专利名称：一种克鲁维毕赤酵母克鲁维变种菌株及其培养方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种克鲁维毕赤酵母克鲁维变种菌株及其培养方法与应用，特别涉及一种产香的克鲁维毕赤氏酵母克鲁维变种(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5 及其培养方法与应用，属于微生物技术领域。
背景技术：
我国是啤酒饮料生产和消费大国，啤酒饮料消费人数众多，但酒中乙醇及微量甲醇、甲醛对消费者健康的危害引起社会的普遍关注，特别是过量嗜酒习惯对消费者危害极大，易因酒驾导致交通肇事，醉酒引发家庭矛盾等。为此，开发无醇或低醇饮品，提高营养水平，既满足消费者需求，也有利于人体健康，又可扩大消费人群，符合我国食品发展方向和世界饮料发展潮流。为此低醇或无醇啤酒饮料应运而生，具有广阔的发展市场。低醇饮料需要在保持普通啤酒风味品质的同时，还要求乙醇含量应低于O. 5%vol。目前无醇啤酒饮料生产方法主要有脱醇法、控制发酵法和路德类酵母发酵法，但随之带来工艺流程和生产成本的增加，使得其推广受到限制。
如中国专利文献CN86104029A (申请号86104029)公开了生产低醇饮料的方法，是使高醇饮料，加入的水和再循环的滞留液之混合物通过反渗透系统，形成渗透物和滞留物。 从系统中排除主要含有醇和水的渗透物，小部分滞留物经回收后作为产品，同时将大部分滞留物再循环到反渗透系统，与新加入的饮料和水混合，这一技术工序复杂，能耗高。因此， 通过筛选新的菌株，优化生产工艺来生产低醇饮料是解决上述问题的经济而有效途径。发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种克鲁维毕赤酵母克鲁维变种菌株及其培养方法与应用。
术语说明
低醇饮料乙醇含量低于O. 5% (w/w)的啤酒饮料。
本发明的技术方案如下
一种克鲁维毕赤酵母克鲁维变种(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5， 2010年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中科院微生物研究所，保藏号CGMCC NO :4494。
上述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5 分离自新压榨的鲜葡萄汁中，菌落边缘及中心都呈奶油色，球状突起，表面皱褶粗糙，不透明，不反光，边缘不整齐，毛绒状，白色暗淡；细胞呈椭圆形。液体Yro培养基培养2-3d，有沉淀和绒状膜出现。该菌株耐45°c，耐ρΗ2· 5-12. O,耐SO2 400mg/L,耐酒精8%(vol)，耐NaCl 为 100. Og/L，耐葡萄糖 500. Og/Lo
上述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5 的培养方法，步骤如下
(I)取克鲁维毕赤酵母克鲁维变种菌株SS1-5，接种于YEro固体培养基，在25 281条件下，活化培养40 48h，制得活化菌株；
(2)将步骤(I)制得的活化菌株接种于YEro液体培养基中，在25 28°C条件下， 培养15 20h，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液按照体积比2% 5%接种于麦芽汁液体培养基中，在25 28°C条件下，培养32 40h，即得生产用种子液。
根据本发明优选的，所述步骤(I)中的YEro固体培养基每升组分如下葡萄糖20 克，酵母粉10克，蛋白胨10克，琼脂20克，用蒸馏水定容至1000毫升，pH值自然，115°C灭菌 30min。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的YEro液体培养基每升组分如下葡萄糖20 克，酵母粉10克，蛋白胨10克，用蒸馏水定容至1000毫升，pH值自然，115°C灭菌30min。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中的麦芽汁液体培养基组分如下麦芽汁浓度 11 13。P，115°C灭菌 30min，pH 值自然。
上述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5 在制备低醇饮料中的应用。
上述应用，步骤如下
(i)将原料大麦芽经糖化后，按照2 4g/kg的添加量添加酒花，静置20 40min， 分离酒花糟及热凝固物，冷却，制得糖度为11 13° P的麦芽汁；
(ii)按照体积比为2% 5%的添加量向步骤(I)制得的麦芽汁中添加克鲁维毕赤酵母克鲁维变种(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株 SS1-5,在 20 24°C、通氧量 100L/ min的条件下发酵培养7 9d，制得发酵液；
(iii)将步骤(I)制得的发酵液，经过滤、杀菌后，制得低醇饮料。
根据本发明优选的，所述步骤(i)中的糖化，步骤如下
将原料大麦芽在50 55°C条件下投料至水中，保持35 45min ;升温至63 68°C，保持55 65min ;然后升温至70 75°C，保持12 18min，碘验；75 80°C保持8 12min ;煮沸时间65 75min，煮沸强度不低于8%。
进一步优选的，所述大麦芽与水的质量比为1: (4. 5 5. 5)。
有益效果
本发明所述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株 SS1-5可以酿造低醇饮料，该饮料果香味浓，酒精含量低，口感甜润，风味和营养与无醇啤酒接近；此外，该低醇饮料，能够最大限度地保留麦芽汁中的有机营养成分，生产工艺简化， 成本和能显著耗低，减轻环境污染。
图1是实施例3制得的低醇饮料中挥发性物质的GC-MS总离子流气相色谱图2是实施例3制得的低醇饮料中氨基酸分析色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
本实施例中所述大麦芽购自兰州黄河麦芽有限公司，该麦芽质量符合啤酒麦芽国家标准(GB/T1686-2008)；
啤酒花购自新疆绿宝酒花有限公司；
克鲁维毕赤酵母克鲁维变种(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5，在 2010年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中科院微生物研究所，保藏号CGMCC NO 4494 ；
其他原料均为本行业常规市售产品。
实施例1
一种克鲁维毕赤酵母克鲁维变种(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5， 在2010年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中科院微生物研究所，保藏号CGMCC NO :4494。
上述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5 分离自新压榨的鲜葡萄汁中，菌落边缘及中心都呈奶油色，球状突起，表面皱褶粗糙，不透明，不反光，边缘不整齐，毛绒状，白色暗淡；细胞呈椭圆形。·YEH)液体培养2-3d，有沉淀和绒状膜出现。该菌株耐温450C，耐ρΗ2· 5 12. O,耐SO2 400mg/L,耐乙醇8%(vol)，耐NaCl 为100g/L,耐葡萄糖500g/L。
实施例2
实施例1所述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5的培养方法，步骤如下
(I)用接种针取克鲁维毕赤酵母克鲁维变种菌株SS1-5，划线接种于YEH)固体培养基，在28 °C条件下，活化培养40 48h，制得活化菌株；
(2)将步骤(I)制得的活化菌株接种于YEro液体培养基中，在28°C条件下，120r/ min摇床培养18 22h，制得种子液；
(3)将步骤(2)制得的种子液按照体积百比5%接种于麦芽汁液体培养基中，在 25°C条件下，培养34 36h，即得生产用种子液。
所述步骤(I)中的YEro固体培养基每升组分如下葡萄糖20克，酵母粉10克，蛋白胨10克，琼脂20克，用蒸馏水定容至1000毫升，pH值自然，115°C灭菌30min。
所述步骤(2)中的YEH)液体培养基每升组分如下葡萄糖20克，酵母粉10克，蛋白胨10克，用蒸馏水定容至1000毫升，pH值自然，115°C灭菌30min。
所述步骤(3)中的麦芽汁液体培养基组分如下12° P麦芽汁，115°C灭菌30min， pH值自然。
实施例3
上述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5 在制备低醇饮料中的应用，步骤如下
(i)将原料大麦芽按重量比1:5的比例在52°C投料至水中，保持40min;升温至 65°C，保持60min ;然后升温至72°C，保持15min，碘验；78°C保持IOmin ;完全糖化后，分两次洗糟，洗糟水温78°C ;煮沸时间70min，煮沸强度不低于8%，将原料大麦芽经糖化后，按照 2 4g/kg的添加量添加酒花，酒花分三次添加，静置30min，分离酒花糟及热凝固物，冷却， 制得糖度为12±0. 3° P的麦芽汁；
(ii)按照体积比为5%的添加量向步骤(I)制得的麦芽汁中添加克鲁维毕赤酵母克鲁维变种(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5的生产用种子液,在21°C、通氧量100L/min的条件下发酵培养8d，制得发酵液；
(iii)将步骤(I)制得的发酵液，经过滤、巴氏杀菌(杀菌温度68°C，持续30min) 后，制得低醇饮料。
采用无醇啤酒检测国家标准方法，对低醇饮料基本生化指标进行检测。
还原糖测定用斐林试剂法，参照国标GB/T15038-2006，经S⑶-1II全自动还原糖测定仪测定样品还原糖含量(仪器购自山东省科学院生物中心)；经检测，残糖量为35g/L ；
总酸测定用氢氧化钠滴定法，参照国标GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；经检测，总酸为O. 052mol/L ；
双乙酰按照GB/T4928-2008法测定；经检测，双乙酰O. 06mg/L ；
乙醇测定用气相色谱-氢离子火焰法(刘迎春，陈杰，吉华贵，等.直接稀释-气相色谱法测定血液中的乙醇含量.华西医学，2011，26 (04):572-575)，乙醇含量约为O. 46% (vol)
Vc 测定参照 GB/T5009. 86. 2003 标准；Vc 含量为 17. 5mg/kg ；
游离氨基酸含量测定参照GB/T5009. 124. 2003标准方法，结果如图2所示；经检测，游离氨基酸的含量(单位··%)
天门冬氨酸O. 05、谷氨酸O. 10、丝氨酸O. 05、甘氨酸O. 03、组氨酸O. 02、精氨酸 O. 04、苏氨酸O. 03、丙氨酸O. 04、脯氨酸O. 10、酪氨酸O. 02、缬氨酸O. 02、蛋氨酸〈O. 01、胱氨酸O. 02、异亮氨酸O. 03、亮氨酸O. 04、苯丙氨酸O. 47、赖氨酸O. 13，氨基酸总量1. 19。
香味分析用GC-MS法，仪器为日本岛津GC-MS-QP2010气相色谱质谱联用仪，结果如图1所示；经检测分析，香味成分主要有
酯类6种异丁酸丁酯、丁酸异丁酯、丁酸丁酯、山梨醇六乙酸酯、生育酚乙酸酯、 三乙基2- 丁基丙烯酯；
酸类3种亚甲基双硫代乙酸、鹅去氧胆酸、2，4- 二甲氧基肉桂酸；
高级醇3种4,4-二甲基-5 α-胆甾_3 β -醇、胆固醇、4_正癸醇；
酚醛类3种二甲基叔辛基酚、3，5- 二 - (1，1- 二甲基乙基)-1, 2_苯二酚、异丁醛二乙基乙缩醛。
实施例4
如实施例3所述的应用，不同之处在于按3%的接种量(ν/ν)向5L糖度为 11.5±0. 3° P的麦芽汁中添加上述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5的生产用种子液,所得低醇饮料的相关指标如下
表I发酵产品中基本生化指标分析结果
权利要求
1.一种克鲁维毕赤酵母克鲁维变种(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5，在2010年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中科院微生物研究所，保藏号CGMCC NO :4494。
2.权利要求1所述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种(Picchiakluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5的培养方法，其特征在于，步骤如下 (O用接种环取克鲁维毕赤酵母克鲁维变种菌株SS1-5，接种于YEH)固体培养基，在25 28 °C条件下，活化培养40 48h，制得活化菌株； (2)将步骤(I)制得的活化菌株接种于YEH)液体培养基中，在25 28°C条件下，培养15 20h，制得种子液； (3)将步骤(2)制得的种子液按照2 5%(v/v)接种于麦芽汁液体培养基中，在25 28°C条件下，培养32 40h，即得生产用种子液。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(I)中的YEro固体培养基每升组分如下葡萄糖20克，酵母粉10克，蛋白胨10克，琼脂20克，用蒸馏水定容至1000毫升，pH值自然，115°C灭菌30min。
4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中的YEH)液体培养基每升组分如下葡萄糖20克，酵母粉10克，蛋白胨10克，用蒸馏水定容至1000毫升，pH值自然，115°C灭菌 30min。
5.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中的麦芽汁液体培养基组分如下麦芽汁浓度11 13° P，115°C灭菌30min，pH值自然。
6.权利要求1所述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种(Pichiakluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5在制备低醇饮料中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤如下 (i )将原料大麦芽经糖化后，按照2 4g/kg的添加量添加酒花，糖化液温度70 80°C时静置20 40min，分离酒花糟及热凝固物，冷却，制得麦芽汁糖度为11 13° P ; (ii)按照体积比为2 5%的添加量向步骤(I)制得的麦芽汁中添加克鲁维毕赤酵母克鲁维变种(Pichia kluyveri var. kluyveri)菌株SS1-5的生产用种子液,在20 24°C、通氧量为O.1mVmin条件下发酵培养7 9d，制得发酵液； (iii)将步骤(I)制得的发酵液，经过滤、杀菌后，制得低醇饮料。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤(i)中的糖化，步骤如下 将原料大麦芽在50°C 55°C条件下投料至水中，保持35 45min ;升温至63 68°C，保持55 65min ;然后升温至70 75°C，保持12 18min，碘验；75 80°C保持8 12min ；煮沸时间65 75min,煮沸强度不低于8%。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述大麦芽与水的质量比为1:(4.5 ·5.5)。
全文摘要
本发明涉及一种克鲁维毕赤酵母克鲁维变种菌株及其培养方法与应用，克鲁维毕赤酵母克鲁维变种(Pichia kluyveri var.kluyveri)菌株SS1-5，在2010年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏号CGMCC NO4494。该菌株可以酿造低醇饮料，该饮料果香味浓，酒精含量低，口感甜润，风味和营养与无醇啤酒接近；此外，该低醇饮料，能够更好地保留麦芽汁中的有机营养，生产工艺简化，成本和能耗降低，减轻环境污染。
文档编号C12N1/16GK103013845SQ20121035173
公开日2013年4月3日 申请日期2012年9月20日 优先权日2012年9月20日
发明者刘天明, 赵修报, 王会会 申请人:山东轻工业学院