专利名称：一种脉动培养细菌纤维素的方法
技术领域：
本发明涉及一种脉动培养细菌纤维素的方法。
背景技术：
细菌纤维素是指在不同条件下，由醋酸菌属、土壤杆菌属、根瘤菌属和八叠球菌属等中的某种微生物合成的纤维素的统称。醋酸菌属中的木醋杆菌Acetobacter xyIinum由于产生纤维素效率最高而被广泛用于细菌纤维素基础研究以及应用研究的模板微生物。细菌纤维素的制备方法目前主要为静态培养与动态培养两种。由于菌种为革兰氏阴性原生细胞体的赖氧生存属性，使细菌纤维素形成于糖源与有氧区与的交界处。静态培养得到的细菌纤维素材料根据培养容器形状不同以及应用领域能够形成薄膜状，管状等规 则几何形状。在静态培养过程中，严格要求不使培养容器产生剧烈晃动以避免细菌纤维素产生分层或部分黏连的现象，降低材料的应用价值。此外，静态培养周期较长，成本过高，细菌纤维素产量无法满足大规模生产的要求；动态培养是指在培养过程中，将氧气或空气以气泡形式通入培养容器中并结合机械搅拌的方式，人为地使原本氧气含量十分有限的培养液含有接近空气中的氧气含量，制备细菌纤维素。由于培养过程中存在着剪切应力，因此得到的细菌纤维素为絮状、星形、团簇状、球形、椭圆等不规则几何形状，应用价值不高。此外，有研究发现动态培养条件下会产生菌种细胞变异体，变异体不具有产生纤维素的能力，因此动态培养时间过久会抑制纤维素的产量。现有技术有报道利用先动态，后静态的“两步法”制备细菌纤维素，广泛应用于东南亚地区“纳塔”(椰果)产业。“两步法”能够在一定程度上提高单一静态培养细菌纤维素的产量，但是从实质上说，仍然是两种不同的制备工艺的简单叠加，无法实现细菌纤维素材料既保证产量，又具有规整的几何外形。现有技术采用透氧材料制成中空模具，利用菌种赖氧生存的生物特性，在模具内腔通入一定压力的空气或氧气,置于接入菌种的发酵培养液中；或者将接入菌种的发酵培养液灌满中空模具内部，将其置于一定压力的环境中。静置一段时间后，细菌分泌纤维素包覆模具外壁或紧贴模具内腔，形成异型中空材料。这种方法能够获得外形不局限于简单的薄膜、管状的异型中空细菌纤维素材料。但是，这种方法从实质上说，仍属于静态培养范畴。透氧材料按照成型工艺可分为织造型与热塑型。其中织造型的材料包括高分子聚合物纤维如棉、纱、聚乙烯纤维、聚丙烯纤维或PET纤维；热塑型的材料包括硅橡胶、膨体聚四氟乙烯、乳胶或陶瓷。已有报道，现有技术将采用透氧材料制备得到的中空异型细菌纤维素应用于人造血管的构建，并已取得一定的成果。理想的血管移植物应具有一个大面积连通的内皮细胞层，以及一个有区别的、静态的平滑肌细胞层，这样才能够提供足够的机械完整性与弹性模量，以满足缝合后的材料维持能力并适应人体全身动脉压力。目前通过组织工程手段，与体外培养人造血管的方法通常选择生物降解性能良好的高分子聚合物材料如聚乳酸PLA，聚乙醇酸PGA以及聚乳酸-聚乙醇酸共聚物PLGA作为支架材料，浸没于灌有培养液的生物培养器中，并接入细胞。培养阶段，通过液体灌注装置人为营造“脉动”的环境来培养人造血管组织。研究发现，在模拟人体脉动环境下培养得到的人造血管组织，外观上与自体动脉十分相似。组织学观察发现平滑肌细胞向内迁移并将支架材料碎片包覆于人造血管壁内，有研究指出，支架碎片的存在，会使材料植入人体内内膜增生以及血栓形成的概率提高；同时，支架碎片也会影响平滑肌细胞的生长与分化。生物可降解材料在人体内降解时会使人造组织局部区域呈明显酸性，这一现象会引发炎症，周围组织坏死等一系列的并发症。
发明内容
本发明的目的是提供一种脉动培养细菌纤维素的方法，采用透氧材料，根据血管、胆管、尿道管、输精管等人体中空异型组织的实际形状、直径及大小制作外周直径与目标内径相一致的中空模具。在现有公开技术基础上，通过精确调节中空模具内部气体压力以及氧气体积浓度，使中空模具以一定频率，沿径向产生收缩/舒张的交替变化。由于中空模具径向收缩/舒张的幅度很小，一般不超过5%，因此这一脉动培养细菌纤维素的过程是一个“准静态”的过程。现有技术在模拟人体收缩/舒张脉动环境下，能够很好地让提供血管抗凝血界面的内皮细胞与提供力学弹性的平滑肌细胞这两种不同的细胞在支架内部很好地、生长。细菌纤维素(Bacterial Cellulose，也称微生物纤维素)是一种纳米纤维材料。其以细菌细胞内部作为生物合成反应器，将葡萄糖小分子在酶催化作用下经过一系列复杂的变构过程最终通过β -I, 4-糖苷键结合形成β -I, 4-葡萄糖链由细菌系细胞侧面的催化位点挤出。β -I, 4-葡萄糖链彼此之间通过分子内与分子间氢键作用，逐步、分层地形成脂多糖层、类晶团聚体、纤维素微纤并最终形成纤维素。这一系列的细胞外(Extracellular)成形过程被称为“纤维素的自组装”。正是这个独特的微生物参与的过程赋予了细菌纤维素良好的理化性能超细三维网状结构；良好的吸湿、保湿以及透气性能；超高的持水性与湿态强度；高抗张强度与弹性模量等等。大量研究表明细菌纤维素材料具有良好的体内、体外生物相容性，加上其优异的形状可调控性与形状维持性使其在构建体内、体外组织工程支架材料具有得天独厚的优势。在脉动环境下制备得到的细菌纤维素，其内部纤维素微纤丝在径向有着较明显的取向，而纤维素微纤丝之间通过分子内与分子间氢键结合，这样就赋予了材料在径向具有良好的力学强度；其次，在培养过程中加入“脉动”的同时，通过调节中空模具内气体压力与氧气体积浓度，能够控制纤维素内部结构的疏密程度，构筑出一个内腔致密光滑；径向取向规整，具备差异化结构的细菌纤维素管状材料。本发明的一种脉动培养细菌纤维素的方法，在细菌纤维素培养过程中，将中空透氧模具置入培养容器中，并在中空透氧模具内部充入气体，周期性地改变中空透氧模具中气体压力，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化。作为优选的技术方案如上所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，所述的中空透氧模具是由透氧材料根据所需修复的人体组织的实际形状、直径以及大小制作得到的；所述的中空透氧模具在外形上与人体乳内动脉、隐静脉、尿道、十二指肠或胆管的形状一致。
如上所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，所述的透氧材料是指在常温常压下的氧气透过速率为100 IOOOmL. m_2· s_\孔隙均一度偏差〈±0. 3的材料。如上所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，所述的透氧材料是指通过针织、机织或编织的方法将棉、纱、聚乙烯纤维、聚丙烯纤维和/或PET纤维制成的中空多孔材料，或通过模具一次成型将硅橡胶、膨体聚四氟乙烯、乳胶或陶瓷透氧材料制成的中空透氧支架。如上所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，所述的气体是指氧气体积浓度在10 100%范围内的气体。如上所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，所述的周期性地改变中空透氧模具中气体压力是指气体压力在设定下限与设定上限之间交替转换，设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，设定下限最小不低于I个标准大气压，转换频率为65 165次/分钟。如上所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，所述的交替转换的方法是指充入设 定上限压力的气体使中空透氧模具发生膨胀，放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限；或者是指不断交替充入设定上限和设定下限压力的气体。如上所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，所述的中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化的外径形变量不超过5%。如上所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，具体包括以下步骤I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2 5，蛋白胨O. 05 O. 5，酵母膏O. 05 O. 5，柠檬酸O. 01 O. 1，磷酸氢二钠O. 02 O. 2，磷酸二氢钾O. 01 O. I,余量为水；发酵培养液的pH为4. O 6. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X105 2X107个/ml ；3)静置培养；将扩培后的菌液转移至灌满发酵培养液，内部有中空透氧模具的培养容器中，放置于恒温培养箱中，28 32°C静置培养；通过在培养过程中向中空透氧模具充入空气，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化来实现脉动培养细菌纤维素；所述的中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化为两种情况之一(I)不断交替改变气体发生装置输出气体的压力设定上限和压力设定下限，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化；(2)充入设定上限压力的气体使中空透氧模具发生膨胀，放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化；所述的气体发生装置为氧气钢瓶、压缩空气钢瓶或气泵；所述的脉动培养细菌纤维素为以下三种情况之一或之二或之三I )脉动培养疏松层
a.气体发生装置输出气体压力设定上限在小于I. 2个标准大气压，不低于I. I个标准大气压范围内；气体压力设定下限在大于I个标准大气压，不超过I. I个标准大气压范围内；不断交替改变气体发生装置输出气体压力的设定上限与设定下限，转换频率为65 165次/分钟；气体中氧气体积浓度在10 15%范围内；b.充入设定上限压力在小于I. 2个标准大气压，不低于I. I个标准大气压范围内的气体，使中空透氧模具发生膨胀；放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限压力，设定下限压力在大于I个标准大气压，不超过I. I个标准大气压范围内；放气频率为65 165次/分钟，气体中氧气体积浓度在10 15%范围内；制得的疏松层的纤维素含量为O. IX 1(Γ2 O. 2 X l(T2g/cm3,厚度为I 5mm ；
II)脉动培养弹性层a.设定气体发生装置输出气体压力上限在小于I. 5个标准大气压，不低于I. 3个标准大气压范围内，气体压力下限在大于I. I个标准大气压，不超过I. 3个标准大气压范围内；不断交替改变气体发生装置输出气体压力的设定上限与设定下限，转换频率为65 165次/分钟；气体中氧气体积浓度在30 50%范围内；b.充入设定上限压力在小于I. 5个标准大气压，不低于I. 3个标准大气压范围内的气体，使中空透氧模具发生膨胀；放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限压力，设定下限压力在大于I个标准大气压，不超过I. 3个标准大气压范围内；放气频率为65 165次/分钟，气体中氧气体积浓度在30 50%范围内；制得的弹性层的纤维素含量为O. 3X 10_2 O. 6X 10_2g/cm3，厚度为I 5mm ;III)脉动培养致密层a.设定气体发生装置输出气体压力上限在小于2. O个标准大气压，不低于I. 5个标准大气压范围内，气体压力下限在大于I. 3个标准大气压，不超过I. 5个标准大气压范围内；不断交替改变气体发生装置输出气体压力的设定上限与设定下限，转换频率为65 165次/分钟；气体中氧气体积浓度不低于50% ；b.充入设定上限压力在小于2. O个标准大气压，不低于I. 5个标准大气压范围内的气体，使中空透氧模具发生膨胀；放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限压力，设定下限压力在大于I个标准大气压，不超过I. 5个标准大气压范围内；放气频率为65 165次/分钟,气体中氧气体积浓度不低于50% ；制得的致密层的纤维素含量为O. 7X 1(Γ2 I. OX l(T2g/cm3，厚度为I 5mm ;4)后处理脉动培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为I 10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2 10小时，用纯净水清洗至pH为7. O，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。如上所述的菌种是指能够生物合成纤维素的微生物，包括木醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、农杆菌、根瘤菌、八叠球菌、洋葱假单胞菌、椰毒假单胞菌或空肠弯曲菌中的一种或几种。如上所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，所述的高压蒸汽灭菌后紫外辐照是指将所述发酵培养液置于高压灭菌锅内121°C灭菌处理30分钟后取出置于紫外灯下辐照冷却至室温；所述的通纯氧是指将医用氧以lL/min的速度通入上述的培养液中，并维持30分钟；所述的接种是指用灭菌后的接种环钩取适量保存于4°C下试管中的菌种，并转移至上述的发酵培养液中；所述的扩培是指将接入菌种后的发酵培养液于28 32°C下摇床培养8 24小时。有益效果与现有技术相比，本发明的有益效果是(I)在传统单一的静态培养细菌纤维素过程中加入了 “脉动”动态因素，确保细菌纤维素不产生分层、部分黏连等降低材料应用价值的负面因素的前提下，通过“准静态”的方式，动静结合地制备细菌纤维素材料。(2)在脉动环境下制备得到的细菌纤维素，其内部纤维素微纤丝在径向有着较明显的取向，而纤维素微纤丝之间通过分子内与分子间氢键结合，材料在径向具有良好的力 学强度。(3)通过精确调节中空模具内气体压力与氧气体积浓度，能够控制纤维素内部结构的疏密程度，构筑出一个内腔致密光滑；径向取向规整，具备差异化结构的细菌纤维素管状材料。(4)细菌纤维素材料在动物体内降解周期至少为两年，可以认为是一种不降解的生物材料。因此在支架体外培养阶段以及植入人体内后，不会发生支架碎片被细胞形成组织包覆的情况，相比较生物可降解支架材料，术后发生内膜增生以及形成血栓的概率会大大降低。(5)—种脉动培养细菌纤维素的方法成型过程简单，支架材料制备周期短，制备过程绿色环保、简便快速、制备成本低廉，是一种理想的生物医用支架材料。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例II)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2，蛋白胨O. 05，酵母膏O. 05，柠檬酸O. 01，磷酸氢二钠O. 02，磷酸二氢钾O. 01，余量为水；发酵培养液的pH为4. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X105个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液转移至灌满发酵培养液，内部有中空透氧模具的培养容器中，放置于恒温培养箱中，28°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具充入空气，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化来实现脉动培养细菌纤维素；所述的中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化分为两种情况(I)不断交替改变气体发生装置输出气体的压力设定上限和压力设定下限，使中空透氧模具产生径向的 收缩/舒张的交替变化；(2)充入设定上限压力的气体使中空透氧模具发生膨胀，放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化；所述的脉动培养细菌纤维素分为第一种情况I)脉动培养疏松层方式一、气体发生装置输出气体压力设定为I. I个标准大气压；气体压力设定下限在为I个标准大气压。不断交替改变气体发生装置输出气体压力的设定上限与设定下限，转换频率为65次/分钟；气体中氧气体积浓度在10% ；方式二、充入设定上限压力在为I. I个标准大气压的气体，使中空透氧模具发生膨胀；放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限压力，设定下限压力为I个标准大气压；放气频率为65次/分钟，气体中氧气体积浓度在10% ；所述的疏松层是指纤维素含量为O. I X l(T2g/cm3,厚度为1mm。4)后处理脉动培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为lwt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持10小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例2I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；发酵培养液的pH为6. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液转移至灌满发酵培养液，内部有中空透氧模具的培养容器中，放置于恒温培养箱中，32°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具充入空气，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化来实现脉动培养细菌纤维素；所述的中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化分为两种情况(I)不断交替改变气体发生装置输出气体的压力设定上限和压力设定下限，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化；(2)充入设定上限压力的气体使中空透氧模具发生膨胀，放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化；所述的脉动培养细菌纤维素分为第一种情况
I)脉动培养疏松层方式一、气体发生装置输出气体压力设定为I. 2个标准大气压；气体压力设定下限在为I. I个标准大气压。不断交替改变气体发生装置输出气体压力的设定上限与设定下限，转换频率为165次/分钟；气体中氧气体积浓度在15% ；方式二、充入设定上限压力在为I. 2个标准大气压的气体，使中空透氧模具发生膨胀；放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限压力，设定下限压力为1.1个标准大气压；放气频率为165次/分钟，气体中氧气体积浓度在15%范围内；制得的疏松层的纤维素含量为O. 2 X l(T2g/cm3,厚度为5mm ；4)后处理脉动培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7. O，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例3I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2，蛋白胨O. 05，酵母膏O. 05，柠檬酸O. 01，磷酸氢二钠O. 02，磷酸二氢钾O. 01，余量为水；发酵培养液的pH为4. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X105个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液转移至灌满发酵培养液，内部有中空透氧模具的培养容器中，放置于恒温培养箱中，28°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具充入空气，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化来实现脉动培养细菌纤维素；所述的中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化分为两种情况(I)不断交替改变气体发生装置输出气体的压力设定上限和压力设定下限，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化；(2)充入设定上限压力的气体使中空透氧模具发生膨胀，放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化；所述的脉动培养细菌纤维素为第二种情况2)脉动培养弹性层方式一、设定气体发生装置输出气体压力上限为L 3个标准大气压,气体压力下限I. I个标准大气压。不断交替改变气体发生装置输出气体压力的设定上限与设定下限，转换频率为65次/分钟；气体中氧气体积浓度在30% ；方式二、充入设定上限压力为I. 3个标准大气压的气体，使中空透氧模具发生膨胀；放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限压力，设定下限压力为I. I个标准大气压。放气频率为65次/分钟，气体中氧气体积浓度在30%。
所述的弹性层纤维素含量为O. 3 X 10_2g/cm3，厚度为1mm。4)后处理脉动培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为lwt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持10小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例4I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；
发酵培养液的pH为6. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液转移至灌满发酵培养液，内部有中空透氧模具的培养容器中，放置于恒温培养箱中，32°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具充入空气，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化来实现脉动培养细菌纤维素；所述的中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化分为两种情况(I)不断交替改变气体发生装置输出气体的压力设定上限和压力设定下限，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化；(2)充入设定上限压力的气体使中空透氧模具发生膨胀，放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化；所述的脉动培养细菌纤维素为第二种情况2)脉动培养弹性层方式一、设定气体发生装置输出气体压力上限为L 5个标准大气压,气体压力下限I. 3个标准大气压。不断交替改变气体发生装置输出气体压力的设定上限与设定下限，转换频率为165次/分钟；气体中氧气体积浓度在50% ；方式二、充入设定上限压力为I. 5个标准大气压的气体，使中空透氧模具发生膨胀；放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限压力，设定下限压力为I. 3个标准大气压。放气频率为165次/分钟，气体中氧气体积浓度在50%。所述的弹性层纤维素含量为O. 6X l(T2g/cm3,厚度为5mm。4)后处理脉动培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7. O，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例5I)发酵培养液的调配；
发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2，蛋白胨O. 05，酵母膏O. 05，柠檬酸O. 01，磷酸氢二钠O. 02，磷酸二氢钾O. 01，余量为水；发酵培养液的pH为4. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X105个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液转移至灌满发酵培养液，内部有中空透氧模具的培养容器中，放、置于恒温培养箱中，28°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具充入空气，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化来实现脉动培养细菌纤维素；所述的中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化分为两种情况(I)不断交替改变气体发生装置输出气体的压力设定上限和压力设定下限，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化；(2)充入设定上限压力的气体使中空透氧模具发生膨胀，放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化；所述的脉动培养细菌纤维素为第三种情况3)脉动培养致密层方式一、设定气体发生装置输出气体压力上限为L 5个标准大气压,气体压力下限I. 3个标准大气压。不断交替改变气体发生装置输出气体压力的设定上限与设定下限，转换频率为65次/分钟；气体中氧气体积浓度为50% ；方式二、充入设定上限压力为I. 5个标准大气压的气体，使中空透氧模具发生膨胀；放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限压力，设定下限压力为I. 3个标准大气压。放气频率为65次/分钟，气体中氧气体积浓度在50%。所述的弹性层纤维素含量为O. 7X l(T2g/cm3，厚度为1mm。4)后处理脉动培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为lwt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持10小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例6I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；发酵培养液的pH为6. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml。
3)静置培养；将扩培后的菌液转移至灌满发酵培养液，内部有中空透氧模具的培养容器中，放置于恒温培养箱中，32°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具充入空气，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化来实现脉动培养细菌纤维素；所述的中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化分为两种情况(I)不断交替改变气体发生装置输出气体的压力设定上限和压力设定下限，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化；(2)充入设定上限压力的气体使中空透氧模具发生膨胀，放气使中空透氧模具内 气体压力恢复至设定下限，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化；所述的脉动培养细菌纤维素为第三种情况3)脉动培养弹性层方式一、设定气体发生装置输出气体压力上限为2. O个标准大气压,气体压力下限I. 5个标准大气压。不断交替改变气体发生装置输出气体压力的设定上限与设定下限，转换频率为165次/分钟；气体中氧气体积浓度为100% ；方式二、充入设定上限压力为2. O个标准大气压的气体，使中空透氧模具发生膨胀；放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限压力，设定下限压力为I. 5个标准大气压。放气频率为165次/分钟，气体中氧气体积浓度在100%。所述的弹性层纤维素含量为1.0X 10_2g/cm3，厚度为5mm。4)后处理脉动培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7. O，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例7I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2，蛋白胨O. 05，酵母膏O. 05，柠檬酸O. 01，磷酸氢二钠O. 02，磷酸二氢钾O. 01，余量为水；发酵培养液的pH为4. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X105个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液转移至灌满发酵培养液，内部有中空透氧模具的培养容器中，放置于恒温培养箱中，28°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具充入空气，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化来实现脉动培养细菌纤维素；所述的中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化分为两种情况(I)不断交替改变气体发生装置输出气体的压力设定上限和压力设定下限，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化；(2)充入设定上限压力的气体使中空透氧模具发生膨胀，放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化；所述的脉动培养细菌纤维素具有内壁致密、中间弹性、外壁疏松的结构特点I)脉动培养疏松层方式一、气体发生装置输出气体压力设定为L I个标准大气压；气体压力设定下限在为I个标准大气压。不断交替改变气体发生装置输出气体压力的设定上限与设定下限，转换频率为65次/分钟；气体中氧气体积浓度在10% ；方式二、充入设定上限压力在为I. I个标准大气压的气体，使中空透氧模具发生膨胀；放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限压力，设定下限压力为I个标准大 气压；放气频率为65次/分钟，气体中氧气体积浓度在10% ；所述的疏松层是指纤维素含量为O. I X l(T2g/cm3,厚度为1mm。2)脉动培养弹性层方式一、设定气体发生装置输出气体压力上限为L 3个标准大气压,气体压力下限I. I个标准大气压。不断交替改变气体发生装置输出气体压力的设定上限与设定下限，转换频率为65次/分钟；气体中氧气体积浓度在30% ；方式二、充入设定上限压力为I. 3个标准大气压的气体，使中空透氧模具发生膨胀；放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限压力，设定下限压力为1.1个标准大气压。放气频率为65次/分钟，气体中氧气体积浓度在30%。所述的弹性层纤维素含量为O. 3X 10_2g/cm3，厚度为1_。3)脉动培养致密层方式一、设定气体发生装置输出气体压力上限为I. 5个标准大气压,气体压力下限I. 3个标准大气压。不断交替改变气体发生装置输出气体压力的设定上限与设定下限，转换频率为65次/分钟；气体中氧气体积浓度为50% ；方式二、充入设定上限压力为I. 5个标准大气压的气体，使中空透氧模具发生膨胀；放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限压力，设定下限压力为I. 3个标准大气压。放气频率为65次/分钟，气体中氧气体积浓度在50%。所述的弹性层纤维素含量为O. 7 X 10_2g/cm3，厚度为1mm。4)后处理脉动培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为lwt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持10小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。实施例8I)发酵培养液的调配；发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨O. 5，酵母膏O. 5，柠檬酸O. I，磷酸氢二钠O. 2，磷酸二氢钾O. I，余量为水；发酵培养液的pH为5. O ;将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2)菌种扩培；将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2X107个/ml。3)静置培养；将扩培后的菌液转移至灌满发酵培养液，内部有中空透氧模具的培养容器中，放置于恒温培养箱中，30°C静置培养。通过在培养过程中向中空透氧模具充入空气，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化来实现脉动培养细菌纤维素；所述的中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化分为两种情况
(I)不断交替改变气体发生装置输出气体的压力设定上限和压力设定下限，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化；(2)充入设定上限压力的气体使中空透氧模具发生膨胀，放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化；所述的脉动培养细菌纤维素具有内壁致密、中间弹性、外壁疏松的结构特点I)脉动培养疏松层方式一、气体发生装置输出气体压力设定为I. I个标准大气压；气体压力设定下限在为I个标准大气压。不断交替改变气体发生装置输出气体压力的设定上限与设定下限，转换频率为80次/分钟；气体中氧气体积浓度在10% ；方式二、充入设定上限压力在为I. I个标准大气压的气体，使中空透氧模具发生膨胀；放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限压力，设定下限压力为I个标准大气压；放气频率为80次/分钟，气体中氧气体积浓度在10% ；所述的疏松层是指纤维素含量为O. 2 X l(T2g/cm3，厚度为1mm。2)脉动培养弹性层方式一、设定气体发生装置输出气体压力上限为I. 3个标准大气压,气体压力下限I. I个标准大气压。不断交替改变气体发生装置输出气体压力的设定上限与设定下限，转换频率为80次/分钟；气体中氧气体积浓度在30% ；方式二、充入设定上限压力为I. 3个标准大气压的气体，使中空透氧模具发生膨胀；放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限压力，设定下限压力为1.1个标准大气压。放气频率为80次/分钟，气体中氧气体积浓度在30%。所述的弹性层纤维素含量为O. 5 X 10_2g/cm3，厚度为1mm。3)脉动培养致密层方式一、设定气体发生装置输出气体压力上限为I. 5个标准大气压,气体压力下限I. 3个标准大气压。不断交替改变气体发生装置输出气体压力的设定上限与设定下限，转换频率为80次/分钟；气体中氧气体积浓度为50% ；方式二、充入设定上限压力为I. 5个标准大气压的气体，使中空透氧模具发生膨胀；放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限压力，设定下限压力为I. 3个标准大气压。放气频率为80次/分钟，气体中氧气体积浓度在50%。所述的弹性层纤维素含量为1.0X 10_2g/cm3，厚度为1mm。4)后处理脉动培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为2wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持4小时，用纯净水清洗至pH为7. O，材料内毒素〈 O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。
权利要求
1.一种脉动培养细菌纤维素的方法，其特征是在细菌纤维素培养过程中，将中空透氧模具置入培养容器中，并在中空透氧模具内部充入气体，周期性地改变中空透氧模具中气体压力，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化。
2.根据权利要求I所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的中空透氧模具是由透氧材料根据所需修复的人体组织的实际形状、直径以及大小制作得到的；所述的中空透氧模具在外形上与人体乳内动脉、隐静脉、尿道、十二指肠或胆管的形状一致。
3.根据权利要求2所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的透氧材料是指在常温常压下的氧气透过速率为100 IOOOmL. m_2. s'孔隙均一度偏差〈±0. 3的材料。
4.根据权利要求2或3所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的透氧材料是指通过针织、机织或编织的方法将棉、纱、聚乙烯纤维、聚丙烯纤维和/或PET纤维制成的中空多孔材料，或通过模具一次成型将硅橡胶、膨体聚四氟乙烯、乳胶或陶瓷透氧材料制成的中空透氧支架。
5.根据权利要求I所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的气体是指氧气体积浓度在10 100%范围内的气体。
6.根据权利要求I所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的周期性地改变中空透氧模具中气体压力是指气体压力在设定下限与设定上限之间交替转换，设定上限最大不超过I. 5个标准大气压，设定下限最小不低于I个标准大气压，转换频率为65 165次/分钟。
7.根据权利要求I所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的交替转换的方法是指充入设定上限压力的气体使中空透氧模具发生膨胀，放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限；或者是指不断交替充入设定上限和设定下限压力的气体。
8.根据权利要求I所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化的外径形变量不超过5%。
9.根据权利要求I所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，其特征在于，具体包括以下步骤 1)发酵培养液的调配； 发酵培养液组分，以质量百分数计，单位为wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2 5，蛋白胨0. 05 0. 5，酵母膏0. 05 0. 5，柠檬酸0. 01 0. I，磷酸氢二钠0. 02 0. 2，磷酸二氢钾0. 01 0. I,余量为水； 发酵培养液的pH为4. 0 6. 0 ; 将上述组分混合后经高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液； 2)菌种扩培； 将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度菌种细胞数目在2 X IO5 2 X IO7个/ml ; 3)静置培养； 将扩培后的菌液转移至灌满发酵培养液，内部有中空透氧模具的培养容器中，放置于恒温培养箱中，28 32 °C静置培养；通过在培养过程中向中空透氧模具充入空气，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化来实现脉动培养细菌纤维素； 所述的中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化为两种情况之一 (1)不断交替改变气体发生装置输出气体的压力设定上限和压力设定下限，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化； (2)充入设定上限压力的气体使中空透氧模具发生膨胀，放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化； 所述的气体发生装置为氧气钢瓶、压缩空气钢瓶或气泵； 所述的脉动培养细菌纤维素为以下三种情况之一或之二或之三 I )脉动培养疏松层 a.气体发生装置输出气体压力设定上限在小于1.2个标准大气压，不低于1. 1个标准大气压范围内；气体压力设定下限在大于1个标准大气压，不超过1. 1个标准大气压范围内；不断交替改变气体发生装置输出气体压力的设定上限与设定下限，转换频率为65 165次/分钟；气体中氧气体积浓度在10 15%范围内； b.充入设定上限压力在小于I.2个标准大气压,不低于I. I个标准大气压范围内的气体，使中空透氧模具发生膨胀；放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限压力，设定下限压力在大于1个标准大气压，不超过1. 1个标准大气压范围内；放气频率为65 165次/分钟，气体中氧气体积浓度在10 15%范围内； 制得的疏松层的纤维素含量为0. 1X 1(T2 0. 2X l(T2g/cm3,厚度为1 5mm ； II)脉动培养弹性层 a.设定气体发生装置输出气体压力上限在小于1.5个标准大气压,不低于1. 3个标准大气压范围内，气体压力下限在大于1. 1个标准大气压，不超过1. 3个标准大气压范围内；不断交替改变气体发生装置输出气体压力的设定上限与设定下限，转换频率为65 165次/分钟；气体中氧气体积浓度在30 50%范围内； b.充入设定上限压力在小于1.5个标准大气压,不低于I. 3个标准大气压范围内的气体，使中空透氧模具发生膨胀；放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限压力，设定下限压力在大于1个标准大气压，不超过1. 3个标准大气压范围内；放气频率为65 165次/分钟，气体中氧气体积浓度在30 50%范围内； 制得的弹性层的纤维素含量为0. 3 X 1(T2 0. 6 X l(T2g/cm3,厚度为1 5mm ； III)脉动培养致密层 a.设定气体发生装置输出气体压力上限在小于2.0个标准大气压,不低于1. 5个标准大气压范围内，气体压力下限在大于1. 3个标准大气压，不超过1. 5个标准大气压范围内；不断交替改变气体发生装置输出气体压力的设定上限与设定下限，转换频率为65 165次/分钟；气体中氧气体积浓度不低于50% ； b.充入设定上限压力在小于2.0个标准大气压,不低于1. 5个标准大气压范围内的气体，使中空透氧模具发生膨胀；放气使中空透氧模具内气体压力恢复至设定下限压力，设定下限压力在大于1个标准大气压，不超过1. 5个标准大气压范围内；放气频率为65 165次/分钟，气体中氧气体积浓度不低于50% ； 制得的致密层的纤维素含量为0. 7 X 1(T2 1. OX l(T2g/cm3,厚度为1 5mm ；4)后处理 脉动培养结束后，将上述的细菌纤维素浸泡至浓度为I 10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2 10小时，用纯净水清洗至pH为7. 0，材料内毒素〈O. 5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素高压灭菌并包装低温封存。
10.根据权利要求9所述的一种脉动培养细菌纤维素的方法，其特征在于，所述的菌种是指能够生物合成纤维素的微生物，包括木醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、农杆菌、根瘤菌、八叠球菌、洋葱假单胞菌、椰毒假单胞菌或空肠弯曲菌中的一种或几种；所述的高压蒸汽灭菌后紫外辐照是指将所述发酵培养液置于高压灭菌锅内i2rc灭菌处理30分钟后取出置于紫外灯下辐照冷却至室温；所述的通纯氧是指将医用氧以IL/min的速度通入上述的培养液中，并维持30分钟；所述的接种是指用灭菌后的接种环钩取适量保存于4°C下试管中的菌种，并转移至上述的发酵培养液中；所述的扩培是指将接入菌种后的发酵培养液于28 32°C下摇床培养8 24小时。
全文摘要
本发明涉及一种脉动培养细菌纤维素的方法，通过在培养过程中，将中空透氧模具置入培养容器中，并在中空透氧模具内部充入气体，周期性地改变中空透氧模具中气体压力，使中空透氧模具产生径向的收缩/舒张的交替变化。确保细菌纤维素不产生分层、部分黏连前提下，通过“准静态”的方式制备细菌纤维素材料。内部纤维素微纤丝在径向有着较明显的取向，而纤维素微纤丝之间通过分子内与分子间氢键结合，材料在径向具有良好的力学强度。能够控制纤维素内部结构的疏密程度，构筑出一个内腔致密光滑；径向取向规整，具备差异化结构的细菌纤维素管状材料，本发明成型过程简单，支架材料制备周期短，制备过程绿色环保、简便快速、制备成本低廉。
文档编号C12R1/01GK102978254SQ20121057550
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者杨敬轩, 李喆, 郑羿, 王华平, 陈仕艳, 王利群 申请人:东华大学