专利名称：2-酮基-l-古龙酸发酵的单菌种制备和发酵工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及维生素C的制备方法，具体地说是一种2-酮基-L-古龙酸发酵的单菌种制备和发酵工艺。
背景技术：
目前，我国的维生素C生产厂家均采用二步发酵生产技术。其主要特点是二步发酵过程由两种菌混合培养完成的。其中普通生酮基古龙酸菌将山梨糖转化为2-KLG，普通生酮基古龙酸菌俗称小菌，是产酸菌，另一种菌为巨大芽孢杆菌，促进小菌生长与产酸，巨大芽孢杆菌俗称大菌，是伴生菌。两种菌共同作用，将山梨糖转化为2-KLG。公知的2-KLG发酵的菌种制作技术中:从保藏菌种活化，到种液扩大培养和发酵过程中，大、小菌一直是混合搭配使用。采用混合菌发酵，由于是两种菌种同时培养，大菌生长过程中产生的酶一方面对小菌有促进作用，另一方面，其本身的生长和代谢也会对小菌生长造成拮抗作用。同时，由于是混合培养，对小菌的遗传改良、筛选和保藏极为不便，也不利于对菌种培养和发酵过程的无菌度管理。
发明内容
本发明的目的是提供一种2-酮基-L-古龙酸发酵的单菌种制备和发酵工艺，可以避免原工艺中大、小菌混合培养、发酵时巨大芽孢杆菌对小菌生长的负面影响，有利于对小菌的遗传改良、筛选、培养、保藏和对菌种生长代谢过程的管理，缩短发酵周期。本发明是这样实现的:2_酮基-L-古龙酸发酵的单菌种制备和发酵工艺，其特征在于:在菌种制备和发酵过程中，将巨大芽孢杆菌、普通生酮基古龙酸菌分开培养，先将巨大芽孢杆菌在液体培养基中培养至终点后，制成细胞裂解液，备用；再将单独保藏的普通生酮基古龙酸菌活化培养，分离筛选，继续接种到斜面和种液扩大培养，然后接入发酵培养基中发酵。将巨大芽孢杆菌裂解液按3 30%接种量分别加入普通生酮基古龙酸菌各级培养物中，促进普通生酮基古龙酸菌的正`常生长代谢。本发明可以避免原工艺中大、小菌混合培养、发酵时大菌对小菌生长的负面影响，有利于对小菌的遗传改良、筛选、培养、保藏和对菌种生长代谢过程的管理，缩短发酵周期。
具体实施例方式2-酮基-L-古龙酸发酵的单菌种制备和发酵工艺，其特征在于:在菌种制备和发酵过程中，将巨大芽孢杆菌、普通生酮基古龙酸菌分开培养，先将巨大芽孢杆菌在液体培养基中培养至终点后，制成细胞裂解液，备用；再将单独保藏的普通生酮基古龙酸菌活化培养，分离筛选，继续接种到斜面和种液扩大培养，然后接入发酵培养基中发酵。将巨大芽孢杆菌裂解液按3 30%接种量分别加入普通生酮基古龙酸菌各级培养物中，促进普通生酮基古龙酸菌的正常生长代谢。具体实施时，本发明可以避免原工艺中大、小菌混合培养时大菌对小菌生长的负面影响，有利于对小菌的遗传改良、筛选、培养、保藏和对菌种生长发酵过程的管理，消除了发酵过程中大菌生长时间，缩短发酵周期。新工艺保留原工艺主要过程，只需要对大菌培养液进行裂解处理，即可实现小菌的单独培养和发酵，不需要增添新设备，亦不需要改造原设备，菌种不变，操作简便，易广泛应用。下面通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例1
先将小菌单独接种到装量70ml的茄瓶斜面培养基中，同时加入5ml大菌裂解液，培养72小时，将培养好的纯小菌斜面用冷冻真空干燥法制作冷冻管保藏，纯小菌冷冻管低温保藏2年后，存活率达85%以上。将保藏的小菌冷冻管通过液体种子培养基活化培养40小时后，将活化种液稀释至10_7，涂布接种至分离平皿上，培养72小时，生成单个小菌菌落，挑选出若干优良小菌，接种至装量70ml的茄瓶斜面培养基中，培养72小时，将培养好的纯小菌斜面接种到液体种子培养基中，培养24小时，得到纯小菌培养液。在以上各级小菌培养物中分别按5%接种量加入大菌裂解液。将培养好的小菌培养液IOml，接入到80ml发酵培养基中，另加入5ml大菌裂解液，发酵摇瓶容积750ml，摇床转速210rpm，发酵液终点2-KLG含量77.36mg/ml，发酵周期54小时，较混合菌种发酵缩短6小时。实施例2
先将小菌单独接种到装量70ml的茄瓶斜面培养基中，同时加入5ml大菌裂解液，培养72小时，将培养好的纯小菌斜面用冷冻真空干燥法制作冷冻管保藏，纯小菌冷冻管低温保藏2年后，存活率达85%以上。将保藏的小菌冷冻管通过液体种子培养基活化培养40小时后，将活化种液稀释至10_7，涂布接种至分离平皿上，培养72小时，生成单个小菌菌落，挑选出若干优良小菌，接种至装量70ml的茄瓶斜面培养基中，培养72小时，将培养好的纯小菌斜面接种到液体种子培养基中，培养22小时，得到纯小菌培养液。在以上各级小菌培养物中分别按10%接种量加入大菌裂解液。将培养好的小菌培养液10ml，接入到80ml发酵培养基中，另加入IOml大菌裂解液，发酵摇瓶容积750ml，摇床转速210rpm，发酵液终点2-KLG含量79.21mg/ml，发酵周期52小时,较混合菌种发酵缩短8小时。显然，本发明不限于这些公开的实施例，本发明将覆盖技术方案所描述的范围，以及权利要求范围的各种变形和等效变化，在不偏离本发明的技术解决方案的前体下，对本发明所作的本领域技术人员容易实现的任何修改或改进均属于本发明所要求保护的范围。
权利要求
1.2-酮基-L-古龙酸发酵的单菌种制备和发酵工艺，其特征在于:在菌种制备和发酵过程中，将巨大芽孢杆菌、普通生酮基古龙酸菌分开培养，先将巨大芽孢杆菌在液体培养基中培养至终点后，制成细胞裂解液，备用；再将单独保藏的普通生酮基古龙酸菌活化培养，分离筛选，继续接种到斜面和种液扩大培养，然后接入发酵培养基中发酵；巨大芽孢杆菌裂解液按3 30%接种量分别加入普通生酮基 古龙酸菌各级培养物中，促进普通生酮基古龙酸菌的正常生长代谢。
全文摘要
2-酮基-L-古龙酸发酵的单菌种制备和发酵工艺，在菌种制备和发酵过程中，将巨大芽孢杆菌、普通生酮基古龙酸菌分开培养，先将巨大芽孢杆菌在液体培养基中培养至终点后，制成细胞裂解液，备用；再将单独保藏的普通生酮基古龙酸菌活化培养，分离筛选，继续接种到斜面和种液扩大培养，然后接入发酵培养基中发酵。将巨大芽孢杆菌裂解液按3~30%接种量分别加入普通生酮基古龙酸菌各级培养物中，促进普通生酮基古龙酸菌的正常生长代谢。本发明可以避免原工艺中大、小菌混合培养、发酵时大菌对小菌生长的负面影响，有利于对小菌的遗传改良、筛选、培养、保藏和对菌种生长代谢过程的管理，缩短发酵周期。
文档编号C12R1/01GK103114107SQ201210450138
公开日2013年5月22日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者刘杰, 胡少斌, 陈红, 常芳 申请人:江苏江山制药有限公司