专利名称：利用固定化酶合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学与生物技术领域，具体地说，涉及利用固定化酶促合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法。
背景技术：
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烟酸胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadenine dinucleotide,缩写 NAD),也称氧化型辅酶I。是一种转递质子(更准确来说是氢离子)的辅酶，它出现在细胞很多代谢反应中。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是一种基本的氧化还原辅酶，不论是在呼吸作用还是光合作用过程，它都起着核心枢纽作用。另外，NADH不能直接为分子态氧所氧化，但能通过NADH脱氢酶的作用进行脱氢变成NAD。在呼吸链中，通过这种作用,可使黄素、醌、细胞色素等逐步被还原，最后氧被还原成水。这种以NAD为媒介的底物被O2所氧化的途径，是好氧生物的主要有机物的氧化途径。
目前，工业界、医药界或作为生化试剂使用的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)基本上是通过酵母菌发酵而来。发明内容:
本发明的目的在于提供一种利用固定化酶促合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法。本发明的另 一目的还在于提供含有编码本发明所述的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶(ni cotinami de-nucleotide adeny Iy I transferase)的基因序列。本发明的再一目的在于利用固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶催化，以烟酰胺核苷酸和三磷酸腺苷二钠(ATP)为底物制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
为实现本发明的上述目的，本发明人进行了大量深入的实验，通过克隆较佳的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶基因至适当的载体，转入大肠杆菌后，无须诱导，本发明的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶在大肠杆菌中皆高表达。通过将表达的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶提取并固定于适当的环氧型酶载体，从而获得了高活力的固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶，该固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶能以烟酰胺核苷酸和三磷酸腺苷二钠(ATP)为底物制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
本发明的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶是来源于MethanocaldococcusjannaschiiDSM 2661。序列表中的SEQ ID N0.:2代表本发明的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶的氨基酸序列。
本发明的酶固定化载体是选择了环氧型载体LX-3000，还可选用本领域的其它酶固定化载体，如传统的无机载体材料二氧化硅、活性炭、玻璃珠等，再如有机高分子载体大孔型聚N-氨乙基丙烯酰胺-聚乙烯等。通过与该类型载体结合，本发明获得了高活力的固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶，该酶以烟酰胺核苷酸和三磷酸腺苷二钠(ATP)为底物，高转化率(大于80% )生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
附图的简要说明:
图1:重组的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶(粗提蛋白)之聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，图中右边条带并配有数字(单位是“KD”)是蛋白分子量标准，具体参见实施例2。
具体实施方式
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利用本领域已知的技术，先构建含有编码烟酰胺核苷腺苷酰转移酶基因的载体质粒，然后转入大肠杆菌后，无须诱导培养，将表达的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶提取并固定于适当的环氧型酶载体，从而获得高活力的固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶。用固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶催化，以烟酰胺核苷酸和三磷酸腺苷二钠(ATP)为底物制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
本发明所获得的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶基因可以在原核细胞或真核细胞胞内表达，也可采用本领域已知的任何其它适当方法实现在原核细胞或真核细胞胞外表达。
在本发明制备烟酰胺核苷腺苷酰转移酶的方法中，所述载体的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。所述原核细胞包括但不限于大肠杆菌(如HB101，BL21，JM109，DH5a)、枯草芽胞杆菌和链霉菌。所述真核细胞包括但不限于酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母(如毕赤巴斯德酵母GS115)。
本发明用于克隆烟酰胺核苷腺苷酰转移酶基因的载体包括但不限于pRSET系列、pGEM-T系列等。
本发明烟酰胺核苷腺苷酰转移酶之国际酶学委员会命名编号为EC2.7.7.1。
本发明用于固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶的载体包括但不限于环氧型载体等。
在本申请文本中所用 的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem.，138:9_37，1984)。
下列实施例仅用于说明本发明而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按常规条件或制造商建议的条件进行。
实施例1:烟酰胺核苷腺苷酰转移酶编码基因的扩增与克隆
根据基因库(GenBank NC_000909)基因序列设计引物bmj-F:5’ GACATATGAGAGGGTTTATAATTGGT 3’ 和 bmj-R:5’ GAGGATCCTTATTTGTCTGTCTGAGCTAAT 3’。用引物对 bmj-F 和 bmj-R 从 Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661 中扩增烟酸胺核苷腺苷酰转移酶编码基因。
扩增条件为:20mMTris-HCl (pH 8.8)，IOmM KCl，IOmM (NH4) 2S04, 2mM MgS04,0.1 % Triton Χ_100，50μΜ dATP,50yM dTTP,50yM dCTP,50yM dGTP，400nM 引物bmj-F, 400nM 引物 bmj-R, 1.0U Pfu DNA 聚合酶(Promega, USA)，用接种环挑取少许Methanocaldococcus jannaschiiDSM 2661 菌体，再用无菌水调反应体积至 50 μ I。
PCR扩增反应程序为:95°C 3分钟，35圈循环:95°C 50秒、50°C 30秒和72°C I分钟，最后72°C 10分钟。扩增的产物经限制性内切酶NdeI和BamHI酶切后与经同样限制性内切酶NdeI和BamHI酶切的载体pRSET_A(源自Invitrogen, USA)连接，得质粒pRSET-bmj。经DNA测序，确定该被克隆的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶的核苷酸序列，具体示于序列表中序列1，相应的氨基酸序列为序列表中的序列2。
实施例2:烟酰胺核苷腺苷酰转移酶的提取
烟酰胺核苷腺苷酰转移酶的提取与纯化主要参考NADIA RAFFAELLI等，METHODSIN ENZYMOLOGY.2001,331:292-298。具体过程如下:
将含烟酰胺核苷腺苷酰转移酶基因的质粒pRSET-bmj转化感受态细菌细胞E.coli HB101，在Luria broth (LB)平板(含100mg/L卡那霉素)上37°C培养24小时。接种单个克隆于5毫升LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)中于30°C培养20-24小时。离心收集菌体，并悬浮于I毫升IOOmMTris盐酸缓冲液(pH 7.5)中。然后用超声波裂解细菌细胞。离心(10°C，17，800g，10分钟)并收集上清液，即为粗提蛋白(或称粗提物)。
图1A显示了重组的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶粗提蛋白之聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，表明烟酰胺核苷腺苷酰转移酶(目标带大小约为19kD)在大肠杆菌HB101中有较高的表达水平。
重组的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶粗提蛋白经70°C热处理10分钟，离心(10°C，17，800g, 10分钟)并收集上清液，即为部分纯化的蛋白。
实施例3:烟酰胺核苷腺苷酰转移酶活性的测定
配制底物溶液:含5mM的烟酰胺核苷酸(Nicotinamidemononucleotide)、IOmM之ATPUOmM之MgCl和IOOmM Tris盐酸缓冲液，调pH至7.5。取底物溶液400微升，然后加入100微升烟酰胺核苷腺苷酰转移酶部分纯化的蛋白，于37°C进行10分钟反应。离心(10°C，17，800g，15分钟)并收集上清液。通过高压液相色谱(HPLC)测定所得上清液中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的含量。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酶蛋白浓度。一单位酶比活性定义为在上述条件下每分钟转化一微摩尔烟酰胺核苷酸为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸所需之酶量。烟酰胺核苷腺苷酰转移酶特异性活力为6.5U/mg。
实施例4:烟酰胺核苷腺苷酰转移酶固定化
取烟酰胺核苷腺苷酰转移酶粗提蛋白或部分纯化的蛋白，用洗酶缓冲液(0.02MTris-HCl/0.001M EDTA, pH7.0溶液)稀释至蛋白含量5-10mg/ml。将酶稀释液与PB溶液(2.0mol/L磷酸二氢钾，pH7.5)等体积混合，加入环氧型固定化酶载体LX-3000 (10毫克酶/克载体)，于摇床(转速IOOrpm)中25°C反应20小时。反应完成后用滤袋过滤，用洗酶缓冲液清洗5-6次，得到固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶。
实施例5:用固定 化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
配制底物溶液:含5mM的烟酰胺核苷酸、IOmM的三磷酸腺苷二钠(ATP)UOOmMTris盐酸缓冲液和终浓度为IOmM之MgCl2，调pH至7.5。取底物溶液I毫升，然后加入0.05克固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶，于37°C进行反应2-20小时。离心(10°C，17，800g, 15分钟)并收集上清液。通过高压液相色谱(HPLC)测定所得上清液中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的含量。结果，烟酰胺核苷酸转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的转化率超过80%。
本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变。这些改变均在本发明的范围之内。
权利要求
1.一种利用固定化酶促合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的方法，其特征在于利用固定化烟酰胺核苷腺苷酰转移酶，以烟酰胺核苷酸和三磷酸腺苷二钠(ATP)为底物制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
2.权利要求1所述的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶是在大肠杆菌中表达的重组蛋白。
3.权利要求2所述的重组蛋白可以是未经纯化的蛋白粗提物或是经纯化后获得的纯化蛋白。
4.权利要求2所述的重组蛋白是由源自MethanocaldococcusjannaschiiDSM 2661的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶基因编码而来，具有序列表中SEQ ID N0.:2所示的氨基酸序列。
5.权利要求1所述的烟酰胺`核苷酸是由其它酶合成的粗品，又或是纯品。
全文摘要
本发明涉及一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸生产方法技术领域。本发明公开利用固定化酶促合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法。该方法包括如下步骤a)克隆烟酰胺核苷腺苷酰转移酶(nicotinamide-nucleotide adenylyltransferase)基因；b)于大肠杆菌中表达重组的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶；c)提取重组的烟酰胺核苷腺苷酰转移酶的粗提物或其纯酶；d)固定化重组烟酰胺核苷腺苷酰转移酶的粗提物或其纯酶；e)用固定化重组烟酰胺核苷腺苷酰转移酶催化，以烟酰胺核苷酸和三磷酸腺苷二钠(ATP)为底物制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
文档编号C12P19/32GK103103234SQ20121043451
公开日2013年5月15日 申请日期2012年11月2日 优先权日2012年11月2日
发明者张琦 申请人:邦泰生物工程(深圳)有限公司