专利名称：虫草素合成酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学与生物技术领域，具体地说，涉及一种与虫草素合成有关的酶其及编码基因。
背景技术：
:虫草素(cordycepin)，又称虫草菌素，于1951年首次从北冬虫夏草分离出来。之后发现虫草素是中药材冬虫夏草的主要活性成份。它是一种天然来源的药物，具有抗肿瘤、抗菌抗病毒、治疗白血病、免疫调节、清除自由基、增强肾功能等多种作用。目前虫草素的研究现正成为药物化学中一个极其活跃的领域。虫草素作为核苷类新药，由于它能干扰基因细胞RNA和DNA的合成，抑制不正常细胞(癌细胞)的分裂并能作为区别细胞中不同的RNA聚合酶的工具，并具有修复基因细胞、保护生命体遗传密码的特殊功效。美国NCI已把虫草素引入18种抗癌新药进行开发研究
发明内容
:本发明的目的在于披露具有虫草素合成酶活性的多肽。为实现本发明的上述目的，本发明人进行了大量的实验。首先从Str印tomycesalboniger扩增编码单磷酸酶(Mono-phosphatase)的基因，之后将该基因插入适当的载体，构建质粒pRSET-CS，再将构建的质粒pRSET-CS转入大肠杆菌中，获得高表达的重组单
磷酸酶。本发明获得的重组单磷酸酶，其特征在于，(a)其序列与说明书中所附的序列SEQID NO:2的I到273位氨基酸具有至少60%的氨基酸同一性；(b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸之序列与SEQ ID NO:1的I到822位核苷酸具有至少60%的同一性，优选地100个核苷酸上至少80 %或90 %相同，更优选地在200个核苷酸上至少90 %相同；(c)该多肽能以3’ -脱氧-单磷酸腺苷为底物合成虫草素。本发明首次将能够以3’-脱氧-单磷酸腺苷为底物合成虫草素的单磷酸酶称为虫草素合成酶(Cordycepin synthetase)。附图的简要说明:
图1:重组的虫草素合成酶(粗提蛋白)之聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，图中左边条带并配有数字(单位是“KD”)是蛋白分子量标准，右边主带是重组的虫草素合成酶(粗提蛋白)，具体参见实施例2。
具体实施方式
:利用本领域已知的技术，先分别构建含有编码虫草素合成酶基因的载体质粒，然后转入大肠杆菌后，无须诱导 培养。将表达的重组虫草素合成酶提取，获得粗提蛋白(或称粗提物)。该粗提蛋白可经本领域已知的蛋白纯化技术(如Histag纯化)进一步纯化，获得纯的重组虫草素合成酶。重组虫草素合成酶粗提蛋白或纯酶又可用本领域已知的酶固定化技术(如将酶固定于环氧型酶载体上)进一步固定化，获得固定化重组虫草素合成酶。之后，测定重组虫草素合成酶的活力，即以3’ -脱氧-单磷酸腺苷为底物进行酶催化反应，测定反应产物中虫草素的含量。本发明所获得的虫草素合成酶基因可以在原核细胞或真核细胞胞内表达，也可采用本领域已知的任何其它适当方法实现在原核细胞或真核细胞胞外表达。在本发明制备虫草素合成酶的方法中，所述载体的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。所述原核细胞包括但不限于大肠杆菌(如HBlOl，BL21，JM109，DH5 α )、凝结芽孢杆菌、枯草芽胞杆菌和链霉菌。所述真核细胞包括但不限于酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母(如毕赤巴斯德酵母GSl 15/9891)。本发明用于克隆虫草素合成酶基因的载体包括但不限于pRSET系列、pGEM-T系列 本发明用于固定化虫草素合成酶和N-乙酰神经氨酸裂解酶基因的载体包括但不限于环氧型载体等。在本申请文本中所用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem.，138:9_37，1984)。下列实施例仅用于说明本发明而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按常规条件或制造商建议的条件进行。实施例1:虫草素合成酶编码基因的扩增与克隆根据基因库(GenBankX92429)基因序列设计引物 CS-F:5’ GAGGATCCCATATGCCACAGCAGGCCGACCTGGA3’ 和 CS-R:5’ AGGAATTCTCAGGGGATGGTGGCGGCACC3’。用引物对 CS-F 和CS-R从Streptomyces alboniger中扩增虫草素合成酶编码基因。扩增条件为:20mMTris-HCl (pH8.8), IOmM KCl, IOmM(NH4)2SO1^mM MgSO4,0.1 %Triton Χ_100，50μΜ dATP,50yM dTTP,50yM dCTP,50yM dGTP，400ηΜ 引物 CS-F，400ηΜ弓I 物 CS-R, 1.0 U Pfu DNA 聚合酶(Promega, USA)，用接种环挑取少许 Streptomycesalboniger菌体,再用无菌水调反应体积至50 μ I。PCR扩增反应程序为:95°C 3分钟，35圈循环:95°C 50秒、50°C 30秒和72°C I分钟，最后72°C 10分钟。扩增的产物经限制性内切酶NdeI和EcoRI酶切后与经同样限制性内切酶NdeI和EcoRI酶切的载体pRSET-CS (源自Invitrogen，USA)连接，得质粒pRSET-CS。经DNA测序，确定该被克隆的虫草素合成酶的核苷酸序列，具体示于序列表中序列1，相应的氨基酸序列为序列表中的序列2。实施例2:虫草素合成酶的提取虫草素合成酶的提取与纯化主要参考Hong-Bo Hu, et al.Bioprocess BiosystEng.2007，30:87_90。具体过程如下:将含虫草素合成酶基因的质粒pRSET-CS转化感受态细菌细胞E.coli HBiOl，在Luria broth(LB)平板(含100mg/L卡那霉素)上37°C培养24小时。接种单个克隆于5毫升LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)中于30°C培养20-24小时。离心收集菌体，并悬浮于I毫升IOOmM Tris盐酸缓冲液(pH7.5)中。然后用超声波裂解细菌细胞。离心(10°C, 17, 800g, 10分钟)并收集上清液，即为粗提蛋白(或称粗提物)。图1显示了重组的虫草素合成酶粗提蛋白之聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，表明虫草素合成酶(目标带大小约为29kD)在大肠杆菌HBlOl中有较高表达。实施例3:虫草素合成酶活性的测定配制底物溶液:含50mM的3’-脱氧-单磷酸腺苷、IOOmM Tris盐酸缓冲液和终浓度为IOmM之MgCl2,调pH至7.5。取底物溶液400微升，然后加入100微升虫草素合成酶粗提蛋白，于37°C进行30分钟反应。离心(10°C，17，800g，15分钟)并收集上清液。通过高压液相色谱(HPLC)测定所得上清液中虫草素的含量。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酶蛋白浓度。一单位酶比活性定义为在上述条件下每分钟转化一微摩尔3’-脱氧-单磷酸腺苷为虫草素所需之酶量。虫草素合成酶(粗提蛋白)特异性活力为0.5U/mg。本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变。这些改变均在本发 明的范围之内。
权利要求
1.一种具有虫草素合成酶活性的多肽，其特征在于，该多肽的序列与说明书中所附的序列SEQ ID NO:2的I到273位氨基酸具有至少60%的氨基酸同一性。
2.权利要求1所述的多肽是由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸之序列与SEQIDNO:1的I到822位核苷酸具有至少60%的同一性。
3.权利要求2所述的多核苷酸序列是由源自Streptomycesalboniger。
4.权利要求1所述的多肽能用于合成虫草素。
5.权利要求4所述的多肽是在原核细胞，又或是真核细胞中表达的重组蛋白。
6.权利要求5所述的重组蛋白是液酶，又或是固定化酶。
7.权利要求6所述的固定化酶是重组蛋白表达后，未破菌体直接固定化、或破菌体后粗蛋白直接固定化、又或破 菌体后粗蛋白经纯化得纯蛋白再固定化形成的。
全文摘要
本发明披露具有虫草素合成酶活性的多肽，该多肽的特征在于(a)其序列与说明书中所附的序列SEQ ID NO2的1到273位氨基酸具有至少60％的氨基酸同一性；(b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸之序列与SEQ ID NO1的1到822位核苷酸具有至少60％的同一性，优选地100个核苷酸上至少80％或90％相同，更优选地在200个核苷酸上至少90％相同；(c)该多肽能用于合成虫草素。
文档编号C12R1/465GK103184201SQ201210395708
公开日2013年7月3日 申请日期2012年10月17日 优先权日2012年10月17日
发明者张琦 申请人:邦泰生物工程(深圳)有限公司