专利名称：嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶、其发酵制备方法及发酵培养基的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶、其发酵制备方法及发酵培养基。
背景技术：
家蚕作为ー种重要的经济动物与鳞翅目昆虫研究模型，具有生长快、繁殖周期短的特点。在幼虫期20多天时，家蚕除了自身肠道分泌的消化酶具有消化食物的能力之外，肠道中种类繁多、数量巨大的微生物群体也对其食物的消化和营养的吸收起重要作用。同吋，由于长期家庭饲养的结果，家蚕防病能力极其脆弱；肠道内有益菌群的存在，能够有效地帮助家蚕抵制内源性细菌病害的侵袭。因此，肠道里的微生物对家蚕具有重要意义。国内研究者曾采用传统的培养手段初步调查了家蚕肠道微生物种类。已经发现的家蚕肠道主要菌群有肠球菌、葡萄球菌、阴沟肠杆菌和腊样芽孢杆菌。张剑飞等的研究发现了丰富的细菌种类和动态变化，其中微球菌和芽孢杆菌占优势。从这些研究中可以看出，虽然人们对家蚕肠道细菌有一定的认识，但可能是由于蚕种质资源及其肠道细菌的多祥性或者研究手段的差异，目前尚没有较为一致的意见。目前关于嗜麦寡养食单孢菌(Stenotrophomnas maltophilia)的报道多集中于其临床分布特点及其耐药性的研究，并且大多数学者认为该菌为非发酵菌。嗜麦寡养食单孢菌为革兰氏阴性菌，广泛存在于自然界中，也可寄居于人或动物的呼吸道和肠道。2003年杨丽等首次从环节动物双齿围沙蚕的消化道中发现了该菌，但对该菌发酵产蛋白酶的条件以及所产酶的酶学性质的研究还未见报道。
发明内容
本发明在不同发酵条件下对嗜麦寡养食单孢菌进行培养，将得到的含蛋白酶粗提取液用硫酸铵进行盐析，得到的固体溶于稀盐中，控制不同酶促反应条件，研究酶学性质，在微生态制剂的研究方面有一定的实际意义。本发明的目的在于公开了嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶。本发明的第二个目的在于公开了嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶的发酵制备方法。本发明的第三个目的在于公开了嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶的发酵培养基。本发明的目的是通过以下技术方案实现的嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶，所述嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶通过下述方法制备所得(I)、以嗜麦寡养食单孢菌为菌种，在液体发酵培养基中进行发酵，35°C下培养36h ;其中发酵培养基中各物质的质量体积分数为玉米粉I. 0% (即IOOml水溶液中含有玉米粉的量为I. Og)、黄豆粉1.0%、MgSO4 0.04%, NaCl I. 5%和K2HPO4 0.1%，发酵培养基的PH值为7. 0，发酵培养基的装液量60% ；(2)、将步骤(I)中培养36h的的发酵液4°C下4000r/min高速冷冻离心IOmin,取上清液，在上清液中缓慢地加入固体硫酸铵至80%饱和度，4°C下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷冻离心，取沉淀加入去离子水稀释即为含蛋白酶的酶液。上述技术方案中所述的嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶，其中，所述嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶的酶促反应温度为45°C -55°C ;酶促反应pH值为9. O。上述技术方案中所述的嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶，其中，所述嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶的酶促反应温度为50°C。上述技术方案中任一技术方案所述的嗜麦寡养食单胞菌蛋白酶，其中，嗜麦寡养食单孢菌在液体发酵培养基中进行发酵步骤之前还包括将嗜麦寡养食单孢菌接种于富集培养基中摇床培养6h的富集培养步骤，所述富集培养基的制备方法为称取胰化蛋白胨lg，酵母提取物O. 5g，NaCl lg，溶解并定容于IOOmL容量瓶中，高压灭菌。 嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶的发酵制备方法，所述制备方法包括下述步骤(I)、以嗜麦寡养食单孢菌为菌种，在液体发酵培养基中进行发酵，35 °C下培养36h ;其中发酵培养基中各物质的质量体积分数为玉米粉I. 0%，黄豆粉I. 0%，MgS04
O.04%, NaCl I. 5%, K2HPO4 O. I%，发酵培养基的pH值为7. O，发酵培养基的装液量60% ;(2)、将步骤(I)中培养36h的的发酵液4°C下4000r/min高速冷冻离心IOmin,取上清液，在上清液中缓慢地加入固体硫酸铵至80%饱和度，4°C下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷冻离心，取沉淀加入去离子水稀释即为含蛋白酶的酶液。嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶的发酵制备方法，所述发酵制备方法包括下述步骤(I)、将嗜麦寡养食单孢菌接种于富集培养基中摇床培养6h的富集培养步骤，所述集培养基的制备方法为称取胰化蛋白胨lg，酵母提取物O. 5g, NaCl lg,溶解并定容于IOOmL容量瓶中，高压灭菌；(2)、以富集培养的嗜麦寡养食单孢菌为菌种，在液体发酵培养基中进行发酵，35 0C下培养36h;其中发酵培养基中各物质的质量体积分数为玉米粉1.0%，黄豆粉1.0%, MgSO4O. 04%, NaCl I. 5%, K2HPO4 O. I %，发酵培养基的pH值为7. O，发酵培养基的装液量60% ；(3)、将步骤(2)中培养36h的的发酵液4°C下4000r/min高速冷冻离心lOmin，取上清液，在上清液中缓慢地加入固体硫酸铵至80%饱和度，4°C下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷冻离心，取沉淀加入去离子水稀释即为含蛋白酶的酶液。嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶的发酵培养基，其中，所述发酵培养基中各物质的质量体积分数为玉米粉1.0%，黄豆粉1.0%，MgSO4 O. 04%, NaCl I. 5%, K2HPO4 0.1%，发酵培养基的pH值为7.0。本发明具有以下有益效果I、本发明在从家蚕肠道分离出嗜麦寡养食单孢菌的基础上，进ー步公开了嗜麦寡养食单孢菌的发酵培养条件及其所产蛋白酶的酶学性质。2、本发明在优化了难以发酵产酶的的嗜麦寡养食单孢菌的发酵条件，获得了其最佳发酵參数，为其发酵エ业应用提供了基本參数。3、本发明所获得的嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶具有较强的降解动物源蛋白质能力，特别是在降解动物毛发方面具有较强的应用潜力。
I、图I为培养温度对嗜麦寡养食单孢菌产蛋白酶的影响；2、图2为培养时间对嗜麦寡养食单孢菌产蛋白酶的影响；3、图3为pH值对嗜麦寡养食单孢菌产蛋白酶的影响；4、图4为温度对蛋白酶活力的影响；5、图5为pH值对蛋白酶活力的影响；6、图6为蛋白酶的热稳定性；7、图7为蛋白酶的pH稳定性。
具体实施例方式为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明作进ー步的说明，本发明实施例和试验例所采用的材料和方法如下一、材料和方法I、材料与试剂分离自5龄家蚕肠道内容物的嗜麦寡养食单胞菌株，由安徽农业大学生命科学学院生理学教研室提供，也可从市场购买；福林-酚试剂，酪蛋白，三氯こ酸，碳酸钠，Imol/LNaOH溶液，pH7. 4磷酸缓冲液。2、主要仪器分光光度计722S，台式电子天平，可调恒温水浴锅HH-2，高速冷冻离心机，精密pH计，高温蒸汽灭菌锅，恒温摇床，IOOOul微量移液器。3、培养基的制备(I)、富集培养基称取胰化蛋白胨lg，酵母提取物O. 5g，NaCl lg，溶解并定容于IOOmL容量瓶中，高压灭菌，即得富集培养基。(2)、发酵培养基称取玉米粉1.08，黄豆粉1.(^，1%304 0 . 048，恥(1 I. 5g, K2HPO4
O.lg，置于IOOml锥形瓶中混合加水至IOOml煮沸，冷却后，高压灭菌，即得发酵培养基。4、1%酪蛋白溶液的配制；称取O. 25g酪蛋白置于小烧杯中，用少量Imol/LNaOH溶液慢慢溶解酪素，加适量磷酸缓冲液(0.2mol/L NaH2PO4 39mL+0. 2mol/LNa2HP04 61mL。)，于容量瓶中定容至 25mL。放于4°C冰箱中冷藏保存(有效期3d)。5、酶活力的測定取发酵培养液，4000r/m离心lOmin，反应时取上清液1ml，I %酪蛋白溶液1ml，恒温水浴15min,加2ml三氯こ酸终止反应,过滤反应液,取滤液依次加5ml Na2C03> Iml倍比稀释(加水按照I : I比例稀释)的福林酚试剂，显色IOmin ;对照组先加2ml三氯こ酸，恒温水浴15min，再加酪蛋白，过滤，其余步骤同反应组。酶活力単位定义在一定温度和pH条件下，一定时间内从酪蛋白中降解释放I μ mo I酪氨酸所需要酶量为I个酶活力单位(U)。实施例I :嗜麦寡养食单胞菌所产蛋白酶的制备:(I)、以嗜麦寡养食单孢菌为菌种，在液体发酵培养基中进行发酵，35 °C下培养36h ;其中发酵培养基中各物质的质量体积分数为玉米粉1.0%，黄豆粉1.0%，MgSO4O.04%, NaCl I. 5%, K2HPO4 O. I%，发酵培养基的pH值为7. O，发酵培养基的装液量60% ;(2)、将步骤(I)中培养36h的的发酵液4°C下4000r/min高速冷冻离心IOmin,取上清液，在上清液中缓慢地加入固体硫酸铵至80%饱和度，4°C下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷冻离心，取沉淀加入去离子水稀释即为含蛋白酶的酶液。本实施例的參数通过以下方法得到一、培养条件的优化选取L9(34)正交设计表，以发酵上清液蛋白酶活力值为考察指标，以培养温度(A)、培养时间(B)、pH值(C)、装液量(D)为实验因素，每个因素设计3个实验水平，因素水平设计如表I。表I L9 (34)正交实验设计表
水平[A(°C ) F B(h) Γ C T D(ml)
13536 7 60
24248 8 80
3Γ 50 ] 60 I 9 [ 100实验结果如表2所示表2 L9 (34)正交实验结果
_ 处理 _ABCD酶活/U
1I11175.108
2I222 35.914
3I33.322.420
42123 39.911
52231 69.014
62312 23.548
73132 24.785
83213 18.968
93321 38.943 Til133.442139.804117.624 183.065
Ti2132.473123.896114.768 84.247Til82.69684.911116.219 81.299Xil44.48146.60139.208 61.022Xa44.15841.29938.256 28.082_ Xa __27.565 _28.304_ 38.740 _ 27.100 __由表2可以看出装液量对菌的产酶量的影响最大，其次为培养时间和温度，pH值的影响较小，最优培养条件为A1B1C1D1,即培养温度35°C、培养时间36h、pH7. O和装液量60mL。再分别设计了培养温度、培养时间、pH值三个单因素条件来研究该菌的最适产酶条件的稳定性。ニ、对培养条件的稳定性进行验证按照本技术领域的一般方法，产酶量大、酶活力高，产酶量小、则酶活力低，产酶量与酶活力成正比，所以产酶量的大小是通过酶活力高低的測定来确定，以下各条件对产酶的影响均通过酶活力的高低来说明。(I)、培养温度对菌产酶的影响将发酵培养基pH均调至7. 0，装液量60mL，在30°C、35°C、40°C、45°C下分别摇床培养36h，测定上清液酶活力，结果如图I所示图I显示，随着温度的升高，酶活力先上升再下降，当培养温度为35°C时酶活力最强，超过或低于35°C都不利于产酶，因此实验中均将培养温度设为35°C，以保证嗜麦寡养食单孢菌处于最佳的产酶状态。
(2)、培养时间对菌产酶的影响将发酵培养基的pH调至7. 0，培养温度设为35°C，装液量60mL，分别摇床培养24h、36h、48h、60h，測定上清液酶活力，结果如图2。图2显示，随着培养时间的増加，酶活力变化曲线呈现出钟形曲线，在36h是酶活最大，因此实验中均将培养时间设为36h。(3)、pH值对菌产酶的影响将菌摇床培养36h，培养温度为30°C，装液量60mL，在pH6. 0,7. 0,8. 0,9. 0,10. O的条件下分别培养，测定上清液酶活力，结果如图3所示。图3显示，pH为7时酶活力最大，过酸或过碱都不利于菌的产酶，因此要控制发酵培养基的PH为7。三、最适发酵培养基I、不同碳、氮源对产酶的影响(I)、配置发酵培养基吋，只改变所加碳源的种类，分别为蔗糖，淀粉，葡萄糖，玉米粉，而控制其他成分均不变，接种后摇床培养，研究不同碳源条件对嗜麦寡养食单孢菌产酶的影响，结果如表3所示；(2)、配置发酵培养基吋，只改变所加氮源的种类，分别为牛肉膏，蛋白胨，玉米粉，黄豆粉，而控制其他成分均不变，接种后摇床培养，研究不同氮源条件对嗜麦寡养食单孢菌产酶的影响，结果如表3所示；2、不同碳、氮源配比对产酶的影响配置发酵培养基取三只锥形瓶，分别编号为I，2，3 ;控制其它成分不变，在I号锥形瓶中加入O. 5g碳源，I. 5g氮源；2号锥形瓶中加入O. Ig碳源,0. Ig氮源；3号锥形瓶中加入O. 15g碳源，O. 5g氮源；接种后摇床培养，分别测定各个条件下的酶活，得出最适碳、氮比，结果如表3所不；3、金属离子对产酶的影响在发酵培养基中分别加入不同的金属离子(Cu2+、Mg2+、K+、Ca2+等)，对照组加等量的去离子水。分别测酶活，通过与对照组的比较，判断各金属离子对产酶的影响，结果如表3所示。表3 单因素作为培养基成分对菌株产蛋白酶能力的影响
权利要求
1.嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶，所述嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶通过下述方法制备所得 (1)、以嗜麦寡养食单孢菌为菌种，在液体发酵培养基中进行发酵，35°C下培养36h;其中发酵培养基中各物质的质量体积分数为玉米粉I. 0%、黄豆粉I. OMgSO4 0. 04%,NaClI. 5%和K2HPO4 0. I %，发酵培养基的pH值为7.0，发酵培养基的装液量60% ； (2)、将步骤(I)中培养36h的发酵液4°C下4000r/min高速冷冻离心IOmin,取上清液，在上清液中缓慢地加入固体硫酸铵至80%饱和度，4°C下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷冻离心，取沉淀加入去离子水稀释即为含蛋白酶的酶液。
2.根据权利要求I所述的嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶，其特征在于所述嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶的酶促反应温度为45°C -55°C ;酶促反应pH值为9. O。
3.根据权利要求2所述的嗜麦寡养食单胞菌蛋白酶，其特征在于所述嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶的最适酶促反应温度为50°C。
4.根据权利要求1-3中任ー权利要求所述的嗜麦寡养食单胞菌蛋白酶，其特征在干，嗜麦寡养食单孢菌在液体发酵培养基中进行发酵步骤之前还包括将嗜麦寡养食单孢菌接种于富集培养基中摇床培养6h的富集培养步骤，所述富集培养基的制备方法为称取胰化蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g，NaCl lg，溶解并定容于IOOmL容量瓶中，高压灭菌。
5.嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶的发酵制备方法，所述发酵制备方法包括下述步骤 (1)、以嗜麦寡养食单孢菌为菌种，在液体发酵培养基中进行发酵，35°C下培养36h;其中发酵培养基中各物质的质量体积分数为玉米粉I. 0%，黄豆粉I. 0%,MgSO4 0. 04%,NaClI.5%, K2HPO4 0. I%，发酵培养基的pH值为7.0，发酵培养基的装液量60% ； (2)、将步骤(I)中培养36h的的发酵液4°C下4000r/min高速冷冻离心IOmin,取上清液，在上清液中缓慢地加入固体硫酸铵至80%饱和度，4°C下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷冻离心，取沉淀加入去离子水稀释即为含蛋白酶的酶液。
6.嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶的发酵制备方法，所述发酵制备方法包括下述步骤 (1)、将嗜麦寡养食单孢菌接种于富集培养机中摇床培养6h的富集培养步骤，所述集培养基的制备方法为称取胰化蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g,NaCl lg,溶解并定容于IOOmL容量瓶中，高压灭菌； (2)、以富集培养的嗜麦寡养食单孢菌为菌种，在液体发酵培养基中进行发酵，35°C下培养36h;其中发酵培养基中各物质的质量体积分数为玉米粉1.0%，黄豆粉1.0%，MgSO4O. 04%, NaCl 1.5%, K2HPO4 0. I%，发酵培养基的pH值为7. 0，发酵培养基的装液量60% ； (3)、将步骤(2)中培养36h的的发酵液4°C下4000r/min高速冷冻离心lOmin，取上清液，在上清液中缓慢地加入固体硫酸铵至80%饱和度，4°C下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷冻离心，取沉淀加入去离子水稀释即为含蛋白酶的酶液。
7.嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶的发酵培养基，其特征在于所述发酵培养基中各物质的质量体积分数为玉米粉1.0%，黄豆粉1.0%，MgSO4 0. 04%, NaCl I. 5%, K2HPO4 0.1%，发酵培养基的pH值为7.0。
全文摘要
本发明嗜麦寡养食单孢菌蛋白酶、其发酵制备方法及发酵培养基，属于生物技术领域。所述蛋白酶通过下述方法制备所得(1)以嗜麦寡养食单孢菌为菌种，在含有玉米粉、黄豆粉、MgSO4、NaCl和K2HPO4的液体发酵培养基中进行发酵；(2)将步骤(1)中培养36h的发酵液高速冷冻离心10min，取上清液，在上清液中缓慢地加入固体硫酸铵至80％饱和度，4℃下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷冻离心，取沉淀加入少量去离子水稀释即为含蛋白酶的粗酶液。本发明具有优化了难以发酵产酶的嗜麦寡养食单孢菌的发酵条件，为其发酵工业应用提供了基本参数的优点。
文档编号C12N9/52GK102864133SQ201210310200
公开日2013年1月9日 申请日期2012年8月25日 优先权日2012年8月25日
发明者王在贵, 李阿敏, 刘朝良, 刘金阳, 李大辉, 刘华霞, 曹双凤 申请人:安徽农业大学