一种大曲细菌dgge标准条带制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种大曲细菌DGGE标准条带的制备及应用，通过在大曲发酵过程中对优势细菌的检测，获得细菌DGGE指纹图谱，选取发酵过程中常见的优势细菌DGGE条带，制备细菌DGGE标准条带，并将其应用于发酵阶段微生物种群的定性检测。
【专利说明】一种大曲细菌DGGE标准条带制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明具体涉及一种大曲细菌DGGE标准条带的制备及其在发酵过程中优势菌群检测中的应用。
【背景技术】
[0002]我国传统白酒酿造是以酒曲为糖化发酵剂，酱香型白酒则是以高温大曲为糖化发酵剂。其大曲是以小麦等谷物为原料，网罗自然界微生物，润水、加入母曲之后入仓发酵，发酵7天左右待堆心温度升到60°C时进行第一次翻仓，再隔7天左右待堆心温度升到55°C时进行第二次翻仓，直到40-45天发酵时间结束即可出仓，在适宜的环境放置3-6个月之后方可投入生产。大曲作为白酒酿造中的糖化、发酵和增香剂，其微生物种类繁多，偌大的微生物群栖息在一起，既互相促进又互相抑制，并不断地进行着盛衰交替。大曲中的微生物组成与大曲酒的香型及酒的质量有密切关系。从根本上说，白酒的独特风味来源于参与白酒发酵的微生物种类和数量的多寡，白酒整个酿造发酵过程也是依赖微生物及其酶类的繁殖代谢而得以进行，由此大曲成为酿酒品控的核心指标之一，对大曲微生物的研究也成为酿酒行业的关注的热点。
[0003]在研究传统发酵食品的微生物菌群变化的研究中，快速而准确的微生物定性鉴别方法是目前许多研究的焦点。以PCR-DGGE为基础的分子生物学技术，有力地推动了微生态学研究的发展。由于DGGE技术避免了分离培养的缺陷，直观地显现了微生物区系菌群的多样性，目前已成为微生物菌群多样性和动态变化分析的常用工具。DGGE技术主要根据DNA序列因GC含量的不同，而在变性梯度凝胶中形成不同程度的解链，停滞在相应的变性梯度位置，经染色后可以在凝胶上呈现为分散的条带。理论上DGGE技术可以分辨只有一个碱基差异的基因序列。因此在一块DGGE胶板上，与DGGE标准条带中某一个条带具有相同迁移距离的条带即可大致认为属于同一序列。在DGGE指纹图谱的基础上，制备大曲发酵过程中常见细菌的DGGE标准条带，并将其应用于发酵过程中微生物种群的定性检测，可直观地看出优势菌群动态变化，使用方便快捷，并且可以避免重复测序带来的时间和经费的浪费，具有一定的市场价值。
[0004]本发明利用PCR-DGGE技术监测大曲发酵过程中优势微生物菌群的变化，其方法是，先制作一种优势细菌标准条带(即DGGE标准条带)，然后从生产过程中的大曲提取优势细菌DGGE条带，和上述标准条带进行比较，如果吻合说明可以保证质量，如果不吻合，通过调整微生物的量或调整工艺方法，使达到吻合，从而保证生产出的白酒质量均一，有利于白酒质量的稳定。此方法克服了传统的开放式发酵中完全依靠经验，无法严格保证微生物的重复性，也无法抑制有害微生物的弊端。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种大曲DGGE优势细菌标准条带的制备方法。本发明还提供一种该大曲DGGE优势细菌标准条带在发酵过程中优势菌群检测中的应用。该方法通过对大曲发酵过程中的细菌16S rDNA V3可变区DGGE指纹图谱进行分析，制备出优势细菌DGGE标准条带，从而使DGGE图谱分析方便快捷，避免重复测序带来的时间和经费的浪费。
[0006]具体的，本发明提供一种大曲细菌DGGE标准条带的制备方法，所述方法包括以下步骤:
[0007]步骤I，获得大曲发酵过程中的细菌DGGE图谱，确定大曲发酵过程中优势细菌；
[0008]步骤2，根据大曲中优势细菌，制备大曲细菌DGGE标准条带。
[0009]其中步骤I的方法如下:
[0010]I)选取大曲不同发酵阶段的合格样品；
[0011]2)提取微生物总DNA ；
[0012]3)以微生物总DNA为模板，在专用引物的引导下进行细菌16S rDNA V3可变区的PCR扩增；
[0013]4)对扩增后的产物进行变性梯度凝胶电泳，经SYBR Green I染色后得到DGGE图谱；
[0014]5)将图谱中的优势条带进行切胶回收，在专用引物的引导下进行PCR扩增，产物测序供微生物种群分析，确定优势细菌。
[0015]其中步骤2的方法如下:
[0016]I)取优势细菌所对应的DGGE条带，在专用引物的引导下进行PCR扩增；
[0017]2)将扩增产物等量混合，对其进行变性梯度凝胶电泳，经SYBR Green I染色，确定每种菌所代表的条带的相对位置，即得DGGE优势细菌标准条带。
[0018]步骤I中，
[0019]其中I)所述不同发酵阶段的合格样品，是指选取母曲、生曲、第一次翻仓大曲、第二次翻仓大曲、出仓曲共5种合格样品。
[0020]其中2)所述提取的微生物总DNA，是指分别提取母曲、生曲、第一次翻仓大曲、第二次翻仓大曲、出仓曲5种样品的微生物总DNA。
[0021]其中3)所述细菌16S rDNA V3可变区的PCR扩增使用巢式PCR扩增，以待测样品的微生物总DNA为模板，先加入第一步扩增引物和反应体系进行扩增，第一步扩增采用的引物为 16S1: 5，- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’ 和 16S2:5，- TACGGYTACCTTGTTACG ACTT-3’ ；取其产物作为模板，加入第二步扩增引物进行扩增，第二步扩增采用的引物为:R518:5，-ATTACCGCGGCTGCTGG-3，和 338F-GC:5，-CGCCCGCCG CGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，。
[0022]其中4)所述得到的DGGE图谱，是指一次发酵生产过程，共得到5种样品的DGGE图谱。所述变性梯度凝胶电泳，方法是:采用10%变性聚丙烯酞胺凝胶电泳进行分离，变性剂浓度30-60%，电泳缓冲液采用1XTAE，电压100V，时间10h。
[0023]其中5 )所述的专用引物如下:338F: 5 ’ -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3 ’ 和 R518:5’ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3’，扩增产物进行测序，所得序列在NCBI上与已登陆序列进行比对，从而确定微生物种群。
[0024]步骤2中，
[0025]其中I)所述优势细菌所对应的DGGE条带，是指母曲、生曲、第一次翻仓大曲、第二次翻仓大曲、出仓曲5种样品DGGE图谱中的优势细菌所对应的条带，所述专用引物如下:R518:5，-ATT ACCGCGGCTGCTGG-3’ 和 338F-GC:5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTA CGGGAGGCAGCAG-3，。
[0026]其中2)所得DGGE优势细菌标准条带包含16个条带，指示13种细菌。见图1。
[0027]本发明还提供一种按照上述方法制备的大曲细菌DGGE标准条带，及其在发酵过程中优势菌群检测中的应用。
[0028]该应用步骤如下:
[0029]I)取发酵阶段合格待测样品，按照上述步骤I的方法制备待测样品16S rDNA V3可变区PCR产物，并与大曲细菌DGGE标准条带点样于同一块DGGE胶上；
[0030]2)根据DGGE图谱样品条带与DGGE标准条带的对比，进行细菌种群鉴定；
[0031]3)切胶回收与DGGE标准条带中条带具有相同迁移距离的条带，通过测序，验证其适用性。
[0032]测序结果表明，具有相同迁移距离的条带间序列相似度达100%，表明该DGGE标准条带具有重复性和实用性。
[0033]经过数批实验证明，该DGGE标准条带的应用方便快捷，并且具有相当好的重复性。DGGE标准条带的使用不仅可以快速方便地指示出常见菌群的存在与否，直观地看出菌群动态变化，而且也可避免重复测序带来的时间和经费的浪费。
[0034]本发明的优点在于:
[0035]1、细菌DGGE标准条带的应用可直观地指示所测大曲样品中优势细菌的存在与否及其动态变化。
[0036]2、将细菌DGGE标准条带应用于发酵过程中细菌种群的鉴定，可以避免重复测序带来的时间和经费的浪费。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1 DGGE标准条带中包含的16个条带图及其分别代表的菌种
[0038]图2 DGGE标准条带的应用图(泳道1、2:母曲；泳道3、4:生曲；泳道5、6:第一次翻仓大曲；泳道M=DGGE标准条带；泳道7、8、9:第二次翻仓大曲；泳道10、11:出仓曲)
【具体实施方式】
[0039] 通过以下具体实施例对本发明做进一步说明，但不作为对本发明的限制。
[0040]实施例1大曲DGGE标准条带的制备
[0041]一、获得大曲发酵过程中的细菌DGGE图谱，确定大曲发酵过程中优势细菌。
[0042]1)选取大曲不同发酵阶段的合格样品。
[0043]在大曲发酵过程中分别选取母曲、生曲、第一次翻仓大曲、第二次翻仓大曲及出仓曲作为研究样品。
[0044]2)提取微生物总DNA。
[0045]提取方法是:分别称取0.4g母曲、生曲、第一次翻仓大曲、第二次翻仓大曲及出仓曲样品，分别加入200mg左右的玻璃珠，使用OMEGA soil DNA提取试剂盒对5种样品进行总DNA的提取。加入1000ul SLX溶液，高速蜗旋5min混合均匀，加入100ul DS溶液，蜗旋混合。70°C水浴IOmin,期间快速混合样品一次,5000rpm室温离心3min,上清移至新的离心管，加入270ul SP2溶液，混合均匀，冰浴5min，13000g 4°C离心5min。上清转移至新的离心管中，加入0.7倍异丙醇，颠倒混匀，-20°C静止一个小时。13000g离心10min，弃去上清，倒置于吸水纸上干燥，加入200ul Elution Buffer到离心管中，混匀，65°C水浴20min溶解DNA。加入80ul HTR溶液，混合均匀，室温放置2min，13000g离心2min，将上清转移至新的离心管中。如果上清依旧带有深色物质，则重复加入HTR溶液处理。加入等体积的XP2溶液，充分混合均匀之后将所有溶液转移到HiBind DNA柱子中，1000Og离心lmin，弃去流出液重新使用收集管。加入300ul XP2溶液，1000Og离心lmin，弃去流出液和收集管，把柱子放入一个新的收集管中，加入700ul经无水乙醇稀释过的SPW wash溶液，1000Og离心lmin,弃去流出液重新使用收集管，再用700ul SPff wash溶液洗一次，弃去液体，把柱子插入空的收集管中，13000g离心2min，将柱子取出敞开盖放置，使乙醇挥发，避免其影响下一步操作。将柱子放到新的离心管中，在柱子中心加入50ul Elution Buffer, 65°C水浴lOmin, 13000g离心lmin。将离心洗脱液重新加入柱子中心，65°C水浴lOmin, 13000g离心lmin,所得洗脱液即为提取好的微生物总DNA。
[0046]3)以微生物总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增。
[0047]在得到待测样品的总DNA后，根据现有技术进行PCR扩增。细菌16S rDNAV3可变区的PCR扩增使用巢式PCR扩增方法，先加入第一步扩增引物和反应体系进行扩增，第一步扩增采用的引物为16S1:5’ - AGAGTTTGATCCTGGCTC AG -3’和16S2:5’- TACGGYTACCTTGTTACGACTT -3’ ；PCR 反应条件为:94 °C 预变性 4 min，然后 94°C 变性45s，50~55°C引物复性45s，72°C引物延伸lmin30s，循环30次，72 °C终延伸10 min。取其产物作为模板，加入第二步扩增引物进行扩增，第二步扩增采用的引物为:R518:5，-ATTACCGCGGCTGCTGG-3，和 338F-GC:5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGA CTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’ ;PCR 反应条件为:94°C 预变性 4min，然后 94°C 变性 45s，50^55 °C引物复性45s，72°C引物延伸lmin30s，循环30次，72°C终延伸10 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为IXTAE缓冲液。
[0048]4)对PCR产物进行变性梯度凝胶电泳，SYBR Green I染色得到DGGE图谱。
[0049]采用DC0DE?系统(BIO-RAD)构建DGGE指纹图谱，具体方法为:获得的5种样品16S rDNA V3可变区扩增产物(约200bp)，分别取适量(200ng)用10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离(变性剂浓度30~60%，电泳缓冲液I X TAE, 100V, IOh),然后用SYBR Green I对变性聚丙烯酰胺凝胶染色，用Quantity One凝胶成像扫描系统对DGGE胶进行照像，得到5种样品的细菌DGGE图谱。
[0050]5) DGGE切胶回收优势条带，在专用引物的引导下进行PCR扩增，产物测序供微生物种群分析。
[0051]切下的DGGE条带放入无菌的离心管中捣碎，加入4(T50ul IXTE缓冲液，贮存于-20°C，作为接下来的PCR反应的模板。在专用引物的引导下进行PCR扩增，产物测序供微生物种群分析。专 用引物如下:R518:5’ -ATTACCGCGGCTG CTGG-3，和338F:5’ -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’。PCR 反应条件为:94°C预变性 4 min，然后 94°C变性 45s，50~55°C引物复性45s，72°C引物延伸lmin30s，循环30次，72°C终延伸IOmin ;PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为IXTAE缓冲液。其中所述的将获得的PCR产物送测序，序列在NCBI (www.ncb1.nlm.nih.gov)上与已登陆序列进行比对,从而确定微生物种群。[0052]二、根据大曲中优势细菌，制备大曲细菌DGGE标准条带。
[0053]I)选取常见的优势细菌所对应的DGGE条带，在专用引物的引导下进行PCR扩+?
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[0054]专用引物如下:R518:5’ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3’ 和 338F-GC:5’ -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’。PCR 反应条件为:94°C 预变性 4min，然后94°C变性45s，50~55°C引物复性45s，72°C引物延伸lmin30s，循环30次，72°C终延伸10 min ;PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为IXTAE缓冲液。
[0055]2)将扩增出的PCR产物等量混合，制备DGGE标准条带，通过再次变性梯度凝胶电泳确定每个条带在标准条带中的相对位置。
[0056]该DGGE标准条带中包含的16个条带，指示13种细菌。见图1。
[0057]实施例2大曲DGGE标准条带在大曲发酵过程中微生物种群的鉴定
[0058]I)在发酵阶段微生物种群的定性检测中，分别取母曲、生曲、第一次翻仓大曲、第二次翻仓大曲及出仓曲5种样品作为待测样品，待测样品16S rDNA V3可变区的PCR扩增使用巢式PCR扩增，具体方法同前。DGGE标准条带的扩增PCR反应条件为:以挑选的常见优势细菌所对应的DGGE条带为模板，94°C预变性4 min，然后94°C变性45s，5(T55°C引物复性45s，72°C引物延伸lmin30s，循环30次，72°C终延伸IOmin ;PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳缓冲液为IXTAE缓冲液。专用引物如下:R518:5’ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3， 和 338 F- GC:5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’。将制备好的样品16S rDNA V3可变区PCR产物与大曲细菌DGGE标准条带点样于同一块DGGE胶上。电泳结果见图2。
[0059]2)根据DGGE图谱样品条带与DGGE标准条带的对比，进行细菌种群鉴定。
[0060]根据DGGE胶上条带的电泳终点位置进行细菌种群鉴定。由于DGGE技术主要根据DNA序列因GC含量的不同，而在变性梯度凝胶中形成不同程度的解链，停滞在相应的变性梯度位置，经染色后可以在凝胶上呈现为分散的条带。理论上DGGE技术可以分辨只有一个碱基差异的基因序列。因此在一块DGGE胶板上，与DGGE标准条带中某一个条带具有相同迁移距离的条带即可大致认为属于同一序列。经过数批实验，证实该DGGE标准条带的应用方便快捷，并且具有相当好的重复性。DGGE标准条带的使用不仅可以快速方便地指示出常见菌群的存在与否，直观地看出菌群动态变化，而且也可避免重复测序带来的时间和经费的浪费。
[0061 ] 3 )验证DGGE标准条带。
[0062] 切下与DGGE标准条带中条带具有相同迁移距离的条带，通过测序，验证其适用性。测序结果表明，具有相同迁移距离的条带间序列相似度达100%，表明该DGGE标准条带具有重复性和实用性。
【权利要求】
1.一种大曲细菌DGGE标准条带制作方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: 步骤I，获得大曲发酵过程中的细菌DGGE图谱，确定大曲发酵过程中优势细菌； 步骤2，根据大曲中优势细菌，制备大曲细菌DGGE标准条带。
2.根据权利要求1的制作方法，其特征在于，其中步骤I的方法如下: 1)选取大曲不同发酵阶段的合格样品； 2)提取微生物总DNA； 3)以微生物总DNA为模板，在专用引物的引导下进行细菌16SrDNA V3可变区的PCR扩增； 4)对扩增后的产物进行变性梯度凝胶电泳，经SYBRGreen I染色后得到DGGE图谱； 5)将图谱中的优势条带进行切胶回收，在专用引物的引导下进行PCR扩增，产物测序供微生物种群分析，确定优势细菌。
3.根据权利要求1的制作方法，其特征在于，其中步骤2的方法如下: 1)取优势细菌所对应的DGGE条带，在专用引物的引导下进行PCR扩增； 2)将扩增产物等量混合，对其进行变性梯度凝胶电泳，经SYBRGreen I染色，确定每种菌所代表的条带的相对位置，即得DGGE优势细菌标准条带。
4.根据权利要求2的制作方法，其特征在于，其中I)所述不同发酵阶段的合格样品，是指选取母曲、生曲、第一次翻仓大曲、第二次翻仓大曲、出仓曲共5种合格样品；其中2)所述提取的微生物总DNA，是指分别提取母曲、生曲、第一次翻仓大曲、第二次翻仓大曲、出仓曲5种样品的微生物总DNA。
5.根据权利要求2的制作方法，其特征在于，其中3)所述细菌16SrDNA V3可变区的PCR扩增使用巢式PCR扩增，以待测样品的微生物总DNA为模板，先加入第一步扩增引物和反应体系进行扩增，第一步扩增采用的引物为16S1:5’ - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和16S2:5’- TACGGYTACCTTGTTACGAC TT -3’ ;取其产物作为模板，加入第二步扩增引物进行扩增，第二步扩增采用的引物为:R518:5’ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3’和338F-GC:5，-CGCCCGCCG CGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，。
6.根据权利要求2的制作方法，其特征在于，其中4)所述变性梯度凝胶电泳，方法是:采用10%变性聚丙烯酞胺凝胶电泳进行分离，变性剂浓度30-60%，电泳缓冲液采用1XTAE，电压 100V，时间 IOh0
7.根据权利要求2的制作方法，其中，5)所述的专用引物如下:338F:5’ -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’ 和 R518:5’ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3’，扩增产物进行测序，所得序列在NCBI上与已登陆序列进行比对，从而确定微生物种群。
8.根据权利要求3的制作方法，其特征在于，其中I)所述优势细菌所对应的DGGE条带，是指母曲、生曲、第一次翻仓大曲、第二次翻仓大曲、出仓曲5种样品DGGE图谱中的优势细菌所对应的条带，所述专用引物如下:R518:5’ -ATT ACCGCGGCTGCTGG-3’和338F-GC:5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCG GGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，。
9.根据权利要求3的制作方法，其特征在于，制得的DGGE优势细菌标准条带中共包含16个条带,指示13种细菌。
10.根据权利要求1的制作方法制作的大曲DGGE优势细菌标准条带。
11.根据权利要求1的方法制作的大曲DGGE优势细菌标准条带，其在发酵过程中优势菌群检测中的应用，所述应用步骤如下: 1)取发酵阶段合格 待测样品，按照步骤I的方法制备待测样品16SrDNA V3可变区PCR产物，并与大曲DGGE优势细菌标准条带点样于同一块DGGE胶上； 2)根据DGGE图谱样品条带与大曲DGGE优势细菌标准条带的对比，进行细菌种群鉴定; 3)切胶回收与大曲DGGE优势细菌标准条带中具有相同迁移距离的条带，通过测序，验证其适用性。
【文档编号】C12Q1/68GK103898201SQ201210584368
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月28日 优先权日:2012年12月28日
【发明者】李长文, 山其木格, 梁慧珍, 张长霞, 陈丽君, 李巍, 刘冰 申请人:贵州国台酒业有限公司