专利名称：一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法
技术领域：
一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法，属于生物工程领域，特别是从发酵液中而非动物中提取硫酸软骨素。
背景技术：
硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)是一种酸性的黏多糖,其二糖单体由葡糖醛酸(D-GlcUA)与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)以β _1，3键相连，糖链生成后由磺基转移酶在GalNAc的碳4位或碳6位进行硫酸化，如图I。根据其化学组成和结构差异可分为Α、Β、C、D、Ε、F、H等多种，通常从哺乳动物组织中提取得到的硫酸软骨素以CS-A、CS-C为主。CS是一类重要的生物高分子，具有广泛的生物活性，其作为安全有效的保健食品 和药品在世界各国得到了广泛应用。硫酸软骨素具有以下生物活性镇痛抗炎作用；促进成骨细胞增生，诱导新骨形成；抗肿瘤作用；抗粘连作用；免疫调节作用；调血脂、抗动脉粥样硬化作用；抗氧化、清除自由基和廷缓衰老的作用。CS还具有抗炎、抗病毒、抗过敏和加速伤口愈合的作用，如抗HIV活性。在欧、美、日等发达国家，硫酸软骨素作为保健品长期应用于防治冠心病、心绞痛、心肌梗塞、冠状动脉机能不全、心肌缺血等疾病，无明显的毒副作用，能显著降低冠心病患者的发病率和死亡率。现今硫酸软骨素工业生产方法是从猪、牛、鸡、鲨鱼等动物软骨中提取，主要使用酶法和碱法相结合的方法，但是该方法存在收集原料的成本高、质量不稳定、纯度不好控制、提取复杂、生产造成污染等诸多问题。发酵法生产CS不受原材料限制，成本低、环境友好，但是尚处于初级阶段，国内使用发酵法生产硫酸软骨素尚属空白，国外有发酵液中小量制备硫酸软骨素类似物的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵液中提取硫酸软骨的方法，该提取方法具有回收率闻、提取简单、环境友好等优点。本发明的技术方案I、发酵液的制备取O. ImL筛选的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis BN)接种于种子培养基中，培养温度为37°C，装液量50mL/500mL，摇床转速200rpm，培养12h后按照10%接种量接种于7L发酵罐中进行分批发酵，培养温度为37°C，装液量为3L/7L，转速为400rpm，通气量为1.7L/min，发酵周期为24h。菌种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis BN)是由本研究室选育，主要用来生产硫酸软骨素，该菌株已申请中国专利，并且进入实质性审查，申请号为201110127831. I。种子培养基葡萄糖1.5%，大豆蛋白胨0.8%，酵母粉0.8%，K2HPO4 · 3H20O. 04%, KH2PO4O. 04%。发酵培养基葡萄糖2 %，酵母粉 5 %，(NH4)2SO4O. 2 %, K2HPO4O. 15 %,KH2PO4 · 3Η200· 15%, MgSO4 · 7Η20 O. 04%, MnCl2 · 4Η20 O. 02%。2、发酵液中样品分离纯化I)取发酵液在旋转蒸发仪中45°C进行浓缩，将发酵液体积浓缩至原来的三分之。用三氯乙酸调pH至4. 5,常温下静置Ih,用5mol/L的NaOH调pH至6. 0,8000rpm离心15min除去菌体；2)取上清液，加入上清体积2-3倍的乙醇，机械搅拌Ih后低温静置24h。倾去部分上清，残余液在4000rpm下离心20min,收集沉淀,加入O. 3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解，加入O. 7-1倍体积的氯仿，搅拌Ih后静置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h虹吸部分上清液，残余液离心20min，收集沉淀，重复上述过程2次；3)加入O. 3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L，低速搅拌12h， 6000rpm离心20min，收集上清液再次加入上清体积2_3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h，将提纯样品溶于适量去离子水中；4)得到的提纯样品在超滤离心管中离心浓缩，超滤离心管的过滤膜截留分子量为IOkDa, 5000rpm离心浓缩至原体积的十分之一，再将浓缩液加入去离子水至原体积,再次进行超滤离心，反复三次除去发酵液中小分子物质和有机溶剂。将得到浓缩液至于平板中，放置于-70°C超低温冰箱中冷冻，然后进行冷冻干燥浓缩液后得到硫酸软骨素纯品。3、硫酸软骨素含量的测定将提纯样品稀释合适倍数与标准溶液经O. 22 μ m微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定硫酸软骨素的含量。色谱条件色谱柱NUCLE0DURC18Pyramid ；流动相乙腈+戊烷磺酸钠(10+90)；柱温35°C；检测波长192nm;进样量10μ L流速0.8ml/min。液相色谱标准样品通过高效液相色谱的检测结果如图2，提纯样品检测结果如图3。
图I硫酸软骨素的结构式，R和R1相同或不同，代表H或SO3Na,但不能同时为H，η = 5-50图2鲨鱼软骨素标准品的高相液相色谱结果图3硫酸软骨素提纯样品高效液相色谱结果
具体实施例方式实施例I :按照常规动物软骨中提取硫酸软骨素的方法，硫酸软骨素含量为3. 5g/L的发酵液IL离心除去菌体，置于含碱性蛋白酶(5% )的50mmol/L碳酸钠缓冲液中，60°C保温12h，加热煮沸IOmin灭活蛋白酶后冷却至4°C。处理液中加6. lmol/L三氯醋酸溶液使浓度为5% (v/v)沉淀蛋白质，4°C离心除去。溶液加乙醇至80% (v/v)沉淀24h，4°C离心分离。沉淀溶于水，与氯化十六烷基吡啶混合终达I % (w/v)，室温lh，4°C离心收集沉淀。沉淀溶于2.5mol/L氯化钠，乙醇再沉淀(80%，v/v)，4°C离心。最后的沉淀再溶于水，4°C透析48h，冻干得产品。该方法操作相对简单，但是回收率低，回收硫酸软骨素冻干质量为
2.60g，回收率为74%。实施例2 :收集发酵液，用三氯乙酸调pH至4. 5，常温下静置lh，用5mol/L的NaOH调pH至6. 0,8000rpm离心15min除去菌体。取上清液，加入上清体积2_3倍的乙醇，机械搅拌Ih后低温静置24h。倾去部分上清,残余液在4000rpm下离心20min,收集沉淀,加入 O. 3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解，加入O. 7-1倍体积的氯仿，搅拌Ih后静置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，收集沉淀，重复上述过程2次。加入O. 3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解，加入胰蛋白酶50mg/L，低速搅拌12h，6000rpm离心20min，收集上清液再次加入上清体积2_3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h收集沉淀并溶于适量去离子水中。利用超滤离心管反复超滤三次除去发酵液中小分子物质和有机溶剂。将得到浓缩液置于平板中，放置于_70°C超低温冰箱中冷冻，然后进行真空冷冻干燥后得到硫酸软骨素纯品。发酵液不经浓缩，使用了大量的乙醇，且使得乙醇沉淀的损失量加大，并且硫酸软骨素损失也大，最终冷冻干燥得到硫酸软骨素质量为2. 56g，回收率为73%。实施例3 :取发酵液在旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩温度为45°C，用三氯乙酸调pH至
4.5,常温下静置Ih,用5mol/L的NaOH调pH至6. 0,8000rpm离心15min除去菌体。取上清液，加入上清体积2-3倍的乙醇，机械搅拌Ih后低温静置24h。倾去部分上清，残余液在4000rpm下离心20min，收集沉淀，加入O. 3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解，加入O. 7-1倍体积的氯仿，搅拌Ih后静置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，收集沉淀，重复上述过程2次。加入O. 3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L,低速搅拌12h,6000rpm离心20min,收集上清液再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h，将提纯样品溶于去离子水中。使用IOkDa透析膜透析48h，放置于_70°C超低温冰箱中冷冻，然后进行真空冷冻干燥浓缩液后得到硫酸软骨素纯品。使用透析膜透析，廉价但是费时长且最终得到样品体积大，冷冻干燥量也增大。最终冷冻干燥的得到硫酸软骨素纯品量为2. 85g/L，回收率为81%。实施例4 :取发酵液在旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩温度为45°C。用三氯乙酸调pH至
4.5,常温下静置Ih,用5mol/L的NaOH调pH至6. 0,8000rpm离心15min除去菌体。取上清液,加入上清体积2-3倍的乙醇，机械搅拌Ih后低温静置24h。倾去部分上清，离心收集沉淀，加入O. 3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解，加入O. 7-1倍体积的氯仿，搅拌Ih后静置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h收集沉淀，重复上述过程2次。加入O. 3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L，低速搅拌12h，6000rpm离心20min，收集上清液再次加入上清体积2_3倍的无水乙醇，搅拌30min,静置24h，收集沉淀溶于适量去离子水中。然后使用超滤离心管中离心浓缩，反复三次超滤离心除去发酵液中小分子物质和有机溶剂。将得到浓缩液至于平板中，放置于_70°C超低温冰箱中冷冻，然后进行真空冷冻干燥浓缩液后得到硫酸软骨素纯品。最终冷冻干燥的得到硫酸软骨素纯品量为3. 03g/L,回收率为8 7%。
权利要求
1.一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于提取方法包括如下步骤 1)取0.ImL筛选的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis BN)接种于种子培养基中，培养12h后按照10%接种量接种于7L发酵罐中进行分批发酵，发酵周期为24h。
种子培养基 葡萄糖 1.5%，大豆蛋白胨 0.8%，酵母粉 0.8%,K2HPO4* 3H20 0. 04%, KH2PO4O. 04%发酵培养基 葡萄糖 2%，酵母粉 5%，(NH4)2SO4O. 2 %, K2HPO4O. 15 %, KH2PO4 3H20 0. 15 %,MgSO4 7H20 0. 04%, MnCl2 4H20 0. 02%。
2)取发酵液在旋转蒸发仪中进行浓缩，用三氯乙酸调pH至4.5，常温下静置lh，再用5mol/L 的 NaOH 调 pH 至 6. 0,8000rpm 离心 15min 除去菌体； 3)取上清液,加入上清体积2-3倍的乙醇，机械搅拌Ih后低温静置24h。倾去部分上清，残余液在4000rpm下离心20min,收集沉淀,加入0. 3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解,力口A0. 7-1倍体积的氯仿，搅拌Ih后静置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h虹吸部分上清液，残余液离心20min，收集沉淀，重复上述过程2次； 4)加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L，低速搅拌12h，6000rpm离心20min，收集上清液再次加入上清体积2_3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h，将提纯样品溶于适量去离子水中； 5)去提纯样品适量于超滤离心管中，超滤离心同时去除小分子物质和有机溶剂，浓缩液加入去离子水至原体积，再次进行超滤离心，反复三次除去发酵液中小分子物质，浓缩液真空冷冻干燥后得到硫酸软骨素纯品。
2.根据权利要求I所述一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法，其特征是步骤2)中旋转蒸发温度为45°C，蒸发至原体积的三分之一；步骤5)中超滤离心管的截留分子量为IOkDa,转速为5000rpm，浓缩至原体积的十分之一；步骤5)中浓缩液冷冻条件为_70°C中5_6h，然后再真空度2. 5Pa下冷冻干燥48h得硫酸软骨素纯品。
全文摘要
本发明阐述了一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法，即以研究室保藏产硫酸软骨素菌株为生产菌株，在7L罐中发酵后收集发酵液，将发酵液进行预处理，然后用乙醇沉淀和氯仿萃取去除发酵液中的蛋白质等杂质，再利用超滤离心管反复三次离心除去发酵液中的小分子物质，最后将浓缩液真空冷冻干燥48h得到硫酸软骨素纯品。本发明经过浓缩后大大节约了使用乙醇的量，氯仿可以回收利用，同时使用超滤离心管对于小量制备硫酸软骨素纯品更加快捷、方便。
文档编号C12P19/26GK102965414SQ20121048780
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月27日 优先权日2012年11月27日
发明者刘立明, 刘佳, 吴秋林, 陈坚 申请人:江南大学