利用分子标记鉴定玉米互交种的方法

专利名称：利用分子标记鉴定玉米互交种的方法
技术领域：
本发明涉及一种互交种的鉴定方法，尤其是一种利用分子标记鉴定玉米互交种的方法。
背景技术：
玉米是我国乃至世界上重要的粮饲作物，在农业生产中具有重要地位。玉米能否正常生产关系着我国粮食生产安全。种子纯度是种子质量的重要指标之一，也是种子分级的主要依据。生产上造成玉米种子纯度降低的主要原因较多隔离条件不充分、母本去雄去杂不彻底以及收获时的机械混杂等[薛艳颖，陈兴奎，樊严，陈小丹.SSR分子标记 技术在杂交玉米种子纯度鉴定中的应用.杂粮作物，2007，27(1) : 6-7]。由此产生的种子混杂方式也多种多样,包括亲本自交种的混杂、其他品种的混杂及正交种、反交种的混杂等。传统品种纯度的检验方法主要依赖于品种的形态特征、生理特性及同工酶等指标。随着分子生物学的发展，分子标记技术越来越广泛的应用于品种纯度检测，国家和一些地方也相继出台了玉米品种纯度及真实性的分子标记检测方法，为玉米种子纯度的分子检测提供了标准。玉米互交种是由两个不同的玉米亲本自交系以相反的交配顺序得到的，正交与反交是相对的，指定一种交配顺序获得的杂交种为正交种，则相反的交配顺序获得的杂交种为反交种。一般的正、反交种的表现型没有差异，但是对于受细胞质基因控制的母性遗传性状，正交种与反交种会表现出显著差异。尽管受母本控制的部分性状可作为形态学标记对部分互交种进行鉴定，但是利用分子标记鉴定是从根本上实现互交种判定的可靠方法。现行的玉米品种纯度的分子标记检测标准不能对互交种的混杂进行区分，主要原因在于该检测标准是建立在不同玉米品种基因组成是有差异的基础之上的。由于互交种的基因均来自相同的亲本，因此，互交种含有相同的基因，基因组之间不存在质的差异。因此，如果从DNA水平上对互交种进行判定，只能从基因剂量的角度进行挖掘。玉米胚乳是一个精子和两个极核融合后发育形成的组织，基因组含有两个拷贝的母本基因及一个拷贝的父本基因，来自母本与父本的等位基因具有二倍剂量关系，可以此作为利用分子标记区分互交种的基础。Insertion/Deletion(InDel)标记作为一种有应用前景的遗传标记得到了研究者的关注[Dinakar B，Maureen D, Mike H，Robin ff, Dave V, James C R, Scott V T,Antoni R. Insertion-deletion polymorphisms in 3' regions of maize genes occurfrequently and can be used as highly informative genetic markers. Plant MolBiol, 2002，48: 539-547]。尽管玉米品种纯度鉴定主要利用SSR分子标记[李晓辉，李新海，李文华，王振华，马凤鸣，袁力行，张世煌.SSR标记技术在玉米杂交种种子纯度测定中的应用.作物学报，2003，29(1) : 63- 68;张华生，王凤格，赵久然，易红梅，李瑞媛，杨国航，王璐.利用形态性状和SSR标记进行玉米品种的特异性鉴定.玉米科学，2011，19(3) : 51- 55]，但InDel标记用于玉米品种纯度分析已有报道[张体付，葛敏，韦玉才，赵涵.玉米功能性Insertion/Deletion (InDel)分子标记的挖掘及其在杂交种纯度鉴定中的应用.玉米科学，2012，20(2): 64-68]。目前，InDel较多用于基因组多态性的评价[冯芳君，罗利军，李荧，周立国，徐小艳，吴金红，陈宏伟，陈亮，梅捍卫.水稻InDel和SSR标记多态性的比较分析.分子植物育种，2005，3(5): 725- 730;申璐，沈火林，柴敏，王银磊，杨文才.釆用InDel和SSR标记分析番茄品种基因组DNA多态性.中国农业大学学报，2011，16(2):34- 42]，未见用于互交种判定的研究。玉米基因组中存在大量的InDel多态，据估计每309bp就有一个InDel [VrohB I， McMullen M, Sanchez-Villeda H， Schroeder S， Gardiner J， Schaeffer M，Soderlund C，Wing R，Fang Z，Coe J E. Single nucleotide polymorphisms andinsertion-deletions for genetic markers and anchoring the maize fingerprintcontig physical map. Crop Sci, 2006，46: 12-21]。随着玉米基因组测序及重测序工作的完成，玉米InDel多态性标记得到了更快的发展[Schnable P S，Ware D, Fulton R S，Schnable P S，Ware D，Fulton R S，Stein J C，Wei F S，Pasternak S，Liang C Z，Zhang J W, Fulton L，Graves T A，Minx P，Reily A D，Courtney L，Kruchowski SS, Tomlinson C， Strong C， Delehaunty K， Fronick C， Courtney B， Rock S M， BelterE, Du Fj Kim K，Abbott R M，Cotton M，Levy A，Marchetto P，Ochoa K，Jackson SM, Gillam B，Chen W, Yan L，Higginbotham J，Cardenas M，Waligorski J，ApplebaumE, Phelps L, Falcone J，Kanchi K，Thane T，Scimone A，Thane N，Henke J，WangT, Ruppert J，Shah N，Rotter K，Hodges J，Ingenthron E，Cordes M，Kohlberg S，Sgro J，Delgado B，Mead K，Chinwalla A，Leonard S，Crouse K，Collura K，KudrnaD, Currie J，He R，Angelova A，Rajasekar S，Mueller T，Lomeli R，Scara G，KoA， Delaney K， Wissotski M， Lopez G， Campos D， Braidotti M， Ashley E， Golser W,Kim H, Lee S，Lin J，Dujmic Z，Kim W, Talag J，Zuccolo A，Fan C，Sebastian A，Kramer M，Spiegel L，Nascimento L，Zutavern T，Miller B，Ambroise C，Muller S，Spooner W, Narechania A，Ren L，Wei S，Kumari S，Faga B，Levy M J，McMahan L，Buren P V，Vaughn M W, Ying K，Yeh C，Emrich S J，Jia Y，Kalyanaraman A，HsiaA，Barbazuk W B，Baucom R S，Brutnell T P，Carpita N C，Chaparro C，Chia J，Deragon J，Estill J C，Fu Y，Jeddeloh J A，Han Y，Lee H，Li P，Lisch D R，LiuS, Liu Z, Nagel D H，McCann M C，SanMiguel P，Myers A M，Nettleton D，NguyenJ，Penning B W, Ponnala L，Schneider K L，Schwartz D C，Sharma A，Soderlund C，Springer N M，Sun Q，Wang H，Waterman M，Westerman R，Wolfgruber T K，Yang L，YuY, Zhang L，Zhou S，Zhu Q，Bennetzen J L，Dawe R K，Jiang J，Jiang N，Presting GG, Wessler S R，Aluru S，Martienssen R A，Clifton S W, McCombie W R，Wing R A，Wilson R K. The B73 maize genome: complexity, diversity, and dynamics. Science,2009，326: 1112-1115 ； Lai J S, Li R Q，Xu X，JinW W, Xu M M，Zhao H N，Xiang ZK, Song W B, Ying K，Zhang M，Jiao Y P，Ni P X，Zhang J G，Li D，Guo X S，Ye KX，Jian M, Wang B，Zheng H S，Liang H Q，Zhang X Q，Wang S C，Chen S J，Li J S，Fu Y, Springer N M，Yang H M，Wang J，Dai J R，Schnable P S，Wang J. Genome-widepatterns of genetic variation among elite maize inbred lines. Nat Genet, 2010，、42(11) : 1027-1030]。InDel标记多态是一种扩增片段长度多态，从几个碱基对到几十个碱基对甚至上百个碱基对不等。对于差异较大的InDel标记的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳即可分辨出长度差异。

发明内容
本发明的目的在于，针对目前现行的分子标记检测玉米品种纯度方法不能对玉米互交种进行鉴定的问题，提供一种利用InDel分子标记鉴定玉米互交种的方法。本发明的目的是这样实现的一种利用分子标记鉴定玉米互交种的方法，其特征在于 提取玉米待检互交种胚乳、叶片及其亲本叶片DNA，提取的DNA样本测定浓度并用琼脂糖凝胶检测质量；
根据待检互交种亲本全基因组序列及基因组二代测序序列存在的差异发展InDel标记，通过PCR扩增，筛选出亲本叶片DNA之间存在共显性差异的InDel标记；
以互交种叶片DNA为模板进行PCR扩增并对琼脂糖凝胶电泳条带进行图像识别以分析等位基因扩增质量，识别图像曲线圆滑、波峰波谷独立且互交种等位基因识别图像一致的共显性InDel标记被确定为鉴定互交种的分子标记。利用确定的共显性InDel标记对待检互交种胚乳及叶片DNA进行同一批次PCR扩增，PCR循环数应为处于指数扩增期且在琼脂糖凝胶上能够清晰表现扩增条带的PCR循环数；
对等位基因扩增产物的电泳条带进行定量分析，获得待检互交种叶片及胚乳DNA等位基因扩增产物相对量的实测值，通过XA’/Xa’=2In / 5;或xA’/xa’=o. 5 X, / 5;获得正交种或反交种胚乳等位基因扩增产物相对量的理论值(x；/x；分别为正交种或反交种胚乳等位基因扩增产物相对量的理论值, / I为同一批次互交种叶片等位基因扩增产物相对量实测值重复间的平均值)；
利用卡方测验对待检互交种胚乳等位基因扩增产物相对量的实测值与其理论值进行统计分析，计算概率八若实测值与正交种胚乳等位基因扩增产物相对量理论值的统计概率P>Q. 05且与反交种胚乳等位基因扩增产物相对量理论值的统计概率/7 ^0. 05,则判定为正交种，反之则为反交种。在本发明中，共显性InDel分子标记是这样获得的二代原始序列经过整理后，删除在另一亲本全基因组序列中对应多个位点的二代测序序列，再根据InDel差异发展标记，通过PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳，筛选亲本基因组间存在共显性差异的InDel标记。在本发明中，所述的待检互交种胚乳及叶片DNA进行同一批次PCR扩增是指利用相同的InDel标记对待检互交种胚乳及叶片DNA同时进行扩增，在PCR反应体系配制时采用统一混合然后分装的方法，即根据总反应量先混合除DNA模板以外的所有PCR组分形成PCR反应混合液，然后按照待检互交种胚乳及叶片DNA模板的样本量分装PCR反应混合液，在分装的混合液里加入相应的待检互交种胚乳或叶片DNA模板形成完整的PCR反应体系，将完整的PCR反应体系分装为若干重复即可在同一台PCR仪器上以相同的PCR程序进行扩增，这样可使同一标记在互交种叶片DNA及互交种胚乳DNA中等位基因扩增效率保持稳定，即可利用互交种叶片等位基因扩增产物相对量获得互交种胚乳等位基因扩增产物相对量的理论值。在本发明中，所述的PCR循环数应为处于指数扩增期且在琼脂糖凝胶上能够清晰表现扩增条带的PCR循环数是指对相应标记以不同的循环数进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳时随着循环数的增加扩增条带的亮度逐渐增强，则该PCR阶段处于指数扩增期，以该阶段在琼脂糖凝胶上能够清晰表现扩增条带的PCR循环数作为鉴定玉米互交种的PCR循环数。本发明的优点在于
本发明采用互交种胚乳DNA作为PCR反应模板，胚乳DNA等位基因剂量关系为严格的 二倍关系，不会因为加样的误差发生改变。本发明利用的InDel标记可以通过琼脂糖凝胶进行检测，相比于SSR标记的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测法操作简便，成本更低。本发明以PCR指数扩增期为鉴定时期，可确保PCR反应初始模板量与终产物量具有线性关系。本发明在PCR反应体系配制过程中采用统一混合然后分装的方法。这种操作可以最大程度的保证相同PCR条件下同一标记在互交种叶片DNA及互交种胚乳DNA中等位基因扩增效率保持稳定，使互交种胚乳等位基因扩增产物相对量理论值与互交种叶片等位基因扩增产物相对量实测值建立关系。本发明适应性广，可用于其它能够获得InDel标记的作物互交种鉴定。本发明的鉴定结果不受环境的影响，可以早期对互交种进行鉴定。


图I是本发明实施例中亲本间InDel标记的筛选(奇数泳道对应的亲本为Mol7，偶数泳道对应的亲本为B73)；
图2共显性标记在互交种叶片DNA中的扩增(波形图右上角的数字与琼脂糖凝胶电泳泳道相对应，显示了相应标记在等位基因间的扩增质量。波形图下面的数字为对应的标记编号)。图3共显性标记在不同PCR循环数下的琼脂糖凝胶电泳结果(M为IOObp DNAladder,泳道对应的数字为相应的PCR循环数)。图4标记81对互交种样本的鉴定(泳道1，2分别为标记81在亲本B73，Mol7中的扩增条带；波形图中的数字与泳道数字对应；左右两条波峰分别为来自B73，Mol7的等位基因扩增后ImageJ的识别图像)。
具体实施例方式本发明的实施例是利用玉米自交系B73、Mol7作为亲本及杂交的互交种为材料，本发明是基于对所述的互交种进行鉴定的。材料与方法
I.I材料
供试材料为玉米自交系B73、Mol7、正交种B73XMol7 (BM)及反交种Mol7XB73(MB)。提取B73、Mol7、BM、MB叶片DNA以及BM、MB胚乳(各5个样本)DNA提取按照Karroten植物基因组DNA提取试剂盒(南京塞吉科技有限公司)相关步骤操作，提取的DNA样本测定浓度并用0. 8%的琼脂糖凝胶检测质量。扩增及琼脂糖凝胶电 泳
PCR 反应体积为 25 u I，其中含 2 mmol I71 MgCl2, 100 u mo I I71 dNTP ,0.2 u mol I71引物，I U Taq酶，50 Ug模板DNA，上覆20 U L矿物油。反应在2720 Thermal cycler型DNA扩增仪上进行。热循环程序为94 °C 3 min ；94 V 40 s, 58 V 40 s, 72 V40 S，37个循环；72 V 5 min。扩增产物在2%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.5 Ug mF1 )上以80 V电压电泳45 min,紫外透射仪上观察结果并拍照。电泳条带的定量分析
电泳条带的定量分析由ImageJ公共图像处理软件完成。将要分析的电泳图片进行校正后，利用软件的长型框工具选定要分析的区域，软件以波形图的形式显示选定区域的影像强度，突出的波峰对应的区域即为目标条带区，通过直线工具将波形图的目标条带区与非条带区分开，选择该软件的魔术棒工具点击目标波形区即可通过计算该区域面积得出电泳条带的强度。分子标记的开发与筛选
本研究所用的分子标记为自主开发的Insertion/Deletion (InDel)标记。第二版B73全基因组序列从www. maizesequence. org网站上下载获得，Mol7 二代序列分别来自中国农业大学和美国JGI-D0E。Mol7 二代原始序列经过Q20标准过滤后用BWA软件处理并利用SAMtool对结果进行整理。在分析过程中删除了可在B73基因组上对应多个位点的Mol7二代原始序列。引物设计由emboss软件包中eprimer3完成。开发的InDel标记在B73、Mol7间进行比较，筛选出扩增条带清晰、无非特异性扩增的共显性标记用于后续分析。互交种胚乳等位基因相对定量原理
PCR反应方程为X=Xtl(1+Ex)n。其中，n为扩增反应的循环次数；X为第n次循环后的扩增产物A为初始模板量；Ex为扩增效率。当Ex=I时为理想的PCR扩增反应。在实际的操作中很难达到理想水平。假定玉米杂交种亲本中某一位点的一对等位基因分别为A、a，对于某一引物来说这对等位基因的PCR反应方程分别为Xa =Xao(I+Ea)\Xa =Xa0(l+Ea)no其中，XA、Xa分别为等位基因A、a第n次循环后的扩增产物量；XA(I、Xa0分别为等位基因A、a的初始模板量；Ea、Ea分别为等位基因A、a扩增效率。在PCR指数扩增期阶段，等位基因扩增产物的相对量与初始模板量具有线性关系。由于杂交种叶片中等位基因A、a的初始模板相对量Xaci :Xa(l=l，可由第n次循环后等位基因扩展产物相对量的实测值推测该引物在等位基因间的扩增效率的关系(1+￡4)7(1+￡〕1^4/\。若正交种胚乳基因型为44&，反交种胚乳基因型为aaA，则正交种胚乳等位基因的剂量关系为A a=2 (即胚乳初始模板相对量Xaci Xa0=2)，反交种胚乳等位基因的剂量关系A :a=0. 5 (即胚乳初始模板相对量Xaci :Xa(l=0. 5)。对于同一弓丨物相同批次的以杂交种叶片DNA及胚乳DNA为模板的PCR反应，由于反应条件一致，杂交种叶片及胚乳基因组等位基因的扩增效率关系能够最大限度地保持稳定。因此，第n次循环后杂交种胚乳等位基因扩增产物相对量理论值与杂交种叶片等位基因扩增产物相对量的实测值即可建立如下关系正交种等位基因扩增产物相对量理论值XA’/Xa’=2X,
八力叶片等位基因扩增产物相对量实测值Xa/^同一批次样品重复间的平均值)；反交种等位基因扩增产物相对量理论值XA’/Xa’=0. 5 m互交种等位基因扩增产物相对量理论
值与其实测值进行统计分析，若理论值与实测值无显著性差异，则判定为正交种或反交种。统计分析
利用卡方(X2)测验对互交种等位基因扩增产物相对量理论值与其实测值进行统计分析，计算概率凡若实测值与正交种等位基因扩增产物相对量理论值的统计/^>0. 05且与反交种等位基因扩增产物相对量理论值的统计/7 < 0. 05，则判定为正交种，反之则为反交种。二结果与分析
2.I InDel分子标记的开发与共显性标记的筛选 经过分析，B73、Mol7之间约11 400个长度小于IOObp的InDel位点(深度>3)可以进行标记开发。为了便于发展的标记进行琼脂糖凝胶检测，从中剔除了长度小于20bp的InDel,选取了部分长度大于20bp的InDel位点发展标记。对新发展的143对InDel标记通过琼脂糖凝胶电泳进行验证，其中118对引物可以清晰地揭示B73与Mo 17 DNA之间的多态，PCR扩增产物大小与预测大小完全吻合。根据B73基因组序列对新发展的标记进行分析，发现InDel长度多在20bp 80bp之间，PCR产物长度在141bp 361bp之间。从中选取8个B73、Mol7间特异扩增的共显性InDel标记(图1)，用于互交种BM及MB叶片基因组等位基因的扩增，验证标记在互交种叶片基因组等位基因的扩增质量(图2)。标记在等位基因间的扩增质量由ImageJ图像软件生成的波形图判定，扩增质量高的引物的波形图应具有两个特征1)波形图曲线圆滑且波峰波谷独立，便于准确确定扩增主带区间；2)互交种等位基因波形图一致，显示了标记在互交种等位基因间扩增的稳定性。图2中标记18的波峰波谷区分不明显，标记54的波形图出现了明显的锯齿状，曲线不够圆滑。因此，这两个标记会影响到定量的准确性。其余6个共显性标记扩增稳定，波形图符合定量要求，扩增产物长度介于117bp-301bp之间，InDel大小介于43bp_143bp之间(表I),用于后续分析。表I筛选的共显性InDel标记对应的引物信息
权利要求
1.一种利用分子标记鉴定玉米互交种的方法，包括，提取玉米待检互交种DNA，提取的DNA样本测定浓度并用琼脂糖凝胶检测质量；根据待检亲本全基因组序列及基因组二代测序序列存在的差异发展InDel标记，通过PCR扩增，筛选出亲本叶片DNA之间存在共显性差异的InDel标记，其特征在于 a、提取玉米待检互交种胚乳、叶片及其亲本叶片DNA，提取的DNA样本测定浓度并用琼脂糖凝胶检测质量； b、根据待检互交种亲本全基因组序列及基因组二代测序序列存在的差异发展InDel标记，通过PCR扩增，筛选出亲本叶片DNA之间存在共显性差异的InDel标记； C、以互交种叶片DNA为模板进行PCR扩增并对琼脂糖凝胶电泳条带进行图像识别以分析等位基因扩增质量，识别图像曲线圆滑、波峰波谷独立且互交种等位基因识别图像一致的共显性InDel标记被确定为鉴定互交种的分子标记； d、利用确定的共显性InDel标记对待检互交种胚乳及叶片DNA进行同一批次PCR扩增，PCR循环数应为处于指数扩增期且在琼脂糖凝胶上能够清晰表现扩增条带的PCR循环数； e、对等位基因扩增产物的电泳条带进行定量分析，获得待检互交种叶片及胚乳DNA等位基因扩增产物相对量的实测值，并由叶片DNA等位基因扩增产物相对量的实测值获得胚乳DNA等位基因扩增产物相对量的理论值，当XA’/Xa’=2X, / X时获得正交种胚乳等位基因扩增产物相对量的理论值，当XA’/Xa’=0. 5 Xh / X时获得反交种胚乳等位基因扩增产物相对量的理论值，式中 x；/x；分别为正交种或反交种胚乳等位基因扩增产物相对量的理论值； 1./5;为同一批次互交种叶片等位基因扩增产物相对量实测值重复间的平均值； f、利用卡方测验对待检互交种胚乳等位基因扩增产物相对量的实测值与其理论值进行统计分析，计算概率八若实测值与正交种胚乳等位基因扩增产物相对量理论值的统计概率产>0. 05且与反交种胚乳等位基因扩增产物相对量理论值的统计概率/7 < 0. 05，则判定为正交种，反之则为反交种。
2.根据权利要求I所述的利用分子标记鉴定玉米互交种的方法，共显性InDel分子标记是这样获得的二代原始序列经过整理后，删除在另一亲本全基因组序列中对应多个位点的二代测序序列，再根据InDel差异发展标记，通过PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳，筛选亲本基因组间存在共显性差异的InDel标记。
3.根据权利要求I所述的利用分子标记鉴定玉米互交种的方法，其特征在于，所述的待检互交种胚乳及叶片DNA进行同一批次PCR扩增是指利用相同的InDel标记对待检互交种胚乳及叶片DNA同时进行扩增，在PCR反应体系配制时采用统一混合然后分装的方法，即根据总反应量先混合除DNA模板以外的所有PCR组分形成PCR反应混合液，然后按照待检互交种胚乳及叶片DNA模板的样本量分装PCR反应混合液，在分装的混合液里加入相应的待检互交种胚乳或叶片DNA模板形成完整的PCR反应体系，将完整的PCR反应体系分装为若干重复即可在同一台PCR仪器上以相同的PCR程序进行扩增，这样可使同一标记在互交种叶片DNA及互交种胚乳DNA中等位基因扩增效率保持稳定，即可利用互交种叶片等位基因扩增产物相对量实测值获得互交种胚乳等位基因扩增产物相对量的理论值。
4.根据权利要求I所述的利用分子标记鉴定玉米互交种的方法，其特征在于，所述的PCR循环数应为处于指数扩增期且在琼脂糖凝胶上能够清晰表现扩增条带的PCR循环数是指对相应标记以不同的循环数进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳时随着循环数的增加扩增条带的亮度逐渐增强，则该PCR阶段处于指数扩增期，以该阶段在琼脂糖凝胶上能够清晰表现扩增条带的PCR循环数作为鉴定玉米互交种的PCR循环数。
全文摘要
本发明涉及一种利用分子标记鉴定玉米互交种的方法，其特征在于提取玉米待检互交种胚乳、叶片及亲本叶片DNA；根据亲本基因组序列差异发展InDel标记并筛选亲本间共显性标记；分析互交种叶片DNA等位基因扩增产物质量确定鉴定玉米互交种的分子标记；摸索标记的PCR指数扩增期及在琼脂糖凝胶上清晰表现扩增产物的循环数，对互交种胚乳及叶片DNA进行同一批次扩增；定量分析电泳条带获得互交种叶片及胚乳等位基因扩增产物相对量实测值；由互交种叶片等位基因扩增产物相对量实测值获得胚乳等位基因扩增产物相对量理论值；利用卡方测验对待检互交种胚乳等位基因扩增产物相对量实测值与理论值进行统计，计算概率P，对互交种进行判定。
文档编号C12Q1/68GK102747163SQ201210256500
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月24日 优先权日2012年7月24日
发明者张体付, 蒋璐, 赵涵 申请人:江苏省农业科学院