专利名称：一种磷酸肌酸钠的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种利用基因工程技术制备磷酸肌酸钠的方法。
背景技术：
磷酸肌酸是肌肉或其他兴奋性组织(如脑和神经)中由肌酸与磷酸组成的一种高能磷酸化合物，其高能特性使其成为运动补剂，广泛被运动员使用。另外，磷酸肌酸钠作为心肌细胞保护剂和能量供给物，用于心肌缺血、心衰等辅助性治疗，或应用于临床外科手术之中，其临床疗效确切，安全性高。磷酸肌酸钠最先由欧辉制药厂开发并于1992年在意大 利上市，1995年进口至我国。目前，国内生产磷酸肌酸钠的工艺路线有化学法和生物法(酶法)。化学合成方法分为钡盐工艺和无钡盐工艺。钡盐工艺采用三氯氧磷、硫酸钡和肌酸合成(哈尔滨理工大学学报，2004年，9卷04期，124页-126页)。无钡盐工艺如US3036087以亚磷酸二苄酯及甲基异硫脲为原料，经多步化学反应生成磷酸肌酸钠。无论是钡盐工艺或是无钡盐工艺，化学合成法反应步骤复杂条件苛刻，而且大量使用酸碱、有毒有害化工原料(如钡盐、氯化汞等)和有机溶剂，不仅增加了注射药物使用的安全隐患，而且不可避免的对环境造成巨大破坏。生物法分为生物组织提取法和基因工程法，前者是从动物肌肉中提取肌酸激酶，以肌酸和三磷酸腺苷为底物反应生成磷酸肌酸钠。基因工程法是用基因工程方法重组构建含有肌酸激酶的大肠杆菌工程菌株；利用该工程菌株进行大规模高密度培养并分离纯化，得到高活性的肌酸激酶；利用肌酸激酶在合适的条件下进行酶法催化合成，得到磷酸肌酸钠。现行生物组织提取法以动物肌肉组织为原料提取肌酸激酶，由于肌肉中该酶含量较低，且缺乏特异性纯化方法，使得产品成本过高且产品中杂蛋白去除困难。此外，酶催化反应过程中ATP的大量消耗和一次性投入的方式，亦增加了产品的成本。现行基因工程法是用基因工程方法重组构建含有肌酸激酶的大肠杆菌工程菌株，由于合成磷酸肌酸钠时，需要额外再添加ATP且采用一次性投入，产品成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种磷酸肌酸钠的制备方法。所述方法是利用基因工程技术分别构建肌酸激酶和乙酸激酶表达菌株，解除肌酸激酶的动物来源限制，利用亲和纯化技术特异性纯化肌酸激酶和乙酸激酶，将肌酸激酶和乙酸激酶共固定至载体颗粒上，形成共固定化酶，在肌酸激酶催化生成磷酸肌酸钠的同时，乙酸激酶不断再生ATP用以持续反应，最终提供成本低廉、绿色无污染的磷酸肌酸钠。本发明制备的磷酸肌酸钠盐化合物如(I)所示
权利要求
1.一种制备磷酸肌酸钠的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(O分别构建肌酸激酶和乙酸激酶表达菌株，诱导表达并进行破碎处理；(2)采用特异性金属螯合亲和纯化方法制备高纯度的肌酸激酶和乙酸激酶；(3)将肌酸激酶和乙酸激酶共固定至载体颗粒上，形成共固定化酶；(4)共固定化酶催化反应生成磷酸肌酸钠；(5)离子交换树脂分离纯化磷酸肌酸钠。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)为分别合成肌酸激酶基因和乙酸激酶基因，将肌酸激酶基因和乙酸激酶基因分别连至克隆载体上，转化大肠杆菌，筛选得到正确的克隆载体，并分别构建含肌酸激酶基因和乙酸激酶基因的表达载体，然后分别将这两种重组载体通过化学转化或电转化的方式转入表达型大肠杆菌，构建表达型大肠杆菌重组菌，诱导表达并进行破碎处理；其中，所述肌酸激酶基因是兔肌肉型、兔脑型、牛线粒体型、人杂化型或人线粒体型的肌酸激酶基因；所述乙酸激酶基因是反刍月形单胞菌K6、埃氏巨型球菌、保加利亚乳杆菌或者 Marinithermus hydrothermal is DSM14884 的乙酸激酶基因；所述克隆载体为pBluescript系列或pUC19 ;所述表达载体为pET22、pET28、pET15或 pET43 ；所述大肠杆菌为DH5 a、ToplO或JM109 ;所述表达型大肠杆菌为BL21 (DE3)。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述肌酸激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述乙酸激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)为利用特异性金属螯合亲和层析柱纯化破碎的大肠杆菌重组菌菌液，菌液以25-45BV/h的流速过柱，以30-50BV/h流速洗脱，洗脱液经除盐处理后得到纯化的肌酸激酶和乙酸激酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)为将纯化后的肌酸激酶、乙酸激酶与固定化载体颗粒按1000-5000U: 1200-6800U:50-250g比例进行混合，进行固定化反应，固定化过程中加入硫酸铵固体粉末至终浓度250-350mM，固定化温度为15-35°C，时间为10-50h,固定化过程中控制pH值为5. 5-6. 5。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述固定化载体颗粒为环氧型树脂。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)为配制共固定化酶催化反应的反应物溶液，所述反应物溶液中ATP浓度为10-50mM，肌酸浓度为ATP浓度的1_5倍，镁离子浓度为ATP浓度的1-5倍，乙酰磷酸浓度为ATP浓度的1-5倍，加入缓冲体系使反应物溶液的PH值为8-10，再加入100-500g的共固定化酶颗粒，催化反应的温度为25-45°C，反应过程中不断滴入稀碱以维持PH在8. 0-9. O,当反应溶液的pH值不再变化时停止反应，筛网过滤分离共固定化酶颗粒和反应后的溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述缓冲体系为Gly-NaOH缓冲体系或 Na2B4O7-NaOH 缓冲体系。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)为将离子交换树脂填装层析柱， 步骤(4)反应后的溶液以6-10BV/h的流速过柱，以6-10BV/h的流速洗脱。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述树脂为AmberliteIRA900, D201,D301树脂中的一种。·
全文摘要
本发明涉及一种利用基因工程技术制备磷酸肌酸钠的方法。所述方法是利用基因工程技术分别构建肌酸激酶和乙酸激酶表达菌株，解除肌酸激酶的动物来源限制，利用亲和纯化技术特异性纯化肌酸激酶和乙酸激酶，将肌酸激酶和乙酸激酶共固定至载体颗粒上，形成共固定化酶，在肌酸激酶催化生成磷酸肌酸钠的同时，乙酸激酶不断再生ATP用以持续反应，最终提供成本低廉、绿色无污染的磷酸肌酸钠。
文档编号C12P13/00GK103014083SQ20121059097
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者许岗, 黄斌, 吴峰, 曾红宇 申请人:湖南宝利士生物技术有限公司