专利名称：一种格特隐球菌及其分离培养方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种格特隐球菌(Cryptococcus gattii)及其分离培养方法与应用。
背景技术：
格特隐球菌(Cryptococcus gattii)是一种带有荚膜的担子菌酵母,该菌主要分布于热带、亚热带地区，常感染免疫正常人群。分子分型表明，其由VGI-VGIV 4种主要基因型构成。其中，VGII基因型曾在加拿大温哥华岛引起隐球菌脑膜炎的暴发流行。而我国则以新生隐球菌为隐球菌脑膜炎的主要致病菌。随着系统进化研究的深入，新生隐球菌格特变种现已上升至种的水平，命名为格 特隐球菌(Kwon-Chung KJ, Boekhout T,Fell, Jff,Diaz M. Proposal to conserve the nameCryptococcus gattii against C. hondurianus and C. basillisporus(Basidiomycota, Hymenomycetes, Tremellomycetidae). Taxon, 2002, 51(4):804-806.)。目前，我国仍缺少格特隐球菌流行病学、毒力和诊治方面的研究。
发明内容
本发明的目的在于分离培养纯化一株格特隐球菌(Cryptococcus gattii) S8012菌株，并提供其分离培养纯化方法，以及该菌株在筛选抗真菌药物中的应用。在本发明的菌株S8012发现以前，我国没有分离纯化的格特隐球菌。本发明提供了一株格特隐球菌(Cryptococcus gattii),已于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 6018，保藏中心建立分类命名为新型隐球酵母格特变种(Cyptococcus neoformans var. gattii)。S8012菌株由长征医院皮肤科首次从一名43岁男性隐球菌脑膜炎患者的脑脊液中分离得到，其表型与中国常见的导致隐球菌脑膜炎的新生隐球菌有很大区别。通过M13单引物PCR扩增指纹分析和ITS、IGSl、RPBl、RPB2、LACl和TEFl多位点分析显示该菌为格特隐球菌VGI型，与澳大利亚桉树中分离的格特隐球菌同源。在20世纪初，中国上海、浙江、广东、广西、江西和云南省份曾从澳大利亚引进过赤桉(Eucalyptus camaldulensis),这说明格特隐球菌可能是随着桉树的引进而进入我国。本发明的格特隐球菌S8012,属担子菌门(Basidiomycota),银耳纲(Tremellomycetes),银耳目(Tremellales),银耳科(Tremellaceae)线黑粉菌属(Filobasidiella)0I.形态特征脑脊液墨汁染色可见带宽阔荚膜的棒形、针形、梭形及瓢形等菌体形态。2.培养特征沙氏培养基上30°C培养，次日开始生长，菌落为乳白色，光滑微湿润，边缘整齐，中央微高，随培养时间延长由菌落由乳白色转为桔黄色。马铃薯琼脂及米粉吐温80琼脂培养基培养无子囊孢子，无菌丝。咖啡酸培养基上菌落呈黑色。该菌可使刀豆氨酸甘氨酸溴麝香草酚蓝琼脂培养基(CGB)培养基变蓝。CGB培养基制备甲液(甘氨酸10g, KH2PO4Ig, MgSO4Ig, thiamine HCl lmg, L-canavanin sulphate 30mg, H2O 100ml,溶解各成分，pH 5· 6，O. 22 μ m滤膜除菌)和乙液(溴百里酌·蓝O. 4g,0. 01mol/L NaOH 64ml, H2O36ml)。H2O 880ml，乙液20ml，琼脂20g，121 °C高压灭菌15min,冷却到48°C后加甲液IOOml，充分混合，制成平板或斜面。3.碳源利用糖发酵不产生C02。可同化葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、山梨糖。尿素试验阳性。本发明的菌株经ITSl、5. 8S rDNA和ITS2区扩增测序方法
采用真菌通用引物上游引物ITS5 :5’ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’ (如 SEQ ID NO: I 所示);下游引物ITS4 :5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ (如 SEQ ID NO:2 所示)。以基因组扩增，PCR反应体系 50 μ L 10XPCR buffer 5 μ L，2. 5mmol/LdNTP 混合物 8 μ L，IOumoI/L 引物各 Iul，模板 2ul，Taq 酶 O. 5ul，无菌水 32. 5 μ L。PCR 扩增条件94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，55°C退火30秒，70°C延伸2分钟，30个循环；72°C保存10分钟。所得扩增产物由ABI 3730 DNA自动测序仪双向测序两次。测序结果如SEQ ID NO:3所不。将测序结果于NCBI网站进行序列比对(http: //blast, ncbi. nlm. nih. Rov/Blast.cgi)0同格特隐球菌CBS 11511比同源性99%。 所述PCR扩增指纹分析法M13 引物5’ -GAGGGTGGCGGTTCT-3’(如 SEQ ID N0:4 所示)，PCR 反应体系 50 μ L :10 X PCR buffer 5 μ L，2. 5mmol/L dNTP 混合物 8 μ L，IOumoI/L引物2ul，模板2ul，Taq酶0. 5ul，无菌水32. 5 μ L。PCR扩增条件94°C预变性5分钟，94°C变性20秒，50°C退火I分钟，70°C延伸20秒，35个循环后，72°C延伸6分钟。产物在I. 4%琼脂糖凝胶电泳3V/cm电泳7h，与格特隐球菌和新生隐球菌标准菌株进行电泳比对(如图2所示)。所述多位点比对技术应用MEGA 3. I软件对格特隐球菌ITS, IGS1, RPBI, RPB2, LACl和TEFl基因进行系统进化分析。随着系统进化研究的深入，新生隐球菌格特变种现已上升至种的水平，命名为格特隐球菌。本发明还提供了所述的格特隐球菌的分离培养纯化方法，该方法包括30°C接种于沙氏琼脂培养基平板和YEH)琼脂培养基，第2天生长，得到格特隐球菌菌落。菌种在30°C条件下于沙氏液体培养基和YEH)液体培养基30°C条件下进行振荡培养用于增菌。该方法还包括培养和保存步骤从-70°C冰箱中取出保存管，立即放置于37°C水浴中并适当摇动30s，打开冻存管，取I接种环菌液接入新鲜沙氏斜面培养基上。保存时将菌液涂布平板，48小时后放入4°C冰箱短期保存或放入含有25%甘油的YEH)液体培养基中_70°C冻存。
所述的沙氏斜面培养基的组分和重量百分比如下葡萄糖4%、蛋白胨1%、琼脂I. 5%，每IOOOml加200mg氯霉素，121。。10分钟灭菌后备用。所述的酵母浸出膏蛋白胨(YEPD)液体培养基的组分和重量百分比如下1%酵母浸出膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。 本发明还提供了该菌株在筛选抗真菌药物中的应用。所述的抗真菌药物具体为抗脑膜炎药物。参照M27-A3方法(Clinical Laboratoryand Standards Institute.Reference Method for Broth Dilution AntifungalSusceptibility Testing of Yeasts. Approved standard M27-A3. Wayne, PA:NationalCommittee for Clinical Laboratory Standards，2008.)，该格特隐球菌对两性霉素 b、氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的药物敏感性进行测定。其MIC值分别为0. 25、1、4、0. 25和0. 063μ g/mL。本发明的菌株可用于筛选新的抗真菌药物。本发明的格特隐球菌S8012的发现对揭示该菌在我国的流行发生和致病能力有 重大意义。
图I是本发明的格特隐球菌的脑脊液墨汁染色普通显微镜图。图2是本发明的格特隐球菌和新生隐球菌标准菌株的电泳比对图谱。微生物保藏信息格特隐球菌(Cryptococcus gattii) S8012,保藏中心建议分类命名新型隐球酵母格特变种(Cryptococcus neoformans var. gattii),已于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(061 0，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 6018。
具体实施例方式现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。实施例I :格特隐球菌(Cryptococcus gattii) S8012即新型隐球酵母格特变种(Cryptococcusneoformans var. gattii)菌株CGMCC No. 6018,属担子菌门(Basidiomycota),银耳纲(Tremellomycetes),银耳目(Tremellales),银耳科(Tremellaceae)线黑粉菌属(Filobasidiella)。本发明的菌株由上海长征医院皮肤科于隐球菌脑膜炎患者脑脊液中分离和检测鉴定。于2012年4月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏登记号为 CGMCCN0. 6018。I.形态特征脑脊液墨汁染色可见带宽阔荚膜的棒形、针形、梭形及瓢形等菌体形态。如图I所
/Jn ο2.培养特征沙氏培养基上30°C培养，次日开始生长，菌落为乳白色，光滑微湿润，边缘整齐，中央微高，随培养时间延长由菌落由乳白色转为桔黄色。马铃薯琼脂及米粉吐温80琼脂培养基培养无子囊孢子，无菌丝。咖啡酸培养基上菌落呈黑色。该菌可使刀豆氨酸甘氨酸溴麝香草酚蓝琼脂培养基(CGB)培养基变蓝。CGB培养基制备甲液(甘氨酸IOg, KH2PO4Ig, MgSO4Ig, thiamine HCl lmg, L-canavanin sulphate 30mg, H2O 100ml,溶解各成分，pH 5· 6，0· 22 μ m滤膜除菌)和乙液(溴百里酌·蓝0. 4g,0. Olmol/L NaOH 64ml, H2O36ml)。H2O 880ml，乙液20ml，琼脂20g，121 °C高压灭菌15min,冷却到48°C后加甲液IOOml，充分混合，制成平板或斜面。3.碳源利用试验方法参见工具书廖万清等主编《真菌病学》，人民卫生出版社，1989年。糖发酵不产生C02。可同化葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、山梨糖。尿素试验阳性。4.菌株的分离培养及保存技术本发明设计的格特隐球菌的菌种分离纯化技术包括隐球菌脑膜炎患者脑脊液接种于沙氏琼脂培养基平板(30°c)和YEro琼脂培养基，第2天生长，得到格特隐球菌菌落。菌种在30°c条件下于沙氏液体培养基和YEro液体培养基30°C条件下进行振荡培养用于增菌。 所述格特隐球菌的斜面培养和保存技术包括从-70°C冰箱中取出保存管，立即放置于37°C水浴中并适当摇动30s，打开冻存管，取I接种环菌液接入新鲜沙氏斜面培养基上。培养基配方葡萄糖4%、蛋白胨1%、琼脂I. 5%，每IOOOml加200mg氯霉素，121°C 10分钟灭菌后备用。保存时将菌液涂布平板，48小时后放入4°C冰箱短期保存或放入含有25%甘油的YEro液体培养基中-70°c冻存。YEro液体培养基配方ι%酵母浸出膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。5.真菌鉴定技术所述格特隐球菌ITS1、5. 8S rDNA和ITS2区扩增测序方法采用真菌通用引物上游引物ITS5 :5’ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’ (如 SEQ ID NO: I 所示);下游引物ITS4 :5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ (如 SEQ ID NO:2 所示)。以基因组扩增，PCR反应体系 50 μ L 10XPCR buffer 5 μ L，2. 5mmol/LdNTP 混合物8yL，10umol/L引物各lul，模板2ul，Taq酶O. 5ul，无菌水32. 5 μ L。PCR扩增条件:94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，55°C退火30秒，70°C延伸2分钟，30个循环；72°C保存10分钟。所得扩增产物由ABI 3730 DNA自动测序仪双向测序两次。测序结果测序结果aaggatcagt agagaatgct gggcttcggtccatttatct acccatctac acctgtgaac tgtttatgtgcttcggcacg ttttacacaa acttctaaat gtaatgaatgtaatcttatt ataacaataa taaaactttcaacaacggat ctcttggctt ccacatcgat gaagaacgcagcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcagaattcagtga atcatcgagt ctttgaacgc aacttgcgccctttggtatt ccgaagggca tgcctgtttgagagtcatga aaatctcaat ccctcgggtt ttattacctg ttggacttggatttgggtgt ttgccgcgacctgcaaagga cgtcggctcg ccttaaatgt gttagtggga aggtgattacctgtcagccc ggcgtaataagtttcgctgg gcctatgggg tagtcttcgg cttgctgata acaaccatct cttttttgtttgacctcaaatcaggtaggg ctacccgctg aacttaa(如 SEQ ID N0:3 所示) 将测序结果于 NCBI 网站进行序列比对(http://blast, ncbi. nlm. nih. Rov/Blast. crDo 牛寺β急5求胃 CBS 11511 比同源性99%。所述PCR扩增指纹分析法M13 引物5’ -GAGGGTGGCGGTTCT-3’(如 SEQ ID N0:4 所示)，PCR 反应体系 50 μ L :10 X PCR buffer 5 μ L，2. 5mmol/L dNTP 混合物 8 μ L，IOumoI/L引物2ul，模板2ul，Taq酶O. 5ul，无菌水32. 5 μ L。PCR扩增条件94°C预变性5分钟，94°C变性20秒，50°C退火I分钟，70°C延伸20秒，35个循环后，72°C延伸6分钟。产物在I. 4%琼脂糖凝胶电泳3V/cm电泳7h，与格特隐球菌和新生隐球菌标准菌株进行电泳比对，如图2所示。所述多位点比对技术应用MEGA 3. I软件对格特隐球菌ITS, IGS1, RPBI, RPB2, LAC l和TEFl基因进行系统进化分析。随着系统进化研究的深入，新生隐球菌格特变种现已上升至种的水平，命名为格特隐球菌。实施例2 :真菌药敏实验参照M27-A3 方法(Clinical Laboratory and Standards Institute. ReferenceMethod for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts.Approved standard M27—A3. Wayne，PA:National Committee for Clinical LaboratoryStandards, 2008.)，该格特隐球菌对两性霉素b、氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的药物敏感性进行测定。其MIC值分别为0. 25、1、4、0. 25和0. 063 μ g/mL。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
权利要求
1.一株格特隐球菌(Cryptococcus gattii),保藏编号为 CGMCC No. 6018。
2.根据权利要求I所述的格特隐球菌的分离培养纯化方法，其特征在于，该方法包括 30°C接种于沙氏琼脂培养基平板和酵母浸出膏蛋白胨琼脂培养基，第2天生长，得到格特隐球菌菌落。
3.根据权利要求I或2所述的格特隐球菌的分离培养纯化方法，其特征在于，该方法包括培养和保存步骤如下从-70°C冰箱中取出保存管，立即放置于37°C水浴中并适当摇动30s，打开冻存管，取I接种环菌液接入沙氏斜面培养基上。保存时将菌液涂布平板，48小时后放入4°C冰箱短期保存或放入含有25%甘油的酵母浸出膏蛋白胨液体培养基中-70°C冻存； 所述的沙氏斜面培养基的组分和重量百分比如下葡萄糖4%、蛋白胨1%、琼脂I. 5%，每IOOOml加200mg氯霉素，121 °C 10分钟灭菌后备用； 所述的酵母浸出膏蛋白胨液体培养基的组分和重量百分比如下1%酵母浸出膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖。
4.一种如权利要求I所述的格特隐球菌在筛选抗真菌药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的格特隐球菌在筛选抗真菌药物中的应用，其特征在于所述的抗真菌药物为抗脑膜炎药物。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种格特隐球菌(Cryptococcus gattii)及其分离培养方法与应用。本发明的目的在于分离培养纯化一株格特隐球菌，本发明提供了一株格特隐球菌(Cryptococcus gattii)，已于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏编号为CGMCC No.6018。本发明对该菌株的形态特征、培养特征、碳源利用作了进一步研究。本发明还提供了该菌株的分离培养纯化方法，以及在筛选抗真菌药物中的应用。
文档编号C12R1/645GK102876585SQ20121035185
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者廖万清 申请人:中国人民解放军第二军医大学