受试者表面获得的生物样品，并且使受试者或样品的β_内酰胺酶对于底物的活性所得到的产物成像。获取由β_内酰胺酶产物发射的波长信号，从而检测受试者中的病原性细菌。本发明涉及一种相关的方法，其进一步包含在生物样品中量化和区分已感染细胞与未感染细胞的步骤中的一种或两种。本发明涉及另一种相关的方法，其进一步包含建立发射信号的3D重建，以测定受试者中病原性细菌的位置。例如， 所述底物可以是荧光基因(fluorogenic)底物 CDC-1、CDC-2、CDC-3、CDC-4、CDC-5、CNIR5、 CNIR5. 2、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR7-TAT、CNIR9、CNIR10、CNIR800、CNIR800. 2、CNIR800_3、 XHX2-81、XHX2-91、XHX3-1、XHX3-2、XHX3-26 或 XHX3-32，或其衍生物或类似物，或者包含一种着色染料或化学试剂的底物，所述着色染料或化学试剂基于β_内酰胺酶对它们的活性有效地产生颜色或pH变化。
本发明还涉及一种用于诊断与受试者中的病原性细菌相关的病理生理状况的方法。该方法包含为受试者施用针对病原性细菌的β_内酰胺酶的荧光基因或冷光底物或使衍生自所述受试者的生物样品接触针对病原性细菌的β_内酰胺酶的荧光基因或冷光底物，并且使受试者的β_内酰胺酶对于底物的活性的产物成像。在产物的发射波长下实时测量荧光、冷光或比色信号强度，以使得大于测量的对照信号的荧光、冷光或比色信号强度与病理生理状况的诊断相关联。本发明涉及一种相关的方法，其进一步包含建立信号的 3D重建，以测定微生物病原体的位置。本发明涉及另一种相关的方法，其进一步包含施用有效治疗病理生理状况的一种或多种治疗性化合物。本发明涉及另一种相关的方法，其包含向受试者再次施用荧光基因化合物并使受试者再次成像或使衍生自受试者的生物样品与所述荧光基因底物接触；并且使受试者或所述生物样品成像以监控治疗性化合物的有效性，以使得与诊断信号相比的发射信号的降低表明对病理生理状况的治疗效果。例如，所述荧光基因或冷光底物是 CNIR2、CNIR3、CNIR4，CNIR5、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR9、CNIR10、 CNIR7-TAT、笼式荧光素、比色试剂或其衍生物或类似物。
本发明涉及一种用于诊断与受试者中病原性细菌相关的病理生理状况的相关的方法。该方法包含为受试者施用针对病原性细菌的β-内酰 胺酶的底物或使其接触衍生自受试者的生物样品，并且使受试者的β-内酰胺酶对于底物的活性的产物成像。在产物的发射波长下实时测量信号强度(例如，荧光、冷光或比色信号)；其中大于测量的对照信号的信号强度与病理生理状况的诊断相关联。本发明涉及一种相关的方法，其进一步包含在生物样品中量化和区分感染细胞与未感染细胞的步骤中的一种或两种。本发明涉及另一种相关的方法，其进一步包含建立信号的3D重建，以测定微生物病原体的位置。特别地，所述底物可以是荧光基因底物 CDC-1、CDC-2、CDC-3、CDC-4、CDC-5、CNIR5、CNIR5. 2、CNIR5-QSY22、 CNIR7、CNIR7-TAT、CNIR9、CNIR10、CNIR800、CNIR800. 2、CNIR800-3、XHX2-81、XHX2-91、 XHX3-1、XHX3-2、XHX3-26或XHX3-32，或其衍生物或类似物，或者包含一种着色染料或化学试剂，所述着色染料或化学试剂基于β_内酰胺酶对它们的活性有效地产生颜色或PH变化。
本发明进一步涉及一种用于检测受试者中分支杆菌感染的诊断方法。所述方法包含从受试者处获得生物样品，并且使所述生物样品与分支杆菌β-内酰胺酶接触。使所述生物样品成像来检测β-内酰胺酶对于底物的活性的产物，以及在产物的发射波长下测量信号强度，其中大于测量的对照信号的信号强度显示分支杆菌感染的存在。本发明涉及一种相关的方法，其进一步包含在生物样品中量化和区分已感染细胞与未感染细胞的步骤中的一种或两种。本发明涉及另一种相关的方法，其进一步包含重复这些方法步骤一次或多次，以监控基于分支杆菌检测的施用于受试者的治疗方案的治疗有效性，其中与对照相比的测量信号的降低与治疗方案的阳性应答相关联。所述底物可以是荧光基因底物CDC-1、 CDC-2、CDC-3、CDC-4、CDC-5、CNIR5、CNIR5. 2、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR7-TAT、CNIR9、 CNIRlO、CNIR800、CNIR800. 2、CNIR800-3、ΧΗΧ2-81、ΧΗΧ2-91、ΧΗΧ3-1、ΧΗΧ3-2、ΧΗΧ3-26 或 ΧΗΧ3-32，或其衍生物或类似物，或者包含一种着色染料或化学试剂，所述着色染料或化学试剂基于β -内酰胺酶对它们的活性有效地产生颜色或PH变化。
此外，本发明进一步涉及一种用于筛选治疗性化合物的方法，所述治疗性化合物有效用于治疗与受试者中的病原性细菌有关的病理生理状况。该方法包含选择一个针对病原性细菌的潜在的治疗性化合物，使细菌细胞或包含所述细菌细胞的生物样品与荧光、 冷光或比色检测剂接触，以及使细菌细胞与潜在的治疗性化合物接触。在存在和不存在所述潜在的治疗性化合物的条件下测量由细菌细胞或包含所述细菌细胞的生物样品产生的荧光、冷光或比色信号，以便与不存在治疗性化合物的条件下的信号相比存在治疗性化合物的条件下的信号的降低表明所述化合物对抗病原性细菌的治疗效果。例如，所述荧光、 冷光或比色检测剂是 CNIR2、CNIR3、CNIR4、CNIR5、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR9、CNIR10、 CNIR7-TAT、笼式荧光素、比色试剂或其衍生物。
本发明涉及一种用于筛选治疗性化合物的方法，所述治疗性化合物有效用于治疗与受试者中的病原性细菌相关的病理生理状况。该方法包含紧接上文描述的，使用荧光基因底物作为检测剂的步骤，所述荧光基因底物是CDC-1、CDC-2、CDC-3、CDC-4、CDC-5、CNIR5、 CNIR5. 2、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR7-TAT、CNIR9、CNIR10、CNIR800、CNIR800. 2、CNIR800_ 3、 XHX2-81、XHX2-91、XHX3-1、XHX3-2、XHX3-26 或 XHX3-32，或其衍生物或类似物，或者包含一种着色染料或化学试剂，所述着色染料或化学试剂基于β_内酰胺酶对于它们的活性有效地产生颜色或pH变化。
此外，本发明进一步涉及一种用于使病原性细菌成像的方法。该方法包含使病原性细菌与针对病原性细菌的内酰胺酶的荧光基因底物接触，对于内酰胺酶对于底物的活性的产物，向病原性细菌递送一个激发波长，并获取发射自产物的荧光、冷光或比色信号。产生获取的信号的3D重建，从而使病原性细菌成像。
此外，本发明进一步涉及一种针对细菌β -内酰胺酶的底物，所述底物基于β -内酰胺酶对其的活性产生可检测的荧光、冷光或比色信号。代表性底物包括但不限于CDC-1、CDC-2、CDC-3、CDC-4、CDC-5、CNIR5、CNIR5. 2、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR7-TAT、CNIR9、 CNIRlO、CNIR800、CNIR800. 2、CNIR800-3、XHX2-81、XHX2-91、XHX3-1、XHX3-2、XHX3-26 或 XHX3-32，或其衍生物或类似物，或者包含一种着色染料或化学试剂，所述着色染料或化学试剂基于β_内酰胺酶对它们的活性有效地产生颜色或PH变化。本发明涉及另一种相关的底物，其进一步包含颗粒、微球或与其连接的生物素。
此外，本发明进一步涉及一种用于实时检测受试者中的病原性细菌的方法。该方法包含向受试者引入用与Y发射相关的同位素进行放射性标记的底物，其中所述底物针对β_内酰胺酶或者病原性细菌特定的其它酶或蛋白质。对于受试者的放射性标记底物的Y发射，在所述底物上的活性过程中成像，并获取由发射的Y射线产生的信号。产生基于Y射线产生的信号强度的，放射性标记在受试者中的浓度的3D重建，从而检测病原性细菌。本发明涉及一种相关的方法，其进一步包含基于病原性细菌的检测实时诊断与病原性细菌相关的病理生理状况。本发明涉及另一种相关的方法，其进一步包含施用一种或多种治疗性化合物，所述治疗性化合物有效用于治疗病理生理状况。此外，本发明涉及另一种相关的方法，其进一步包含向受试者再次施用放射性标记的底物以及使所述受试者再次成像以监控治疗性化合物的有效性；其中与诊断时的Y发射相比的Y发射的降低表明对病理生理状况的治疗效果。
此外，本发明进一步涉及如本文所述的针对适合于PET或SPECT成像的细菌 β-内酰胺酶的放射性标记底物。
此外，本发明进一步涉及一种用于可视化检测生物样品中病原性细菌的分析设备。所述分析设备包含平台，所述平台具有用于接收孵育混合物的装置，所述孵育混合物包含生物样品和针对与病原性细菌有关的β_内酰胺酶的生色底物，并且所述平台具有用于捕获和浓缩由β_内酰胺酶对于底物的活性产生的着色产物的装置，所述装置与所述接收装置液体相连。本发明涉及一项相关的发明，其进一步包含用于仅允许着色产物从所述接收装置向下游流动的装置。本发明涉及一项相关的发明，其进一步包含在所述接收装置下游的内部对照。本发明涉及另一项相关的发明，其中底物包含化学试剂并且设备进一步包含第二试剂，以便由所述化学试剂产生颜色。本发明涉及另一项相关的发明，其中底物与生物素连接并且设备进一步包含抗生物素蛋白，以便捕获与生物素连接的底物。
通过对下列本发明的优选实施方案的描述，其它的和进一步的目的、特征和优点将是显而易见的，所述本发明的优选实施方案的给出仅出于公开的目的。


为了达到和详细理解本发明的上述特征、优点和目的，以及将变得更加清楚的其它内容，通过引用在附图中阐明的本发明的具体实施方案可以获得上面简要概括的本发明更加具体的描述。这些附图形成本说明书的一部分。然而，值得注意的是，附图仅仅阐明本发明的优选实施方案，而不应被认为是限制了本发明的范围。
图1A-1C显示在用CNIR4浸泡之前的BlaC突变体结晶(图1Α)和保留CNIR4底物的BlaC突变体结晶(图1Β)。图1C阐明通过Mtb BlaC的头孢噻肟催化以及通过内酰胺环水解形成的产物。
图2A-2C描述在 通过β -内酰胺酶水解之前和之后的CCl和CC2 (图2Α)、CHPQ(图2B)以及CR2 (图2C)的结构。
图3描绘CNIRl、CNIR2、CNIR3和CNIR4的结构及其通过β -内酰胺酶的水解。
图4A-4D描绘用于制备近红外底物CNIR5的合成方案(图4Α)，用于大规模、商业化制备CNIR5的替代合成方案(图4Β)，在存在和不存在β -内酰胺酶的条件下荧光强度对 CNIR5波长的图(图4C)和CNIR5-QSY22的结构(图4D)。
图5A-5D 描绘 QSY21 (图 5A)、QSY21 二磺酸(图 5B)和 QSY22 二磺酸(图 5C)的结构以及QSY22 二磺酸的化学合成(图OT)。
图6A-6B描绘CNIR7的结构(图6A)及其化学合成(图6B)。
图7A-7B描绘用于CNIR9 (图7A)和CNIRlO (图7B)的合成方案。
图8A-8F描述荧光基因底物⑶C-1-5的合成方案和水解动力学。图8A显示 CDC-1-4的合成。图8B-8C显示在TEM-1Bla或Mtb BlaC分别处理之后探针CDC_1、2、3、4 于455nm处的发射对时间的图。(底物浓度5mM ；PBS (pH=7. 4)中的TEM-1Bla浓度为2nM ； PBS(pH=7. 4)中的Mtb BlaC浓度为IOnM ;于400nm处激发)。图8D显示CDC-5的合成。图 8E显示在β -内酰胺酶处理之后底物⑶C-1于455nm处的发射对时间的图(实线采用Mtb BlaC处理；虚线采用TEM-1Bla处理；探针浓度5mM ；PBS (pH=7. 4)中的TEM-1Bla浓度 20nM ;于400nm处激发)。图8F显示在β -内酰胺酶处理之后探针⑶C-5于455nm处的发射对时间的图(实线采用Mtb BlaC处理；虚线采用TEM-1Bla处理；探针浓度5mM ；PBS (ρΗ=7· 4)中的 Mtb BlaC 浓度20ηΜ ;于 400nm 处激发)。
图 9A-9F 描述 XHX2-81、XHX2-91、XHX3-1、XHX3-26 和 XHX3-32 的化学结构(图 9A-9E)，并表明细菌数量与使用XHX2-81、XHX2-91、XHX3-26和XHX3-32的荧光信号之间的相关性(图 9F)。激发360nm (IxPBS);最大发射453nm (lxPBS)；XHX-2-81 (DMS0 中 IOmM, 60mL) ；XHX-2-91 (DMS0 中 lOOmM，IOmL) ;XHX-3_26 (DMS0 中 20mM，42mL) ;XHX-3_32 (DMS0 中 lOOmM，IOOmDo
图10A-10B描述Bluco的化学合成(图10A)和Bluco用于β -内酰胺酶的连续报告生物发光测定法(SREL)成像的用途(图10Β)。
图1IA-1ID描述用于制备CNIR和CNIR样探针及其衍生物和类似物的替代化学合成路线(图11Α-11Β)和如此合成的探针结构，如CNIR5. 2和CNIR800. 2(图11C)和CNIR800-3 (图 11D)。
图12Α-12Β阐明含有CNIR5的大肠杆菌中(图12Α)和结核分支杆菌中(图12B)Bla 活性的检测。对照含有LB介质和CNIR5，而不含转化的大肠杆菌。
图13A-13H描绘荧光发射光谱(图13A-13D)和荧光标记掺入的动力学(图 13E-13H)。显示了用TEM-1Bla裂解之前(CNIR)和裂解10分钟之后(CNIR+Bla)的CNIR4 (图 13A)、CNIR5 (图 13B)、CNIR9 (图 13C)和 CNIR10 (图 13D)的发射光谱。显示了将 CNIR4 (图13E)、CNIR5 (图13F)、CNIR9 (图13G)和CNIR10 (图13H)荧光标记直接掺入到野生型 Mtb和Mtb BlaC突变体(blaCm)中的动力学。
图14A-14B描绘含有CNIR4(图14A)和CNIR5(图14B)底物的大肠杆菌TEM-1 β -内酰胺酶和结核分支杆菌Bla-C β -内酰胺酶的动力学。
图15Α-15Η 描绘在含有 C NIR4 (图 15Α, 15E)、CNIR5 (图 15B, 15F)、CNIR9 (图 15C, 15G)和CNIRlO (图15D，15H)的介质中单独的结核分支杆菌细菌的荧光掺入动力学和其中的分布比例(图15A-15H)。
图16A-16H 描绘在含有 CNIR4 (图 16A, 16E)、CNIR5 (图 16B, 16F)、CNIR9 (图 16C, 16G)和CNIRlO (图16D，16H)的结核分支杆菌细菌感染的巨噬细胞的荧光掺入动力学(图 16A-16D)和其中的分布比例(图16E-16H)。
图17描绘荧光共焦显微镜图像，其显示CNIR4向结核分支杆菌感染的巨噬细胞中的细胞内掺入。DAPI着色(蓝色)指示出受感染细胞的细胞核，绿色荧光来自于GFP标记的结核分支杆菌并且红色荧光来自于裂解的CNIR4。
图18A-18E描绘通过以IO8 (每只小鼠的左后部)、IO7 (左前部)、106 (右前部)的各种浓度的 CNIR4 (图 18A)、CNIR5 (图 18B)、CNIR9 (图 18C)和 CNIRlO (图 18D)的皮内接种的来自于结核分枝杆菌感染的小鼠的荧光。图18E相当于每一个化合物于每一个用于感染的细菌的浓度的信号对背景图。
图19A-19E是来自于已经通过气溶胶接种在肺部感染结核分支杆菌的小鼠的荧光图像和针对 CNIR4 (图 19A)、CNIR5 (图 19B)、CNIR9 (图 19C)和 CNIRlO (图 19D)测量的荧光信号。在图19A-19D的每一张图中，每块平板中左边的小鼠是未感染的，左数第二只小鼠采用blaC基因发生突变的结核分支杆菌感染，并且每块平板中右边的两只小鼠采用野生型结核分支杆菌感染。每块平板中右边的三只小鼠在成像之前24小时静脉给予CNIR4、 CNIR5、CNIR9或CNIR10。图19E是背部图像中肺部区域内每个化合物的信号对背景的图。
图20A-20F是来自于通过气溶胶感染结核分支杆菌的小鼠并且使用底物CNIR5于 I小时(图20A)、18小时(图20B)、24小时(图20C)和48小时(图20D)成像的荧光图像。在每个面板的背视图、腹视图、左视图、右视图中，左侧小鼠是未感染的并且右侧小鼠是感染的。所有小鼠在于标记的时间点成像之前均采用CNIR5静脉注射。图20F是量化由图19A 的顶部平板中圈定的感兴趣的区域获得的荧光信号的图。
图21A-21B描绘来自于通过气溶胶感染结核分支杆菌的(图21A)和未感染的(图 21B)小鼠的并且使用透照(而不是反射)以减少背景信号而成像的荧光图像。
图22A-22D阐明在左肩具有异种移植的野生型C6肿瘤并且右肩具有cmv-bla稳定化转染的C6肿瘤的裸鼠上采用CNIR5(7nmol)的Bla表达的图像。图22A显示在指定时间点的重叠荧光和亮场图像。图22B显示每个肿瘤的平均强度对时间的绘制图。图22C显示切除的肿瘤和器官的图像。图22D显示来自两种肿瘤的提取物中Bla的CCl分析结果。
图23A-23C阐明在左肩具有异种移植的野生型C6肿瘤并且右肩具有cmv-bla稳定化转染的C6肿瘤的裸鼠上采用CNIR6 (7nmol)的Bla表达的图像。图23A是CNIR6的化学结构。图23B显示在指定时间点的重叠荧光和亮场图像。图23C显示每个肿瘤的平均强度对时间的绘制图。
图24A-24B阐明4小时(图24A)和24小时(图24B)后，7. 5纳摩尔CNIR5在各种组织中的生物分布。
图25A-25B是使用静脉内的CNIR5作为成像剂的，感染结核分支杆菌的小鼠(图 25A)和未感染的对照小鼠(图25B)的体内图像。
图26A-26C阐明使用CNIR探针的SREL检测阈值。图26A是一张柱状图，其显示使用内酰胺酶CNIR探针用SREL成像能够检测出100个以下的细菌。图26B-26C是未感染的(图26Β)或感染结核分支杆菌的(图26C)活小鼠的体内图像。
图27A-27E描绘CNIR5检测临床样品中的结核杆菌的评价能力结果(图27A)，测定痰样本中结核杆菌检测阈值的结果(图27B)，加标痰样本中信号强度和细菌数量之间的相关性(图27C)，加标痰样本和PBS中信号强度和细菌数量的比较(图27D)，以及异烟肼+利福平治疗分支杆菌的评价，包括获得可测量信号的时间(图27E)。
图28描绘IRDye800系列荧光团的结构。
图29描绘头孢哌酮和所提议的CNIR探针的结构。
图30是建立Bluco底物的小型偏倚库(biased library)的方案。
图31展示在3’位含有烯丙基连接的新型探针的结构。
图32描绘在3’位含有氨基甲酸酯连接的新型探针的结构。
图33A-33D描绘利用被连接至胶乳颗粒或微球的轭合底物/着色染料(图33A)或者产生轭合物/底物/颜色的化学试剂(图33B)以及被连接至生物素的轭合物/底物/着色染料(图33C)或者产生轭合物/底物/颜色的化学试剂(图33B)的用于诊断分析的可视化检测系统。
具体实施方式
如本说明书中所使用，“一”可以指一或多。如本权利要求书中所使用，当与词语 “包含”配合使用时，词语“一”可以指一或一以上。如本文所使用，“另一”或“其它”可以指至少第二或更多的相同或不同的要求保护的元素或组分。此外，除了另有规定以外，单数的术语包括复数的情况，复数的术语包括单数的情况。
如本文所使用，除非明确说明指的是唯一的备选物或者备选物是互相排斥的，否则尽管本公开支持的定义指的是唯一的备选物和“和/或”，权利要求书中的术语“或”均用于指“和/或”。
如本文所使用，术语“接触”指的是任何适合的方法，所述方法在体内或体外， 在生物样品中，使荧光基因底物，例如，荧光基因化合物、荧光蛋白质、冷光蛋白、或者比色蛋白质或其它比色试剂或其衍生物，或者适合于PET或SPECT成像的放射性标记的底物接触病原性细菌，所述病原性细菌例如但不限于结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mbt)、牛分支杆菌(Mycobacterium bovis, M. bovis)> 鸟分支杆菌 (Mycobacterium avium, M. avium)、结核分支杆菌复合物或鸟分支杆菌复合物,或者接触拟杆菌属(Bacteroides)、梭菌属(Clostridium)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、军团菌属(Legionella)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属 (Shigella)或李斯特菌属(Listeria)中的一个物种,或者接触β-内酰胺酶或特定针对病原性细菌的其它酶或蛋白质。在体外或离体中，这通过使一种或多种细菌细胞或者β_内酰胺酶或者其它的酶或蛋白质暴露于合适介质中的荧光基因底物或者荧光基因化合物或者荧光、冷光或比色蛋白质 或者其它比色试剂或其衍生物中。所述细菌细胞或者β_内酰胺酶或者其它的酶或蛋白质在获得自受试者的样品中。所述细菌细胞可以包含或者可以不包含有活力的样品。所述β_内酰胺酶或者其它的酶或蛋白质可以接触有活力的细菌细胞，可以通过已知的和标准的方法从细菌细胞中提取，其自身可以存在于生物样品中，或者可以包含通过已知的和标准的方法转染至细菌细胞中的重组系统。所述样品可以包括但不限于胸腔积液或痰液和可能具有细菌的，包括血液、唾液、尿液和粪便的其它体液。可选地， 对于体外接触而言，生物样品可以通过(例如)擦抹从表面获得，所述表面例如但不限于仪器、器皿、设施、工作表面、衣服或者人体上一个或多个感兴趣的区域。如此获得的样品可以被转移至适合的介质中，用于通过本领域中已知的或标准的方法来成像。对于体内应用而言，如本文中所述，任何已知的施用荧光基因底物，即，荧光基因化合物，荧光、冷光或比色蛋白质，其它的比色试剂或其衍生物，或放射性标记的底物的方法都是适合的。
如本文所使用，短语“荧光基因底物”指的是化合物或蛋白质或肽或其它生物学活性分子，其在适合的酶的存在下得到通过适宜波长的激发而发射或产生荧光或冷光信号的产物，或者可以生成产生比色信号的产物。例如但不限于，在β_内酰胺酶，荧光素酶或 β -半乳糖苷酶或其它酶的存在下，荧光基因底物可以产生荧光、冷光或比色产物。
如本文所使用，短语“放射性标记的底物”指的是化合物或蛋白质或肽或其它生物学活性分子，其附着于或连接至或合并入寿命短暂的同位素，所述同位素发射用于正电子发射断层显像(Positron Emission Tomography, PET)的正电子和用于单光子发射计算机断层显像(Single Photon Emission Computed Tomography, SPECT)的 y 身寸线。
如本文所使用，短语“ β -内酰胺酶阳性细菌”指的是自然分泌β -内酰胺酶或者在发病过程中获取内酰胺酶的病原性细菌。
如本文所使用，术语“受试者”指的是接受治疗或者从其中获得生物样品的任何靶标。优选地，所述受试者是哺乳动物，更优选地，所述受试者是牲畜或人。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种用于实时检测受试者中的病原性细菌的方法，其包含为受试者或来自所述受试者的生物样品施用针对病原性细菌的β_内酰胺酶的荧光、冷光或比色底物；使所述受试者或样品的β_内酰胺酶对于底物的活性的产物在激发波长下成像；并且在由β_内酰胺酶产物发射的波长处获取信号；从而检测受试者中的病原性细菌。
关于该实施方案，所述方法包含建立发射信号的3D重建，以测定受试者中病原性细菌的位置。在另一个进一步的实施方案中，所述方法包含在发射信号比测量的对照信号的强度大的基础上，实时诊断与病原性细菌相关的病理生理状况。病理生理状况的实例是结核病。
在本发明的某些实施方案中，荧光底物可以是荧光基因底物。所述荧光基因底物的实例是 CNIR2、CNIR3、CNIR4、CNIR5、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR9、CNIR10、CNIR7-TAT、笼式荧光素、比色试剂或其衍生物。同样，在所有的实施方案中，所述成像或激发波长以及所述发射波长可以独立地为从大约300nm至大约900nm。在某些实施方案中，所述成像或激发波长是从大约540nm至大约730nm并且所述发射信号可以是大约650nm至大约800nm。在某些实施方案中，比色指示可以通过颜色变化或仪器测量由人眼可视化地鉴定，以测定一个指定的数值。此外，病原性细菌可以包含拟杆菌属、梭菌属、链球菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌属、军团菌属、分支杆菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属或李斯特菌属的细菌物种。特别地，所述病原性细菌可以包含结核分支杆菌复合物或鸟分支杆菌复合物。
在本发明的一个 相关的实施方案中，提供了一种用于使病原性细菌成像的方法， 其包含向受试者中引入针对病原性细菌的β_内酰胺酶的荧光基因底物，或者使来自于所述受试者的或由表面获得的生物样品接触针对病原性细菌的β_内酰胺酶的荧光基因底物；向病原性细菌递送一个激发波长用于β_内酰胺酶对于底物的活性的产物；获取发射自所述产物的荧光、冷光或比色信号；以及产生获取的信号的3D重建，从而使所述病原性细菌成像。在该实施方式的各方面中，所述病原性细菌可以与如上所述的荧光基因或冷光底物在体内或体外接触。同样，在该实施方案的所有方面中，所述病原性细菌和所述激发和发射波长如上所述。
在另一个相关的实施方案中，本发明提供了一种用于实时检测病原性细菌的方法，其包含向受试者或来自于所述受试者的生物样品中引入针对病原性细菌的β_内酰胺酶的底物；使所述受试者或样品的β_内酰胺酶对于底物的活性得到的产物成像；并且获取由β_内酰胺酶产物发射的波长信号，从而检测受试者中的病原性细菌。
关于该实施方案，所述方法包含建立发射信号的3D重建，以测定受试者中病原性细菌的位置。在另一个进一步的实施方案中，所述方法可以包含量化和区分生物样品中的已感染细胞与未感染细胞。特别地，在该进一步的实施方案中，通过利用流式细胞术、共聚焦显微镜法或荧光光谱法中的一种或多种来进行已感染细胞的区分和/或量化步骤。
在两个实施方案中，底物可以是荧光基因底物CDC-1、CDC-2、CDC-3、CDC-4、CDC_5、 CNIR5、CNIR5. 2、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR7-TAT、CNIR9、CNIR10、CNIR800、CNIR800. 2、 CNIR800-3、XHX2-81、XHX2-91、XHX3-1、XHX3-2、XHX3-26 或 XHX3-32，或其衍生物或类似物。 可选地，所述底物可以包含一种着色染料或化学试剂，所述着色染料或化学试剂有效地诱导颜色或PH变化。此外，所述底物可以被连接至颗粒、微球或被连接至生物素。同样，在两个实施方案中，所述生物样品可以是痰液、胸腔积液、尿液、血液、唾液、粪便或通过擦拭受试者身上感兴趣的区域而获得的样品。获取的信号可以是荧光、冷光或比色信号。所述病原性细菌、所述成像波长和所述发射波长如上所述。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种用于诊断与受试者中的病原性细菌相关的病理生理状况的方法，其包含向受试者施用针对病原性细菌的β_内酰胺酶的荧光基因或冷光底物；使所述受试者的β_内酰胺酶对于底物的活性的产物在激发波长下成像； 以及在产物的发射波长下实时测量荧光、冷光或比色信号强度；其中大于测量的对照信号的荧光、冷光或比色信号强度与病理生理状况的诊断相互关联。
关于该实施方案，所述方法包含建立信号的3D重建，以测定微生物病原体的位置。在另一个进一步的实施方案中，所述方法包含施用一种或多种治疗性化合物，所述治疗性化合物有效用于治疗病理生理状况。此外，所述方法包含向受试者再次施用荧光基因或冷光底物；并使受试者再次成像以监控治疗性化合物的有效性；其中与诊断信号相比的发射信号的降低表明对病理生理状况的治疗效果。在所有的实施方案中，所述病理生理状况、 病原性细菌、荧光基因底物以及成像或激发和发射波长如上所述。
在本发明的一个相关的实施方案中，提供了一种用于诊断与受试者中的病原性细菌相关的病理生理状况的方法，其包含向受试者施用针对病原性细菌的内酰胺酶的底物，或使衍生自所述受试者的生物样品接触针对病原性细菌的β_内酰胺酶的底物；使受试者的β_内酰胺酶对于底物的活性的产物成像；以及在产物的发射波长下实时测量信号强度；其中大于测量的对照信号的信号强度与病理生理状况的诊断相互关联。关于该实施方案，所述方法包含建立3D图像，施用适合于诊断的病理生理状况的治疗性化合物和再次施用如上所述的底物。在另一个进一步的实施方案中，所述方法包含如上所述的量化和/ 或区分生物样品中的已感染细胞和未感染细胞。
在这些实施方案中，所述底物可以是如上所述的荧光基因底物、着色染料或化学试剂。同样，所述病理生理状况可以是结核病并且所述生物样品可以是痰液、胸腔积液、尿液、血液、唾液、粪便或通过擦拭受试者身上感兴趣的区域而获得的样品。所述测量的信号可以是荧光、冷光或比色信号。所述病原性细菌、成像或激发波长和发射波长如上所述。
在本发明的另一个相关的实施方案中，提供了一种诊断与受试者中的病原性细菌相关的病理生理状况的方法，其包含使从受试者获得的样品接触针对病原性细菌的β_内酰胺酶的比色底物；其中内酰胺酶对于底物的活性的产物引起裸眼可见的颜色变化， 进而指示诊断。所述底物可以被放置在带(strip)、棉签(q-tip)、背景(background)或其它可视化指示器(indicator)上。颜色变化可以是裸眼可见的，并且无需任何仪器或来自于外部能量来源的激发即可得到鉴定。
在本发明的其它另一个实施方案中，提供了一种用于检测受试者中的分支杆菌感染的诊断方法，其包含从受试者获得生物样品；使生物样品接触分支杆菌β_内酰胺酶的荧光底物；使生物样品的内酰胺酶对于荧光基因底物的活性的产物成像；以及在产物的发射波长下测量信号强度；其中大于测量的对照信号的信号强度表明分支杆菌感染的存在。关于该实施方案，所述方法提供重复上述方法步骤一次或多次，以监控基于分支杆菌感染的检测的，施用于受试者的治疗方案的治疗有效性；其中与对照相比的测量的荧光信号的降低与治疗方案的阳性应答相互关联。在另一个进一步的实施方案中，如上所述，所述方法包含在生物样品中量化和区分感染细胞和未感染细胞的步骤中的一种或两种。
在两个实施方案中的各个方面中，所述底物可以是荧光基因底物CDC-1、CDC-2、 CDC-3、CDC-4、CDC-5、CNIR5，CNIR5. 2、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR7-TAT、CNIR9、CNIR10、 CNIR800, CNIR800. 2，CNIR800-3、ΧΗΧ2-81、ΧΗΧ2-91、ΧΗΧ3-1、ΧΗΧ3-2、ΧΗΧ3-26 或 ΧΗΧ3-32， 或其衍生物或类似物。可选地，所述底物可以包含一种着色染料或化学试剂，所述着色染料或化学试剂有效地诱导颜色或PH变化的。此外，所述底物可以被连接至颗粒、微球，或被连接至生物素。同样，所述生物样品可以是痰液、胸腔积液、尿液、血液、唾液、粪便或通过擦拭受试者身上感兴趣的区域而获得的样品。另外，所述分支杆菌感染可以由结核分支杆菌或结核分支杆菌复合物或鸟分支杆菌或鸟分支杆菌复合物造成。此外，所述测量信号可以是荧光、冷光或比色信号。所述成像和发射波长可以如上所述。
在本发明的其它另一个实施方案中，提供了一种用于筛选治疗性化合物的方法， 所述治疗性化合物有效用于治疗与受试者中的病原性细菌相关的病理生理状况。所述方法包含选择一个针对病原性细菌的潜在的治疗性化合物；使细菌细胞与荧光、冷光或比色检测剂接触；使细菌细胞与潜在的治疗性化合物接触；以及在存在或不存在所述潜在的治疗性化合物的条件下测量由细菌细胞产生的荧光、冷光或比色信号；其中与不存在治疗性化合物的信号相比的存在治疗性化合物的信号的降低表明所述化合物对抗病原性细菌的治疗效果。在该实施方案中，所述病理生理状况和所述病原性细菌如上所述。
在该实施方案的一 个方面中，病原性细菌可以是重组细菌，其中使细菌与荧光、冷光或比色检测剂接触的步骤包含用含有荧光、冷光或比色检 测剂的表达载体来转化野生型细菌。在这方面中，所述荧光、冷光或比色检测剂可以包含荧光蛋白。荧光蛋白的实例有mPlum、mKeima、Mcherry或tdTomato。同样在这方面中，所述表达载体可以包含β -半乳糖苷酶基因，其中所述方法进一步包含在β-半乳糖苷酶的存在下使重组细菌细胞与有效用于发射荧光信号的荧光团接触。荧光团的实例有C2FDG、C12RG或DDA0G。此外，在这方面中， 所述表达载体可以包含荧光素酶基因，其中所述方法进一步包含使重组细菌细胞与D-荧光素接触。突光素酶的实例是萤火虫突光素酶、叩头虫红(click beetle red)或rLuc8。
在该实施方案的另一个方面中，所述荧光检测剂可以是细菌内酰胺酶的荧光基因底物。在一个实施例中，病原性细菌可以与荧光基因底物CNIR2、CNIR3、CNIR4、CNIR5、 CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR9、CNIR10、CNIR7-TAT、笼式荧光素、比色试剂或其衍生物体内接触。在另一个实施例中，病原性细菌可以与荧光基因底物CC1、CC2、CHPQ, CR2、CNIRl或 CNIR6在体内接触。
在本发明的一个相关的实施方案中，提供了一种用于筛选治疗性化合物的方法， 所述治疗性化合物有效用于治疗与受试者中的病原性细菌相关的病理生理状况。所述方法包含选择一个针对病原性细菌的潜在的治疗性化合物；使细菌细胞或包含其的生物样品与细菌内酰胺酶的底物接触；使细菌细胞或包含其的生物样品与潜在的治疗性化合物接触；以及在存在或不存在潜在的治疗性化合物的条件下测量由细菌细胞产生的荧光、冷光或比色信号；其中与不存在治疗性化合物的信号相比的存在治疗性化合物的信号的降低表明所述化合物对抗病原性细菌的治疗效果。
在该实施方案的一个方面中，所述底物可以是荧光基因底物⑶C-1XDC-2XDC-3、 CDC-4、CDC-5、CNIR5、CNIR5. 2、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR7-TAT、CNIR9、CNIR10、CNIR800、 CNIR800. 2、CNIR800-3、ΧΗΧ2-81、ΧΗΧ2-91、ΧΗΧ3-1、ΧΗΧ3-2、ΧΗΧ3-26 或 ΧΗΧ3-32，或其衍生物或类似物。可选地，所述底物可以包含一种着色染料或化学试剂，所述着色染料或化学试剂有效地诱导颜色或PH变化。此外，所述底物可以被连接至颗粒、微球，或被连接至生物素。同样，病原性细菌和病理生理状况如上所述。此外，由细菌细胞产生的信号可以具有从大约300nm至大约900nm的波长。特别地，所产生的信号可以具有从大约650nm至大约 800nm的波长。
在本发明的其它另一个实施方案中，提供了一种针对细菌内酰胺酶的底物， 所述底物基于β_内酰胺酶对于其的活性产生可检测的荧光、冷光或比色信号。在该实施方案的各个方面中，所述底物可以是荧光基因底物⑶C-ι、⑶C-2、⑶C-3、⑶C-4、⑶C-5、 CNIR5、CNIR5. 2、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR7-TAT、CNIR9、CNIR10、CNIR800、CNIR800. 2、 CNIR800-3、ΧΗΧ2-81、ΧΗΧ2-91、ΧΗΧ3-1、ΧΗΧ3-2、ΧΗΧ3-26 或 ΧΗΧ3-32，或其衍生物或类似物， 或者可以包含着色染料或化学试剂，所述着色染料或化学试剂基于内酰胺酶对于它们的活性有效地产生颜色或PH变化。同样，底物可以进一步包含与其连接的颗粒、微球或生物素。
在本发明的其它另一个实施方案中，提供了一种用于实时检测受试者中的病原性细菌的方法，其包含向所述受试者引入用与Y发射相关的同位素进行放射性标记的底物； 其中所述底物用于β_内酰胺酶或者病原性细菌特定的其它酶或蛋白质；使受试者的在对于底物的活性过程中来自于放射性标记底物的Y发射成像；获取由发射的Y射线产生的信号；以及产生基于由Y射线产生的信号强度的放射性 标记在受试者中的浓度的3D重建， 从而检测病原性细菌。
关于该实施方案，所述方法包含基于病原性细菌检测的，与病原性细菌相关的病理生理状况的实时诊断。在另一个进一步的实施方案中，所述方法包含施用一种或多种有效用于治疗病理生理状况的治疗性化合物。在其它另一个进一步的实施方案中，所述方法包括向受试者再次施用放射性标记的底物；以及使受试者再次成像，以监控所述治疗性化合物的有效性；其中与诊断时的Y发射相比的Y发射的降低表明对病理生理状况的治疗效果。在这些进一步的实施方案中，所述病理生理状况可以是结核病。
在所有这些实施方案的一个方面中，所述放射性标记可以是发射正电子的同位素并且可以通过正电子发射断层显像(PET)来成像。在另一个方面中，放射性标记可以是直接发射Y射线的同位素并且可以通过单光子发射计算机断层显像(SPECT)来成像。在这些实施方案的所有方面中，其它酶或蛋白质可以是β_内酰胺酶样酶或结合青霉素的蛋白质。同样，在所有实施方案中，细菌物种可以如上所述。
在本发明的其它另一个实施方案中，提供了适合于PET或SPECT成像的，针对细菌内酰胺酶的放射性标记的底物。在该实施方案中，放射性标记可以是氟-18、氮-13、 氧 _18，碳-11、得-99m、鹏-123 或钢-111。
在本发明的其它另一个实施方案中，提供了一种用于可视化检测生物样品中的病原性细菌的分析设备，所述分析设备包含平台，所述平台具有用于接收孵育混合物的装置， 所述孵育混合物包含生物样品和针对与病原性细菌有关的β_内酰胺酶的生色底物，并且所述平台具有用于捕获和浓缩由β_内酰胺酶对于底物的活性产生的着色产物的装置，所述装置与所述接收装置液体相连。
关于该实施方案，所述分析设备可以包含用于仅允许着色产物从所述接收装置向下游流动的装置。在另一个进一步的实施方案中，所述分析设备可以包含在所述接收装置下游的内部对照。在其它另一个进一步的实施方案中，所述分析设备可以包含用于吸收在所述接收装置下游的流体的装置。
在所有实施方案中，所述底物可以包含一种着色染料或化学试剂。同样在所有实施方案中，所述底物可以被连接至颗粒或微球。在这些实施方案的一个方面中，所述底物包括化学试剂并且所述设备进一步包含第二试剂，以便由所述化学试剂产生颜色。在这些实施方案的另一个方面中，所述底物被连接至生物素并且所述设备进一步包含抗生物素蛋白，以便捕获与生物素连接的底物。
本发明提供了用于细菌性疾病和/或感染的光学成像系统和方法。对于在疾病过程中细菌的量化和定位以及抗微生物药活性的体内实时分析而言，这些系统和方法是极其敏感的工具。可以预期，这些系统有效用于在单细胞水平上检测细菌病原体。这些体内成像(IVI)系统和方法能够直接应用于处于临床环境中的患者。
本文的系统和方法能够适用于自然拥有β -内酰胺酶活性或获取β -内酰胺酶活性的细菌物种。在不受限制的情况下，β_内酰胺酶阳性细菌物种的实例有拟杆菌属、梭菌属、链球菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、军团菌属、分支杆菌属、嗜血杆菌属、埃希氏菌属、 沙门氏菌属、志贺氏菌属或李斯特菌属。特别考虑的是分支杆菌(例如，结核分支杆菌和牛分支杆菌)的诊断、定位和量化。尽管本文所述的系统和方法的优势在于它不需要待检测的细菌菌株的工程，但是可以预期，提高β_内酰胺酶的表达、活性和/ 或分泌的方法以提高检测的灵敏度。因此，可以预期，通过借助于任何能够应用的方法向任何感兴趣的细菌物种或菌株中引入β_内酰胺酶，检测内酰胺酶细菌物种以允许其敏感地检测，所述方法允许足够水平的内酰胺酶的表达和分泌。这可以通过在体外或体内使用已知的和标准的递送方法来实现，包括使用适合于向哺乳动物递送载体的噬菌体。
本发明的体内成像系统可以检测由化合物或报告子产生的荧光、冷光或比色信号，所述化合物或报告子用作针对β_内酰胺酶活性的底物。成像系统是本领域公知的和商购可得的。例如，连续报告-酶荧光(SREF)系统、连续报告-酶冷光(SREL)系统或生物冷光系统可以用于检测β_内酰胺酶活性产物。此外，获取的信号可以用来产生用于定位细菌病原体的3D表示法(representation)。对于这些系统,成像领域的普通技术人员基于所使用的化合物和/或报告子以及待检测的信号类型能够很好地选择激发和发射波长。一般来说，成像或激发波长和发射波长二者均可以是从大约300nm至大约900nm。激发信号的实例可以在大约540nm至大约730nm的范围内并且发射信号在大约650nm至大约800nm的范围内。同样可以预期，本发明的体内成像系统还可以检测其它信号，如通过辐射产生的信号，或者通过其它β_内酰胺酶对于合适的底物或其它检测剂的活性产生的任何能够检测的或者能够读取的信号。
本发明的β -内酰胺酶底物可以是化学底物或量子点底物。用于使用SREL或SREF 成像的底物，例如，可以是荧光团、笼式荧光素或者其它的荧光、冷光或比色化合物、报告子或者其它的检测剂，其为所需应用提供最好的信号。在允许良好渗透入任何组织的水平下， 所述底物具有非常低的毒性或者没有毒性，并且具有高信噪比。所述信号是近红外、红外或红光信号，例如，从大约650nm至大约800nm。
例如，底物可以是荧光基因底物或量子点底物，其产生基于体外或体内的内酰胺酶裂解的信号。荧光基因底物可以包含FRET供体，如靛青(indocyanine)染料，例如， Cy5、Cy5. 5 或 CY7 或 IRDye800 和 FRET 淬灭剂，如淬灭组 QSY21、QSY21 二磺酸盐、QSY22 或 QSY22 二磺酸盐或IRDyeQC-Ι。此外，荧光基因底物可以包含全乙酰化D-葡萄糖胺，以提高细胞的穿透性和/或可以被连接至小肽，例如(但不限于)TAT。此外，所述底物可以被修饰， 以提高其信号强度、组织穿透能力、特异性或在所有组织中很好地分布的能力。此外，可以预期，用于组织、细胞或与这些底物联合的其它化合物的其它标记方法有利于改善灵敏度和细菌病原体的检测。例如，荧光基因底物可以包含(但不限于包含)甲基、甲氧基或苄基部分和/或可以含有用于离去基团更大释放的顺式或反式双键。
特别地，荧光基因底物可以检测细菌细胞培养物中或体外单一培养的细菌细胞中的β-内酰胺酶活性。化学荧光基因底物的实例有CC1、CC2、CHPQ, CR2、CNIRl或 CNIR6。可选地，对于体内成像应用而言，荧光基因底物可以是CNIR2、CNIR3、CNIR4、CNIR5、 CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR9、CNIRlO、CNIR7-TAT 或 CNIR800，或其衍生物或类似物，或者类似于CNIR5 (如CNIR5. 2)或类似于CNIR800 (如CNIR800. 2或CNIR800- 3)的荧光基因底物。 本发明还提供用于体外和体内成像的荧光基因底物⑶C-1、⑶C-2、⑶C-3、⑶C-4和⑶C-5， 或其衍生物或类似物，其基于Mtb BlaC的水解来释放作为荧光团的7-羟基香豆素，或者提供类似于CDC-1、CDC-2、CDC-3、CDC-4和CDC-5 (特别是CDC-5)的荧光基因化合物，如(但不限于)ΧΗΧ2-81、ΧΗΧ2-91、ΧΗΧ3-1、ΧΗΧ3-2、ΧΗΧ3-26 或 XHX3-32，或其衍生物或类似物。这些荧光基因底物在连续报告-酶荧光(SREF)系统中是有用的。可以预期，所述β_内酰胺酶底物有效用于检测体外或体内的单个细菌细胞。
用于体内检测β_内酰胺酶的荧光基因底物的另一个实例是笼式荧光素，如(但不限于)BluC0、BluC02或Bluco3。该底物包含D-荧光素(萤火虫荧光素酶(Fluc)的底物) 和@-内酰胺(@-内酰胺酶的底物)。通过酶的内酰胺裂解释放D-荧光素，其基于 Fluc的氧化而发冷光。笼式荧光素在连续报告-酶冷光(SREL)系统或其它生物冷光成像系统中是有用的。
荧光蛋白同样可以用于体外和体内检测细菌病原体。荧光蛋白(FP)如mPlum、 mKeima、Mcherry和tdTomato被克隆到表达载体中。感兴趣的细菌病原体(如结核分支杆菌)与FP构建体一起转化。通过细菌的荧光蛋白表达产生基于成像的能够检测的信号。其它成像系统可以利用被转化以分泌其它酶(如β_半乳糖苷酶)的重组细菌，其在荧光团(例如，C2FDG、C12RG或DDA0G)的存在下产生荧光信号。此外，其它成像系统利用表达其它荧光素酶(如叩头虫红或rLucS)的其它重组系统，其在底物(例如，D-荧光素)的存在下产生信号。
此外，底物可以包含着色的或可视化染料。着色的或可视化染料可以是(但不限于)德克萨斯红、罗丹明、溴甲酚染料(多种颜色)、花青染料。此外，底物可以包含一种基于 β_内酰胺酶活性而产生颜色变化的化学试剂，所述颜色变化如源自PH变化的或其它化学诱导的颜色变化。
可选地，可以使用正电子发射断层显像(PET)或单光子发射计算机断层显像 (SPECT)的成像系统。探针可以包含针对本文所述的病原性细菌的内酰胺酶、内酰胺酶样酶或其它类似的酶或蛋白质的底物。PET和SPECT成像技术是本领域中公知的。 对于PET成像，底物探针可以采用发射正电子的放射性同位素标记，如(但不限于)氟-18、 氧-18、碳-11或氮-13。对于SPECT成像，底物探针可以采用发射Y-射线的放射性同位素标记，如(但不限于)锝-99m、碘-123或铟-111。使用标准的和公知的化学和放射化学合成技术可以合成PET和SPECT探针。
可以预期，使用小分子(如头孢哌酮)可以使探针的设计和特异性最大化，以建立 β_内酰胺酶口袋的模型。因此，使用这种高通量小分子系统，底物可以被设计为具有用于诊断目的的最大灵敏度，以及适合于产生有效地穿透深部组织的用现有的成像设备能够检测的信号并避免与其它细菌物种的交叉反应。同样，这样的敏感和特异的底物探针在单一细菌的水平下是有效的，并能够增加由其获得的信号量100倍至1000倍。同样，可以预期， 不同于结核分支杆菌中的β-内酰胺酶的β-内酰胺酶样酶和结合青霉素的蛋白质能够被设计为改善探针的特异性。
本文所述的系统和方法有效用于实时地检测、定位、量化和测定细菌病原体的活力。体外采用细胞培养或单一培养的细胞或者离体采用临床样品或标本使用SREL或 SREF或者在受试者体内使用任何公开的成像系统可以进行成像。体外使用的样品可以包括(但不限于)活检、胸腔积液、痰液和包括可能含有细菌病原体的血液、唾液、尿液和粪便的其它体液。因此，本文提供的系统和方法有效用于诊断与细菌病原体相关的病理生理状况，如疾病或感染。因为能够检测非常低的水平，包括单一细菌，所以诊断能够是即时的并且处在比现有的诊断方法更早的感染点。本文所述的系统和方法可以用于测试和定期筛查可能面临细菌感染风险的医护人员。另外，这些系统和方法同样能够用于筛选和检测仪器、器皿、设施、工作表面、衣服或者人体上的污染。因为耐 甲氧西林金黄色葡萄球菌(methici 11 in-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)感染存在于高达 40% 的医护人员中并且主要的感染部位是鼻道和由过度清洗造成的手部裂缝，所以本发明作为针对医护中心和工人中的细菌病原体的筛选方法是有用的。这些系统和方法必要时可以用在农业和动物园应用中以检测内酰胺酶。
同样，信号强度与细菌数量的相关性很好地处于现有成像技术的限制范围内。因此，能够实时监控化合物、药物、药物组合物或其它治疗剂的功效。因此，本文所描述的系统和方法提供一种用于筛选抗菌剂的高通量系统。因为β-内酰胺酶的检测需要细菌活力， 所以在一种或多种治疗剂的存在下的酶水平提供抗微生物活性的测量。适合于特定细菌的底物的使用允许快速测量β-内酰胺酶水平的变化和治疗剂有效性的几乎即时的测定。对于一次测量微孔板中一个至数千个样品而言，通量系统是有用的。
更特别地，本文所描述的REF系统有利于使用流式细胞仪、共聚焦显微镜或荧光光谱仪的，用于检测和量化感染细胞的许多其它的体外方法。一旦β_内酰胺酶底物处在细胞当中，由细胞内细菌分泌的内酰胺酶就裂解内酰胺环，进而以近红外荧光色来标记感染的细胞。使用流式细胞仪能够区分和量化感染的细胞和未感染的细胞。同样，使用不同颜色标记的细菌，(例如，但不限于，绿色荧光蛋白标记的细菌和冰冻切片)，采用荧光共焦显微镜来观察和分析感染的组织。特别地，在一个非限制性实例中，如果利用产生蓝色的DAPI对细胞核染色，那么人们可能看到细胞质中积累的绿色的细菌和红色的裂解β-内酰胺酶底物。此外，由于使用裂解底物的特定的激发和发射波长β_内酰胺酶底物可以标记已感染的细胞，所以采用荧光光谱仪来量化感染的细胞或均质化的感染的组织。
下面给出实施例用于阐明本发明的各种实施方式的目的，其并不意味着以任何方式来限制本发明。
实施 例1
培养物中结核分支杆菌中的Bla检测
使用生长至早期对数期的全细胞和全细胞溶菌产物(lysate),对于结核分支杆菌中Bla的检测，比较潜在的荧光基因底物化合物和已知化合物，包括头孢硝噻吩 (Calbiochem)>CENTA Bla 底物(Calbiochem)、Fluorocillin Green (Molecular Probes)、 CCF2-AM (Invitrogen)和CCF4-AM (Invitrogen)。针对所有这些样品分析稀释液，以测定产生显著信号的细菌的最低数量或溶菌产物的量。在采用完整细胞分析之前和之后以及对于溶菌产物的溶解之前进行效价测定，以测定实际所使用的CFU的数量。使用在细菌培养基中于37°C孵育15-120分钟的96孔板，采用分光光度法一式四份地评价灵敏度和重现性。 起初，以生产商建议的浓度使用化合物，并且对于CNIR5而言为2nM (即，用于体内成像)。 在培养基中评价灵敏度和重新性最好的化合物的不同浓度，以测定最大信号所需的最小浓度。用于这些实验的对照包括阳性对照耻垢分支杆菌(M. smegmatis)和商购可得的Bla (Sigma)并且阴性对照是缺乏Bla的Mtb blaC突变体(PM638，由罗切斯特大学，M. Pavelka 博士提供)(I)。同样评价了通过BCG的Bla的生产，因为在某些情况下，BCG用于BL2处的IVI，其中更广泛的成像设备都是现成的。
评价blaC突变体和野牛型结核杆菌中的重组Bla构津体
两个多拷贝和两个单拷贝载体用于Mtb中的Bla表达。多拷贝载体基于PJDC89， 所述PJDC89携带来自于pMV262的hsp60的启动子(Phsp60)，其已被证明在中等水平表达基因。该载体还携带潮霉素抗性，Phspeo的多接头下游，大肠杆菌的复制起点和分支杆菌 PAL5000的复制起点。为了增加来自于该载体的表达，采用L5启动子(PL5)替换Phsp60， 其以高于Phsp6050倍至100倍的水平表达基因。两个启动子是相对组成型的，并且应该在大多数体内条件下表达。除非另有说明，使用In-Fusion2. OPCR克隆系统(Clontech)进行大多数克隆，其允许使用引物上用于感兴趣区域的PCR的，具有同源性的15个碱基对的最小区域，将片段直接克隆到任何线性的构建体中。
通过克隆含有ccdB基因以及每个启动子下游的左侧和右侧Gateway重组序列的 PCR片段,将两个构建的载体修饰为Gateway (Invitrogen)供体载体。携带该区域的载体必须被保持在允许该区域保持的ccdB幸存者(Survivor)菌株中；然而,在其它大肠杆菌菌株中，该区域将是致命的并且用于防止克隆过程中非重组载体的保持。这些启动子和相关的Gateway区域被克隆到pYUB412中，其携带潮霉素抗性、大肠杆菌的复制起点、L5曬菌体附着位点(attP)和L5重组酶，以便其在分支杆菌染色体中的attB位点上整合，并通过单拷贝稳定的分支杆菌保持。使用通过Gateway BP反应(Invitrogen)携带Gateway重组序列的引物，通过PCR将Mtb Bla克隆到这些载体的每一个当中。通过如(2)所述的电穿孔， 将这些载体转化到Mtb和blaC突变体中。与作为阴性对照的blaC突变体和单独含有适当的载体骨架的野生型相比较，使用针对内源性Bla分析所描述的体外分析和信号强度，评价所得的Mtb菌株以检测。
虽然CNIR5是高度膜穿透的，通过使Bla靶向宿主细胞膜可以增加信号的强度。所述宿主细胞膜具有用于报告子的比单独的细菌更大的表面积并且促进接近化合物。由于分支杆菌吞曬体不是静态的，其与数个脂质和受体回收途径(receptor recycling pathway) 相互作用，并且具有几个存在于回收核内体中的标记物，适当靶向的蛋白质将通过分支杆菌吞噬体接近宿主细胞的质膜。Mtb Bla通过位于其氨基末端的TAT信号从细菌中分泌，形成使该蛋白质定向于理想的质 吴的竣基末端标签(tag)。糖基憐脂酸肌醇(GPI)铺定蛋白质(如在巨噬细胞表面优良表达的CD14)，通过羧基末端的信号序列定位至质膜。
采用来自于CD14的羧基末端24个氨基酸GPI锚定蛋白质信号序列和来自于Mtb 的Bla构建融合(Bla: :GPI)。然后使用Gateway系统将该融合蛋白质放置到针对Mtb的所有四个表达系统中，并且将其转化到野生型Mtb和blaC突变体中。使用细胞内分析，针对感染的巨噬细胞表面上的Bla水平来评价得到的表达Bla: :GPI的菌株、作为阴性对照的 blaC突变体和原始Bla。不仅测试了完整的感染巨噬细胞，而且测试了采用O. 1%的Triton 溶解的感染巨噬细胞。
水解之前和水解之后的底物荧光光谱
采集ImL浓度为I μ M的PBS溶液中的激发和发射光谱。向该溶液中加入IOnM的纯化Bla，再次采集激发和发射光谱，直至没有进一步的变化。通过比较690nm (其为峰值发射波长)处的发射强度来估计Bla水解之后探针荧光信号的增加。
作为Bla底物的探针的体外酶促动力学
690nm处荧光强度增加的速率(V)被用作衡量探针水解的速率。以InM的Mtb Bla浓度，在5、10、20、50、80 μ M的不同浓度下测量速率(ν)。底物的水解速率(Ι/v)相对底物浓度(I/[探针])的双倒数绘制图用于估计用于Bla水解的探针的KMt和Km值。
底物的牛物稳定件
由飞90nm处荧光强度增加的速率同样能够估计生理条件下底物的自发水解速率。因此通过于室温孵育I小时后的荧光定量能够很容易地评价底物在水性缓冲液和血清中的稳定性。
培养细胞中的成像Bla表达
采用Bla转染的(cmv-bla)和野生型的Jurkat和C6神经胶质瘤细胞系测试底物， 并且使用公开的成像条件，采用荧光显微镜来成像(3 )。
mRNA水平和NIRF信号之间的线件相关件
以各种比例(10%、20%、40%、60%和80%的cmv-bla细胞)，5xl05/mL的细胞密度来混合野生型的和cmv-bla的Jurkat细胞。在每种细胞混合物中孵育5 μ M的底物30分钟之后， 采用冷的PBS洗涤每个样品，离心并溶解。对最终的上清液进行荧光测量。使用northern 分析来量化mRNA和Bla酶的水平。mRNA浓度对Cy5. 5荧光强度的绘制图揭示两者之间是否存在线性关系。
培养物中结核杆菌P -内酰胺酶的定位和调节
通过贯穿于O. 05的O. D.下接种并生长至静止期(O. D. =2)的Mtb整个生长曲线的qRT-PCR测试Bla的转录。通过每天从相同培养物的等分中分离RNA来评价转录水平， 并且所有培养物一式三份地生长。如前面所述，进行RNA分离(4)和使用SYBR Green的 qRT-PCR (5)。在生长曲线上的一个或两个关键点，通过Northern印记法确认RNA的水平， 并且针对16SrRNA将所有的测量进行归一化。数据被比作在相同条件下使用全细菌和全细胞溶解产物的采用头孢硝噻的Bla活性测量。
测试β -内酰胺诱导blaC的能力。在存在和不存在β -内酰胺下，以贯穿生长曲线的相同方式来分析RNA转录。将50、250和500 μ g/ml的羧苄青霉素(其杀死Bla阴性的 Mtb)与生长至早期对数期的Mtb共同孵育两个小时，并且与全细胞和全细胞溶解产物中的 Bla活性一起测定blaC的转录水平。使用标准曲线来量化Bla水平，所述标准曲线使用商购可得的Bla (Sigma)构建，并且以相同方式生长的Mtb blaC突变体将被包括在内作为 Bla活性的阴性对照。
巨噬细胞中的Bla检测
基本上，将J774A.1细胞以I X IO4细胞/孔的密度接种于96孔平底板中并于37°C 孵育过夜。以从1000至O. 001细菌/细胞的各种感染多样性(multiplicity)，加入生长至早期对数期的Mtb的单一细胞悬浮液，并于37°C孵育30分钟。然后采用PBS和添加有 200 μ g/ml阿米卡星的新鲜介质将孔洗涤两次，并于37°C孵育2小时以杀死胞外细菌。然后采用PBS来洗涤孔并且在分光光度法测量信号之前，在加有不同浓度的测试化合物的新鲜介质中孵育60至180分钟。在添加化合物之前，采用O. 1%的Triton X-100来溶解副本孔(duplicate well),以评价宿主细胞穿透性在所获得的测量中的作用。
在所有的时间点上，四个未处理孔用来测定与孔相关的CFU的数量。针对那些被证明是最有效的化合物，通过荧光显微镜法来确认信号的定位。以类似的方式进行显微镜法分析，但是使用8孔室玻片来定位信号，测定具有阳性信号的细菌的百分比，并评价的定位信号的强度。
牛物检定和药代动 力学
在注射后的不同时间间隔(30分钟、240分钟、12小时、24小时、48小时和72小时),通过颈椎脱臼处死麻醉小鼠(每个时间点三只小鼠)。通过心脏穿刺收集血液样本,并且迅速收获组织(肿瘤、心、肾、肝、膀胱、胃、大脑、胰腺、小肠和大肠、肺以及脾)，以通过荧光计来测量近红外荧光。数据表示为每克组织中的荧光单元(FU) [FU/(g组织)]。
g -内酰胺酶的活性测定
使用以下方案测量异种移植的肿瘤中的Bla酶水平采用冷的PBS将获得的肿瘤洗涤两次；添加来自于Promega的溶解缓冲液(每克组织4mL)，并匀浆化组织溶液；使匀浆冷冻和解冻3次，并通过离心收集上清液；使用荧光基因底物CCl来测定Bla活性。通过以下来自于Qiagen Inc的RNA提取方案来证实cmv-bla肿瘤中Bla的mRNA并进行RT-PCR 试验。这些测量验证了观察到的cmv-bla转染肿瘤中的近红外信号与Bla活性是否相关。
Bla RNA体内表汰的测定
使用针对结核杆菌的标准RNA提取方法(6)提取体内表达的Bla RNA，并且运行与组成对照rRNA基因有关的qRT-PCR。这些测量提供了一种手段来评价与观察到的IVI信号水平相比，Bla在所有组织中的表达水平。已收获的RNA水平本应该处于RT-PCR检测限以下，然而组织中却存在能够量化的CFU，在使用phi29聚合酶(Fidelity Systems)的RT-PCR 之前对cDNA进行扩增，所述phi29聚合酶有能力以高逼真度以线性方式来扩增DNA，允许扩增后模板水平的真实量化。
体内Bla菌株的表汰、稳定件和毒力
通过气溶胶，以介于100-1000Cfu/肺之间的量感染八组Balb/c小鼠(每组四只)。 从-80°C储备液中解冻细菌菌株，两次通过27G注射器针头以产生单细胞悬浮液并用于气溶胶感染。使用在威斯康星大学构建的“Madison”盒来进行气溶胶感染，所述“Madison” 盒被设计为将飞沫核直接递送至肺泡腔(7-10)。在被设计为处理致命性结核杆菌菌株的已认证的ABSL3设施中进行采用Mtb的感染。感染的老鼠被安置在比较医学中心(Center for Comparative Medicine)的ABSL3隔室中直至尸检。在所有时间点(第1、14、28和72 天)对用于每一种细菌菌株(blaC和WT)的一组小鼠(共四只)进行尸检，以测定针对blaC 的CFU、RNA水平以及肺和脾中的Bla活性。RNA转录水平和使用头孢硝噻的Bla活性如本文所述。
针对为IVI提供保障的两种重组菌株，测试了重组Bla体内表达的稳定性和毒力效果。如上所述，通过气溶胶，以介于100-1000cfu/肺之间的量感染十二组Balb/c小鼠 (每组四只)。在所有时间点(第1、14、28和72天)对用于每一种细菌菌株(野生型、构建体 I和构建体2)的一组小鼠(共四只)进行尸检，以测定CFU、进行组织病理学检验、测定适当的构建体的存在以及肺和脾中的Bla活性。使用Bla分析来测定携带构建体的细菌种群的百分比，所述Bla分析在来自于CFU滴度板的至少20个单独菌落上进行。Bla活性分析在匀浆化的组织上进行以评价剩余Bla的总体水平。Bla活性将使用本文所述的头孢硝噻来评价。
实施例2
使用细胞移植模型的生 体组织内检镜(intra-vital microscopy)成像
将通用供体Tr、⑶8+T细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞移植到采用BCG 感染的同系小鼠中，并且采用体内生物冷光成像法(BLI)和图像指导的生体组织内检镜 (IVM)使这些细胞的经时分布成像。一种转基因小鼠系(其中荧光素酶通过β_肌动蛋白启动子产生)提供组织和细胞的来源，所述组织和细胞将在非转基因动物中发光(11-12)。该小鼠系(L2G85)，显示出来自于萤火虫荧光素酶(Fluc)的明亮的生物冷光，和微弱的GFP荧光，所以其与一个单独的在淋巴细胞中表现出强烈的GFP表达和荧光的种系交配。因此，在通用供体干细胞和其它细胞的空间分布后，能够进行它们所展现的接受者中的BL1、重新分布或将被清除，并通过利用GFP的IVM能够随后观察到检测的细胞。
L2G85小鼠在FVB背景下构建，所以FVB/NJ (Jackson Labs)野生型小鼠被用作针对来自于L2G85的细胞的接受者，防止移植细胞的排斥。采用20 μl生理盐水中IO4CFU 的BCG鼻内地感染总共80只FVB/NJ小鼠。于24小时处死四只小鼠，以测定感染后肺部中的初始CFU。于感染后第14天处死另外四只小鼠，用于组织病理学检验并测定肺和脾中的CFU。同样于第14天，将剩余的72只小鼠分成4组，并且具有通过尾部静脉注射引入的 L2G85TrXD8T细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或无细胞(对照组)。于第28、42和56 天，如(12)所描述，使六组(包括对照组)小鼠(每组四只)在D-荧光素的存在下成像。
成像之后，通过使用光纤共焦荧光显微镜(Cell-ViZio，Mauna Kea)的生体组织内检镜(IVM)进行明显病变的更详细检查。IVM使用由成千上万的光纤组成的灵活的迷你探针。施以全身麻醉并且通过一个快速愈合的小切口来探查区域，防止手术后需要处死动物， 并允许细胞水平上的可视化。
在成像之后处死对照组小鼠，以测定肺和其它器官中的CFU，其中在引入细胞的小鼠体内观察到信号。获得背部、腹部和两个侧面的图像，以更好地测定光子发射的来源。通过解剖组织、在D-荧光素中孵育新鲜组织以及在不含上覆组织的条件下使其成像，在一个子集的动物中获得进一步的确认。在所有用于荧光显微镜法的明显感染的组织上进行详细的病理组织学检验，以使表达GFP的移植细胞可视化并进行苏木精-伊红染色和和抗酸染色以鉴定组织内的细菌和细胞。
在肉芽肿形成过程中对于单个细菌和免疫细胞的体内成像
使用移植模型，选择两种允许肉芽肿形成的最佳可视化的移植细胞类型，用于存活小鼠中细菌和宿主细胞的同时可视化。选择三个时间点，其中病变刚好变得可见、很好地形成以及其中能够观察到来自于移植细胞的信号的最近的时间点。采用20μ I生理盐水中 IO4CFU的BCG表达IVI报告子(例如tdTomato)鼻内地感染总共32只FVB/NJ小鼠。另外一个组的四只对照小鼠是未感染的。于24小时处死四只实验小鼠，以测定感染后肺部中的初始CFU。于感染后第14天处死另外四只小鼠，用于组织病理学检验并测定肺和脾中的CFU。 同样于第14天，将剩余的24只小鼠分成4组，并且使12只含有允许通过尾部静脉注射引入的肉芽肿形成的可视化的L2G85细胞，作为对照组的12只不含细胞。在三个时间点，如(12)所描述，使两组(含有细胞组与不含细胞组)小鼠(每组四只)在D-荧光素的存在下成像。
成像之后，通过使用光纤共焦荧光显微镜(Cell-ViZio，Mauna Kea)的生体组织内检镜(IVM)进行明显病变的更详细检查。施以全身麻醉并且通过一个小切口来探查区域。 在成像之后处死对照组小鼠，以测定肺和其它器官中的CFU，其中在引入细胞的小鼠体内观察到信号。获得背部、腹部和两个侧面的图像，以更好地测定光子发射的来源。通过解剖组织、在D-荧光素中孵育新鲜组织以及在不含上覆组织的条件下使其成像，在一个子集的动物中获得进一步的确认。对于解剖组织中的两个移植细胞和细菌报告子信号使用过滤器组件。在用于荧光显微镜法的所有明显感染的组织上进行详细的病理组织学检验，以使表达 GFP的移植细胞和细菌报告子信号可视化并进行苏木精-伊红染色和抗酸染色以鉴定组织内的细菌和细胞。
成像分析
在使用购自Xenogen Inc的Living Image软件的PC计算机上处理已采集的图像。 绘制肿瘤上感兴趣的区域(ROI)的全身荧光图像。IVIS成像系统的关键特征之一在于它是针对一种美国国家标准和技术研究院(NIST)的可追踪光谱辐射源而校准的。该校准提供了 CCD照相机计数向受试者表面上的辐射的转换，所述转换通过考虑经过镜片和光圈的损失(f/stop)和核算用于成像的时间和像素而完成。因此，所得的图像以表面辐射的物理单位表示(光子/秒/平方厘米/表面辐射)。来自于感染的小鼠、对照组小鼠和正常组织的 ROI的整合信号(以光子/秒为单位)在不同小鼠间之间进行比较(感染对照正常组织的比率)使用 GraphPad Prism3. O 进行统计分析(P〈0. 05, GraphPad 软件，San Diego, CA)。
实施例3
结核分支杆菌BlaC和BlaC突变体的酶的结晶
在数月的结晶之后获得非常好的BlaC晶体。使用O.1M Tris-HCl、pH8. O、 20. MNH4H2PO4的结晶条件来制备与青霉素的共结晶。这些晶体允许完整蛋白质的活性位点和中间体的可视化，但由于晶体本身的翻转(turnover)，初始的结合底物是不可见的。为了克服这个障碍，Mtb BlaC突变体酶由参与水解的Glu残基(E166A)中的突变构建，其允许酶上acy-中间体的捕集和催化所需的特定相互作用的可视化。该突变体已经采用快速(即， 大约两个星期)的结晶过程来结晶，所述结晶过程产生高品质的Mtb BlaC突变体，该突变体准备用底物来吸收(图1A)。这表明，采用直接吸收过夜能够将底物掺入到Mtb BlaC突变体结晶中。在移除到新鲜溶液中之后，晶体保留底物，如图1B中针对CNIR4的情况所示。直接吸收提供了一种多个底物更加快速的分析。结晶的BlaC突变酶已经能够实现先导化合物(头孢噻肟)的水解中间体结构的首次鉴定(图1C)，所述先导化合物在解析BlaC催化机制以改善底物化合物的设计中是有用的。
实施例4
用于β -内酿胺酶检测的荧光基因底物CC1、CC2、CHPQ和CR2
荧光基因化合物CC1、CC2、CHPQ和CR2有效用于检测体外和单一培养细胞中的Bla 活性。这些探针在通过Bla的水解之前是没有荧光的并且在Bla反应之后变成荧光的(图 2A-2C)。能够根据需要选择一系列不同的荧光发射以检测Bla :从CCl和CC2的蓝色、CHPQ 的绿色到红色CR2)。这些新的荧光基因底物小于CCF2，易于制备，使用简便，具有用于检测 Bla活性的高灵敏度并且促进在多样性生物样本中Bla活性的检测。
内酰胺的3’碳原子和离去基团之间的烯烃基团的插入有助于改善通过Bla的水解的动力学效率。例如，对于CC1，kcat值是174s—1，但是其没有插入双键的类似物的kMt值仅是35s'催化效率大约增加5倍。可以预期，该设计能够作为一般的策略以创建用于Bla 的种类繁多的荧光基因底物，包括用于整体动物荧光成像的近红外底物。
同样，可以 预期，采用新型淬灭剂QC-1和近红外荧光团IRDye800CW可以改善探针。此外，通过添加磺酸盐基团可以修饰基于IRDye的探针。
CNIRl、CNIR2、CNIR3、CNIR4、CNIR5、CNIR9 和 CNIRlO
为了采用全身荧光成像法使活体动物中的Bla表达成像，近红外/红外的荧光基因底物是有益的，因为红外/近红外光具有更好的组织穿透性和比可见光更少的光散射，以及少得多的血红蛋白吸收(13)。化合物CNIRU CNIR2、CNIR3、CNIR4、CNIR5、CNIR9 和CNIRlO是一系列用于使培养细胞中的Bla表达成像的近红外荧光基因底物(图3，图 6A-6B)。这些化合物作为用于建造用于Bla的细胞穿透性近红外荧光基因底物的框架是有用的，并且能够用于测试电荷对于细菌细胞内或动物中的探针可用性的影响。
报告Bla活性是基于荧光共振能量转移(FRET)。探针含有FRET供体和FRET淬灭剂。为了体内成像，理想情况下的荧光团应该具有650nm以上的发射和低毒性。靛青染料 (Cy5、Cy5. 5和Cy7)具有从650到800nm的发射，并且已经用于在成千上万的患者，几乎无副作用的报道。因此，CY5被选作FRET供体。已经阐明，淬灭基团，QSY21 (而不是具有从 540到730nm，峰值在660nm处的宽吸收光谱的荧光剂本身)，是一种针对Cy5发射的有效淬灭剂。
CNIRl基本上是非荧光的，但是一旦采用Bla处理，就会产生一种高度发荧光的产物，其于660nm波长处的发射强度增加57倍(14)。然而，CNIRl本身不是细胞穿透性的，从而不能够使Bla体内成像。为了改善CNIRl的膜穿透性，CNIRl与全乙酰化D-葡萄糖胺轭合，CNIR3,具有良好的细胞穿透性，并且能够使单一活体细胞中的Bla表达成像。在QSY21 上添加两个磺酸盐基团，以改善溶解度，得到CNIR4。
CNIR5 和 CNIR6
CNIRl到CNIR4均基于Cy5。对于动物体内成像，因其更长的发射波长而更加优选 Cy5. 5。因此，采用Cy5. 5来替代Cy5并合成CNIR5 (图4A)。通过HPLC来纯化最终产物， 并且通过质谱仪来表征(C122H123N11O39Sltl质量的计算值2687. 98 ;通过MALD1-MS的观察值 [M+H]+ 2687. 68)。当受激时，CNIR5本身于690nm的波长发射微弱的荧光，但是一旦采用 Bla处理，其强度增加9倍以上(图4D)。在pH7.1的磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS)中测量通过Bla的水解动力学催化常数kcat=0. 62 ±O. 2s—1，以及米氏常数Km=4. 6 ±1. 2 μ M (该值由水解速率对底物浓度的双倒数曲线的加权最小二乘拟合获得)。其催化效率(kMt/km)是 1.36x10V1., CNIR5在PBS中以及小鼠血清中是非常稳定的，其具有L 75X KT7iT1的自发水解速率，即，甚至在12小时培养之后，几乎未观察到荧光增加。同样，可以通过采用QSY22 替换QSY21来合成CNIR5 (图4B)。该合成非常类似于CNIR5的合成，并且是没有问题的。 下面将讨论QSY22的合成。CNIR6是CNIR5不含全酰化D-葡萄糖胺的类似物，并且作为对照组是有用的。
CNIR5也可以用于大规模的，商业用途的合成。在图4A中描绘的合成方案不适合于大规模的合成，这主要是因为碱性条件下探针的不稳定性。N，N-二异丙基乙胺(DIPEA) (淬灭剂和近红外染料Cy5. 5与内酰胺的轭合所必需的有机碱)通常加速β -内酰胺环上碳-碳双键的迁移，这产生CNIR5的异构体。这显著 增加了纯化过程的困难。为了在合成的早期避免将内酰胺化合物6元环上的硫化物氧化成亚砜的异构化并且在合成的晚期将所述亚砜还原为硫化物(图4C)。在硫化物的氧化以及淬灭剂和染料的轭合过程中没有检测到异构化。
CNIR7
CNIR7是CNIR5的修饰，改善其用于Bla体内成像的灵敏度。CNIR5中使用的淬灭基团QSY21 二磺酸盐于675nm处具有最大吸收，但是CY5. 5于690nm处具有最大发射。因此， 由于含有CNIR5，淬灭效率只有90%，这在很大程度上有助于观察到的背景荧光。在QSY21 和Cy5 (CNIRl)的FRET对中，由于QSY21和Cy5之间更好的光谱重叠，淬灭效率在98%以上。因此，能够于690nm吸收的淬灭基团将更好地淬灭Cy5. 5并降低背景信号。据报道，对于QSY21，当二氢吲哚被四氢喹啉替代时，吸收最大值红移14nm。
因此，通过采用四氢喹啉替代QSY21中的二氢吲哚基团来合成新结构的QSY22 二磺酸盐(图5A- )，其最大吸收应该类似地红移14nm。由于两者之间的结构差异仅在于 QSY22使用含有六元稠环的四氢喹啉，而QSY21使用含有五元的吲哚，使用磺化化学并且将会预期苯环上相同的的磺化位点(对位)。因此，QSY22 二磺酸盐应该更有效地淬灭Cy5. 5并且导致较低的背景信号。
其次，对于CNIR5，keat值大约为O. 6s—1，其远远小于CCl和CCF2。在淬灭剂和Cy5. 5 之间插入的双键应该也导致keat的增加。第三，FRET供体(Cy5. 5)和淬灭剂(QSY22 二磺酸盐)之间的距离被减小，以改善能量传递效率。CNIR5具有含有半胱氨酸的长的连接基团， 用于转运子(transporter)的掺入。在新的CNIR7中，所述转运子被连接至Cy5. 5上的其它偶联位点，因此，不再需要包括长的连接子(linker)。此外，2-氨基苯硫酚替代CNIR5中的4-氨基苯硫酚，并且进一步缩短Cy5. 5和淬灭剂之间的距离。NIR底物(CNIR7)的最终设计及其化学合成如图6A-6B所示。它的合成能够在更短的路线中完成并且将比CNIR5更容易。
CNIR7同样可以包含短的阳离子肽(如TAT序列)，以取代乙酰化的D-葡萄糖胺。D-氨基酸用于替代L-氨基酸，以避免肽酶水解。已经阐明短的阳离子肽如触角足(Antennapedia)的同源异型域(homedomain)的三级螺旋(15-16)、HIV-1Rev蛋白和 HTLV-1Rex蛋白的基本结构域以及HIV-1Tat蛋白的基本结构域能够穿透细胞的质膜。
CNIR9 和 CNIRlO
图中合成的淬灭剂QSY22被连接于内酰胺环上，以生产如图7A中所示的合成方案中所描绘的CNIR9。CNIR9显示出基于裂解的非常强的荧光，但是在不存在通过Bla的断裂下，显示出非常弱的荧光。如图7B中所示的合成方案中所描绘，采用更短的桥连基团和更少的硫酸盐来合成类似的化合物(CNIRlO )。
CNIR800 和衍牛物
CNIR800被设计为含有新的荧光团(IRDye800)，其在更长的波长(800nm)下发荧光以提高REF成像的灵敏度。CNIR800的更长的波长穿透组织，优于CNIR5的Cy5. 5荧光团，并且由于自发荧光而降低背景，因为在大多数组织中，自发荧光的波长在700nm以下。 CNIR800显示出非常低的背景荧光和采用BlaC裂解之后非常大的差异(25倍)。CNIR800. 2 (图11C)是采用不同连接子的CNIR800探针，所示连接子通过实施例5中所描述的可替代的方法合成，CNIR800-3 (图11D)本身是CNIR800衍生物，其在内酰胺环的R2位置上含有甲氧基取代。此外，CNIR800衍生物可以包含R2位置上的甲基取代或Rl位置上连接于7-胺的苄基。
CDC1-5 底物
由于Mtb BlaC具有比TEM-1Bla更大的活性位点，合理的是，内酰胺环上更大的取代基可能有助于改善TEM-1Bla上用于Mtb BlaC的荧光底物的特异性。首先评价内酰胺环的胺上的取代基的效果。为了简化合成并加快筛选过程，发荧光的底物包含胺-取代的内酰胺环，所述胺-取代的内酰胺环释放作为荧光团的7-羟基香豆素。基于TEM-1Bla或Mtb BlaC的处理，释放7-羟基香豆素并产生荧光信号。因此，通过简单地监控基于荧光团释放的底物的荧光强度，能够获得TEM-1Bla和Mtb BlaC的水解动力学(表I)。
如新的图8A中所描绘，合成荧光基因探针⑶C-1和⑶C-2，其中⑶C-2是⑶C-1的亚砜对应物(counterpart)。类似地,还制备了具有连接于内酰胺环胺基团的较大的取代基的探针⑶C-3和⑶C-4。已经表明，探针⑶C-1是TEM-1Bla优选的探针，其提供比Mtb BlaC 快得多的水解动力学。预期，具有更大取代基的CDC-3能够改善对于Mtb BlaC的特异性。
通过分别在TEM-1Bla和Mtb BlaC存在下的不同时间点测量荧光强度，来采用荧光仪测定探针的水解动力学。令人惊讶的是，如图8B所示，在2nM TEM-1Bla的存在下，底物⑶C-3显示出甚至比⑶C-1 (ΤΕΜ-lBla优选的底物)更快的水解动力学。这四种探针均为显而易见的TEM-1优选的，因为在相同的酶浓度(PBS中的2nM)、相同的时间量下采用Mt Bla处理之后荧光强度低得多。在2nM MtbBlaC的存在下荧光强度的增强是如此之低，以至于甚至难以精确测量。然后，IOnMMtb BlaC用于测定Mtb BlaC的水解动力学(图8C)。不幸的是，小的探针⑶C-1提供了甚至比更大尺寸的探针⑶C-3更快的采用Mtb BlaC的水解动力学，这说明对于BlaC特异性，胺上取代基的尺寸并不是关键的。亚砜探针CDC-2和 ⑶C-4均分别显示出比它们各自的硫化物对应物⑶C-1和⑶C-3慢得多的采用TEM-1Bla和 Mtb BlaC的水解动力学，特异性没有任何显著的改善。
研究在探针的内酰胺环上直接取代的基团的效果。如该图8D所描绘，合成在内酰胺环的7-位上具有甲氧基的底物CDC-5。采用如上所述的类似分析来测定CDC-5的水解动力学并且使用⑶C-1作为对照。与⑶C-1 (图8E)不同，⑶C-5清楚地显示出高的Mtb BlaC偏好(图8F)。在采用PBS中20nM的TEM-1Bla处理15分钟之后，探针CDC-5的荧光强度仅有略微增加，然而采用相同浓度的MtbBlaC能够检测到30倍以上的荧光增加，这表明对于内酰胺环的深刻的取代影响。采用Mtb BlaC处理15分钟的CDC-5的荧光强度是采用TEM-1Bla处理者的10倍以上。已被证明，⑶C-5是观察到的第一个Mtb BlaC优选的荧光基因探针。这样的取代结构能够容易地适用于CNIR5样或者CNIR800或CNIR800样，近红外探针的合成。
表I
基于香豆素的内酰胺探针的动力学参数。
权利要求
1.一种用于实时检测受试者中的病原性细菌的方法，其包含 向受试者中引入针对病原性细菌的β-内酰胺酶的底物或者使来自于受试者的生物样品或从表面获得的生物样品与针对病原性细菌的β-内酰胺酶的底物接触； 使受试者或样品的β-内酰胺酶对于底物活性得到的产物成像；和 获取由β-内酰胺酶产物发射的波长信号，从而检测受试者中的病原性细菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含建立发射信号的3D重建，以测定受试者中病原性细菌的位置。
3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含量化和/或区分生物样品中的已感染细胞与未感染细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中通过利用流式细胞术、共聚焦显微镜法或荧光光谱法中的一种或多种来进行已感染细胞的区分和/或量化步骤。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述底物是荧光基因底物CDC-1、CDC-2、CDC-3、CDC-4、CDC-5、CNIR5、CNIR5. 2、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR7-TAT、CNIR9、CNIR10、CNIR800、CNIR800. 2、CNIR800-3、ΧΗΧ2-81、ΧΗΧ2-91、ΧΗΧ3-1、ΧΗΧ3-2、ΧΗΧ3-26 或 ΧΗΧ3-32，或其衍生物或类似物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述底物包含有效地诱导颜色或pH变化的着色染料或化学试剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述底物被连接至颗粒或微球或被连接至生物素。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是痰液、胸腔积液、尿液、血液、唾液、粪便或通过擦拭受试者上感兴趣的区域而获得的样品。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述病原性细菌是拟杆菌属、梭菌属、链球菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌属、军团菌属、分支杆菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属或李斯特菌属的细菌物种。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述病原性细菌包含结核分支杆菌复合物或鸟分支杆菌复合物。
11.根据权利要求1所述的方法，其中获取的信号是荧光、冷光或比色信号。
12.根据权利要求1所述的方法，其中成像波长是从大约300nm至大约900nm并且发射波长是从大约300nm至大约900nm。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述成像波长是大约540nm至大约730nm并且所述发射波长是大约650nm至大约800nm。
14.一种用于诊断与受试者中的病原性细菌相关的病理生理状况的方法，其包含 向受试者施用针对病原性细菌的β_内酰胺酶的底物或使衍生自受试者的生物样品接触针对病原性细菌的β-内酰胺酶的底物； 使受试者的β_内酰胺酶对于底物活性的产物成像；和 在产物的发射波长下实时测量信号强度，其中大于测量的对照信号的信号强度与病理生理状况的诊断相关联。
15.根据权利要求14所述的方法，其进一步包含建立信号的3D重建，以确定微生物病原体的位置。
16.根据权利要求14所述的方法，其进一步包含量化和/或区分生物样品中的已感染细胞与未感染细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中通过利用流式细胞术、共聚焦显微镜法或荧光光谱法中的一种或多种来进行已感染细胞的区分和/或量化步骤。
18.根据权利要求14所述的方法，其进一步包含施用有效治疗病理生理状况的一种或多种治疗性化合物。
19.根据权利要求14所述的方法，其进一步包含 向受试者再次施用所述底物或使衍生自受试者的生物样品接触所述底物；和 使受试者或所述生物样品成像以监控治疗性化合物的有效性；其中与诊断信号相比的发射信号的降低表明对病理生理状况的治疗效果。
20.根据权利要求14所述的方法，其中所述病理生理状况是结核病。
21.根据权利要求14所述的方法，其中所述生物样品是痰液、胸腔积液、尿液、血液、唾液、粪便或通过擦拭受试者上感兴趣的区域而获得的样品。
22.根据权利要求14所述的方法，其中所述病原性细菌包含拟杆菌属、梭菌属、链球菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌属、军团菌属、分支杆菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属或李斯特菌属的细菌物种。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述病原性细菌包含结核分支杆菌复合物或鸟分支杆菌复合物。
24.根据权利要求14所述的方法，其中所述底物是荧光基因底物⑶C-1XDC-2、⑶C-3、CDC-4、CDC-5、CNIR5、CNIR5. 2、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR7-TAT、CNIR9、CNIR10、CNIR800、CNIR800. 2、CNIR800-3、XHX2-81、XHX2-91、XHX3-1、XHX3-2、XHX3-26 或 XHX3-32，或其衍生物或类似物。
25.根据权利要求14所述的方法，其中所述底物包含有效地诱导颜色或pH变化的着色染料或化学试剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述底物被连接至颗粒或微球或被连接至生物素。
27.根据权利要求14所述的方法，其中测得的信号是荧光、冷光或比色信号。
28.根据权利要求14所述的方法，其中成像波长是从大约300nm至大约900nm并且发射波长是从大约300nm至大约900nm。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述成像波长是大约540nm至大约730nm并且所述发射波长是从大约650nm至大约800nm。
30.一种用于检测受试者中分支杆菌感染的诊断方法，其包含 从受试者处获得生物样品； 使生物样品接触分支杆菌β_内酰胺酶的底物； 使生物样品的β_内酰胺酶对于底物活性的产物成像；和 在产物的发射波长下测量信号强度，其中大于测量的对照信号的信号强度显示分支杆菌感染的存在。
31.根据权利要求30所述的方法，其进一步包含量化和/或区分生物样品中的已感染细胞与未感染细胞。
32.根据权利要求31所述的方法，其中通过利用流式细胞术、共聚焦显微镜法或荧光光谱法中的一种或多种来进行已感染细胞的区分和/或量化步骤。
33.根据权利要求30所述的诊断方法，其进一步包含 重复所述方法步骤一次或多次，以监控基于分支杆菌感染检测的施用于受试者的治疗方案的治疗有效性；其中与对照相比的测量信号的降低与治疗方案的阳性应答相关联。
34.根据权利要求30所述的方法，其中所述生物样本是痰液、胸腔积液、尿液、血液、唾液、粪便或通过擦拭受试者上感兴趣的区域而获得的样品。
35.根据权利要求30所述的方法,其中所述分支杆菌感染由结核分支杆菌或结核分支杆菌复合物或鸟分支杆菌或鸟分支杆菌复合物引起。
36.根据权利要求30所述的方法，其中所述底物是荧光基因底物⑶C-1XDC-2XDC-3、CDC-4、CDC-5、CNIR5、CNIR5. 2、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR7-TAT、CNIR9、CNIR10、CNIR800、CNIR800. 2、CNIR800-3、XHX2-81、XHX2-91、XHX3-1、XHX3-2、XHX3-26 或 XHX3-32，或其衍生物或类似物。
37.根据权利要求30所述的方法，其中所述底物包含有效地诱导颜色或pH变化的着色染料或化学试剂。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述底物被连接至颗粒或微球或被连接至生物素。
39.根据权利要求30所述的方法，其中测得的信号是荧光、冷光或比色信号。
40.根据权利要求30所述的方法，其中成像波长是从大约300nm至大约900nm并且发射波长是从大约300nm至大约900nm。
41.根据权利要求30所述的方法，其中所述成像波长是从大约540nm至大约730nm并且所述发射波长是从大约650nm至大约800nm。
42.一种用于筛选治疗性化合物的方法，所述治疗性化合物有效用于治疗与受试者中的病原性细菌有关的病理生理状况，其包含 选择针对病原性细菌的潜在的治疗性化合物； 使细菌细胞或包含所述细菌细胞的生物样品接触其细菌内酰胺酶底物； 使所述细菌细胞或包含所述细菌细胞的生物样品接触潜在的治疗性化合物；和在存在和不存在所述潜在的治疗性化合物下测量由所述细菌细胞产生的荧光、冷光或比色信号；其中与不存在治疗性化合物的信号相比的存在治疗性化合物的信号的降低表明所述化合物对抗病原性细菌的治疗效果。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述底物是荧光基因底物CC1、CC2、CHPQ、CR2、CNIRl、CNIR2、CNIR3、CNIR4、CNIR5、CNIR5. 2、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR9、CNIR10、CNIR7-TAT、CNIR800、CNIR800. 2、CNIR800-3、CDC-1、CDC-2、CDC-3、CDC-4、CDC-5、ΧΗΧ2-81、ΧΗΧ2-91、ΧΗΧ3-1、ΧΗΧ3-2、ΧΗΧ3-26 或 ΧΗΧ3-32，或其衍生物或类似物。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述底物包含有效地诱导颜色或pH变化的着色染料或化学试剂。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述底物被连接至颗粒或微球或被连接至生物素。
46.根据权利要求42所述的方法，其中所述病原性细菌包含拟杆菌属、梭菌属、链球菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌属、军团菌属、分支杆菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属或李斯特菌属的细菌物种。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述病原性细菌包含结核分支杆菌复合物或鸟分支杆菌复合物。
48.根据权利要求42所述的方法，其中所述病理生理状况是结核病。
49.根据权利要求42所述的方法，其中由细菌细胞产生的信号具有从大约300nm至大约900nm的波长。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述由细菌细胞产生的信号具有从大约650nm至大约800nm的波长。
51.一种针对细菌β -内酰胺酶的底物，所述底物基于β -内酰胺酶对其的活性产生可检测的荧光、冷光或比色信号。
52.根据权利要求51所述的底物，其中所述底物是荧光基因底物⑶C-1XDC-2、⑶C-3、CDC-4、CDC-5、CNIR5、CNIR5. 2、CNIR5-QSY22、CNIR7、CNIR7-TAT、CNIR9、CNIR10、CNIR800、CNIR800. 2、CNIR800-3、ΧΗΧ2-81、ΧΗΧ2-91、ΧΗΧ3-1、ΧΗΧ3-2、ΧΗΧ3-26 或 ΧΗΧ3-32，或其衍生物或类似物。
53.根据权利要求51所述的底物，其中所述底物包含着色染料或化学试剂，所述着色染料或化学试剂基于β -内酰胺酶对其的活性有效地产生颜色或PH变化。
54.根据权利要求51所述的底物，其进一步包含与其连接的颗粒、微球或生物素。
55.一种用于可视化检测生物样品中病原性细菌的分析设备，其包含 平台，所述平台具有用于接收孵育混合物的装置，所述孵育混合物包含生物样品和针对与病原性细菌有关的β_内酰胺酶的生色底物，并且所述平台具有用于捕获和浓缩由β -内酰胺酶对于底物的活性产生的着色产物的装置，所述装置与所述接收装置液体相连。
56.根据权利要求55所述的分析设备，其进一步包含用于仅允许着色产物从所述接收装置向下游流动的装置。
57.根据权利要求55所述的分析设备，其进一步包含在所述接收装置下游的内部对照。
58.根据权利要求55所述的分析设备，其进一步包含用于吸收在所述接收装置下游的流体的装置。
59.根据权利要求55所述的分析设备，其中所述底物包含着色染料或化学试剂。
60.根据权利要求55所述的分析设备，其中所述底物被连接至颗粒或微球。
61.根据权利要求55所述的分析设备，其中所述底物包含化学试剂，所述设备进一步包含第二试剂，以便由所述化学试剂产生颜色。
62.根据权利要求55所述的分析设备，其中所述底物与生物素连接，所述设备进一步包含抗生物素蛋白，以便捕获与生物素连接的底物。
全文摘要
本发明提供使用针对细菌性酶的底物，用于检测、量化、区分、诊断和成像病原性细菌或与其相关的状况的方法。比较在细菌的存在下由底物或酶产品与对照发射的荧光、冷光或比色信号，以检测和定位所述病原性细菌。本发明提供一种通过测量在存在或不存在潜在的治疗剂下由底物或产品发射的信号而用于筛选治疗剂以治疗病理生理状况的方法和一种通过使生物样品接触底物并使由分支杆菌β-内酰胺酶产品发射的信号成像而用于检测受试者中的分支杆菌感染的诊断方法。本发明还提供发荧光的底物或包含有效诱导颜色或pH变化的着色染料或化学试剂的底物。
文档编号G01N33/15GK103038359SQ201180033543
公开日2013年4月10日 申请日期2011年6月3日 优先权日2010年6月4日
发明者J·D·奇里洛, J·C·萨凯帝尼, 饶江洪, 谢贺新 申请人:德克萨斯A&M大学体系, 利兰·斯坦福青年大学托管委员会