一种分枝杆菌增菌液及其制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于微生物培养【技术领域】，具体涉及一种分枝杆菌增菌液及其制备方法及应用。该分枝杆菌增菌液包括肉汤、脑心浸液肉汤、生物素、甘油、聚茴香脑磺酸钠、吐温80、牛血清蛋白、油酸和蒸馏水，其经过称取原料、原料混合、调节pH值、灭菌、称取生物素和牛血清蛋白、过滤除菌及无菌原料混合的步骤制备而成。本发明中分枝杆菌增菌液对分枝杆菌培养需时较短，能够简易检测分枝杆菌的生长状况，并且检测周期短、阳性检出率高，能够有效对临床血标本中分枝杆菌进行分离和培养。
【专利说明】一种分枝杆菌增菌液及其制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物培养【技术领域】，具体涉及一种分枝杆菌增菌液及其制备方法及 应用。
【背景技术】
[0002] 20世纪80年代后，全球感染结核杆菌的病例逐年上升。根据WHO统计数据，2011 年，140万人死于结核病，非洲人均死亡率最高。耐多药结核病是一个主要威胁，对结核病患 者的护理始于有质量保证的诊断，通过临床标本中结核分枝杆菌的生长和鉴定及对生物体 药敏测试来确认或排除耐药性。由于诊断治疗延误及不规范用药导致出现多重耐药菌株， 直接威胁结核病患者的生命，因此扩大结核病和耐多药结核病的诊断能力是全球结核病控 制的重点。WHO报告指出采用快速诊断制剂并相应加强实验室能力是国内国际资金应投入 的四个重点领域之一。
[0003] 分枝杆菌为专性需氧菌，营养要求较高且不宜吸收营养物质，生长缓慢，所以结核 分枝杆菌的增菌培养在临床检验中关键步骤之一。传统的分枝杆菌固体培养基由于营养成 分需要扩散到表面才能被分枝杆菌吸收利用，对分枝杆菌培养需时较长；随后出现的液体 培养基，在一定程度上缩短了培养时间，却不能简易检测分枝杆菌的生长状况。传统的分枝 杆菌标本分离培养方法简单、经济，易于推广使用，但存在着检测周期长、阳性检出率低等 缺点。如何快速检测结核分枝杆菌已成为该领域中迫切需要解决的课题。
【发明内容】
[0004] 为解决上述现有技术的不足，本发明提供一种分枝杆菌增菌液及其制备方法及应 用，该增菌液可用于分离和培养分枝杆菌，且能够快速检测结核分枝杆菌。
[0005] -种分枝杆菌增菌液，包括肉汤0. 47-0. 60份、脑心浸液肉汤0. 5-1. 0份、生物素 0. 0001-0. 0003份、甘油0. 25-0. 63份、聚茴香脑磺酸钠 0. 01-0. 03份、吐温80为0. 01-0. 03 份、牛血清蛋白0. 5-1. 0份、油酸0. 05-0. 10份、蒸馏水100份。
[0006] 上述方案优选的是，所述肉汤为Middlebrook 7H9肉汤。
[0007] 上述任一方案优选的是，肉汤0. 47份、脑心浸液肉汤0. 5份、生物素 0. 0002份、甘 油0. 252份、聚茴香脑磺酸钠 0. 02份、吐温80为0. 02份、牛血清蛋白0. 5份、油酸0. 06份、 蒸馏水100份。
[0008] 上述任一方案优选的是，还包括0. 10-0. 125份的胰蛋白胨和/或酪蛋白水解物。
[0009] 上述任一方案优选的是，所述胰蛋白胨和/或酪蛋白水解物为0. 12份。
[0010] 一种分枝杆菌增菌液的制备方法，包括如下步骤： (1) 称取原料：取肉汤〇. 47-0. 60份、脑心浸液肉汤0. 5-1. 0份、甘油0. 25-0. 63份、聚 茴香脑磺酸钠〇. 01-0. 03份、吐温80为0. 01-0. 03份、油酸0. 05-0. 10份均放置在灭菌后 的容器中； (2) 原料混合：向步骤（1)中的容器中加入蒸馏水80份，并用玻璃棒搅拌容器中的混合 物，使混合物均匀混合； (3) 调节pH值：向步骤（2)中的混合物中加入NaOH溶液和/或HCl溶液调节pH值，使 混合物的pH值达到7. 0-7. 2 ; (4) 灭菌：将步骤（3)中调节pH值后的混合物进行湿热灭菌，灭菌后冷却至室温； (5) 称取生物素和牛血清蛋白：取0. 0001-0. 0003份的生物素和0. 5-1. 0份的牛血清 蛋白放入灭菌后的容器中，然后向容器中加入20份的蒸馏水，并用玻璃棒搅拌，使生物素 和牛血清蛋白溶解在蒸馏水中，形成混合溶液； (6) 过滤除菌：将步骤（5)中的混合溶液经无菌滤膜过滤除菌，此过程为无菌操作； (7) 无菌原料混合：将步骤（6)中的除菌后的混合溶液加入到步骤（4)中湿热灭菌后的 混合物中，此过程为无菌操作。
[0011] 上述方案优选的是，步骤（1)中肉汤〇. 47份、脑心浸液肉汤0. 5份、甘油0. 25份、 聚茴香脑磺酸钠〇. 02份、吐温80为0. 02份、油酸0. 06份。
[0012] 上述任一方案优选的是，步骤（1)中所述原料还包括0. 10-0. 125份的胰蛋白胨和 /或酪蛋白水解物。
[0013] 上述任一方案优选的是，胰蛋白胨和/或酪蛋白水解物为0. 12份。
[0014] 上述任一方案优选的是，步骤（2)中所述NaOH溶液的摩尔浓度为0· I mol/1。
[0015] 上述任一方案优选的是，步骤（2)中所述HCl溶液的摩尔浓度为0. I mol/1。
[0016] 上述任一方案优选的是，步骤（4)中所述湿热灭菌温度为115-121°C，所述湿热灭 菌时间为15-20分钟。
[0017] 上述任一方案优选的是，步骤（4)中所述湿热灭菌温度为121°C，所述湿热灭菌时 间为20分钟。
[0018] 上述任一方案优选的是，步骤（5)中所述生物素为0. 0002份。
[0019] 上述任一方案优选的是，步骤（5)中所述牛血清蛋白为0.5份。
[0020] 上述任一方案优选的是，步骤（6)中所述无菌滤膜的孔径为0· 20-0. 45 μ m。
[0021] 上述任一方案优选的是，所述无菌滤膜的孔径为0. 22 μ m。
[0022] 上述任一方案优选的是，所述容器为烧杯或烧瓶等。
[0023] 上述任一方案优选的是，所述肉汤为Middlebrook 7H9肉汤。
[0024] -种由上述任一分枝杆菌增菌液的制备方法制备的分枝杆菌增菌液。
[0025] 上述任一种分枝杆菌增菌液分离和/或培养和/或检测分枝杆菌过程的应用。
[0026] 本发明中分枝杆菌增菌液与分枝杆菌血液培养瓶配合使用，可快速检测结核分枝 杆菌。该增菌液中：肉汤、脑心浸液肉汤、胰蛋白胨为分枝杆菌的生长提供丰富的营养，生物 素、牛血清蛋白、油酸作为分枝杆菌生长刺激因子，甘油和吐温80作为分枝杆菌生长所需 要的保护剂，抗凝剂聚茴香脑磺酸钠可有效中和溶菌酶、抑制吞噬细胞以及使某些氨基糖 苷类抗生素失活，使微生物更好地生长。本发明中分枝杆菌增菌液对分枝杆菌培养需时较 短，能够简易检测分枝杆菌的生长状况，并且检测周期短、阳性检出率高，能够有效对临床 血标本中分枝杆菌进行分离和培养。
[0027] 本发明中术语说明： 本发明中所述肉汤和脑心浸液肉汤为不同的物质，所述肉汤包含磷酸二氢钾、磷酸氢 二钠、谷氨酸钠、柠檬酸钠、硫酸铵、吡哆醇、枸橼酸铁铵、硫酸镁、硫酸锌、硫酸铜、生物素、 氯化钙等，而不包含脱水小牛脑浸液、脱水牛心浸液；而脑心浸液肉汤包含有脱水小牛脑浸 液、脱水牛心浸液等成分。
[0028] 本发明中，所述生物素即为维生素 H，所述油酸即为顺-9-十八碳烯酸。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 图1是按照本发明的分枝杆菌增菌液的制备方法的一优选实施例的流程图。
【具体实施方式】
[0030] 为了进一步了解本发明，下面结合具体实施例对本发明作更为详细的描述，实施 例只对本发明具有示例性作用，而不具有任何限制性的作用；任何本领域技术人员在本发 明的基础上作出的非实质性修改，都应属于本发明保护的范围。
[0031] 实施例1 一种分枝杆菌增菌液，包括Middlebrook 7H9肉汤0. 47份、脑心浸液肉汤0. 5份、生 物素0. 0002份、甘油0. 25份、聚茴香脑磺酸钠0. 02份、吐温80为0. 02份、牛血清蛋白0. 5 份、油酸〇. 06份、蒸馏水100份。
[0032] 在本实施例中，还包括0. 12份的胰蛋白胨。
[0033] 上述分支杆菌增菌液的制备方法为(如图1所示）： (1) 称取原料：取Middlebrook 7H9肉汤0.47份、脑心浸液肉汤0.5份、甘油0.252份、 聚茴香脑磺酸钠〇. 02份、吐温80为0. 02份、油酸0. 06份、胰蛋白胨0. 12份均放置在烧杯 中； (2) 原料混合：向步骤（1)中的容器中加入蒸馏水80份，并用玻璃棒搅拌烧杯中的混合 物，使其均匀混合； (3) 调节pH值：步骤（2)中的混合物用NaOH溶液和HCl溶液调节pH值，使混合物的 pH值达到7. 0 ; (4) 灭菌：将步骤（3)中调节pH值后的混合物进行湿热灭菌，灭菌后冷却至室温； (5) 称取生物素和牛血清蛋白：取0. 0002份的生物素和0. 5份的牛血清蛋白放入灭菌 后的空烧杯中，然后向容器中加入20份的蒸馏水，并用玻璃棒搅拌，使生物素和牛血清蛋 白溶解在蒸馏水中，形成混合溶液； (6) 过滤除菌：将步骤（5)中的混合溶液经无菌滤膜过滤除菌，此过程为无菌操作； (7) 将步骤（6)中的除菌后的混合溶液加入到步骤（4)中湿热灭菌后的混合物中，此过 程为无菌操作。
[0034] 在本实施例中，步骤（2)中所述NaOH溶液的摩尔浓度为0. I mol/1 ;所述HCl溶液 的摩尔浓度为〇· I mol/1。
[0035] 在本实施例中，步骤（4)中所述湿热灭菌温度为121°C，所述湿热灭菌时间为20分 钟。
[0036] 在本实施例中，步骤（6)中所述无菌滤膜的孔径为0. 22 μ m。
[0037] 本实施例中，所述肉汤为Middlebrook 7H9肉汤(购买于美国BD公司）。
[0038] 用上述培养基分别培养胞内分枝杆菌ATCC 13950和卡介苗，并分析这两种菌的 生长情况。
[0039] 试验方法如下： (1) 将胞内分枝杆菌ATCC 13950的菌悬液I. 0 X l〇7ml，稀释100万倍，在分枝杆菌 增菌液和苏通氏培养基内各接种lml，置于37 °C培养观察试验结果； (2) 将卡介苗的菌悬液1.0 X 108/ml，稀释100万倍，在分枝杆菌增菌液和苏通氏培养 基内各接种lml，置于37 °C培养观察试验结果； 实验结果如表1 :
【权利要求】
1. 一种分枝杆菌增菌液，包括肉汤0. 47-0. 60份、脑心浸液肉汤0. 5-1. 0份、生物素 0. 0001-0. 0003份、甘油0. 25-0. 63份、聚茴香脑磺酸钠0. 01-0. 03份、吐温80为0. 01-0. 03 份、牛血清蛋白0. 5-1. 0份、油酸0. 05-0. 10份、蒸馏水100份。
2. 如权利要求1所述的分枝杆菌增菌液，其特征在于，所述肉汤0. 47份、脑心浸液肉 汤0. 5份、生物素0. 0002份、甘油0. 252份、聚茴香脑磺酸钠0. 02份、吐温80为0. 02份、 牛血清蛋白0. 5份、油酸0. 06份、蒸馏水100份。
3. 如权利要求1或2所述的分枝杆菌增菌液，其特征在于，还包括0. 10-0. 125份的胰 蛋白胨和/或酪蛋白水解物。
4. 如权利要求3所述的分枝杆菌增菌液，其特征在于，所述胰蛋白胨和/或酪蛋白水解 物为0. 12份。
5. 如权利要求1所述的分枝杆菌增菌液，其特征在于，所述肉汤为Middlebrook 7H9 肉汤。
6. -种分枝杆菌增菌液的制备方法，包括如下步骤： (1) 称取原料：取肉汤〇. 47-0. 60份、脑心浸液肉汤0. 5-1. 0份、甘油0. 25-0. 63份、聚 茴香脑磺酸钠〇. 01-0. 03份、吐温80为0. 01-0. 03份、油酸0. 05-0. 10份均放置在灭菌后 的容器中； (2) 原料混合：向步骤（1)中的容器中加入蒸馏水80份，并用玻璃棒搅拌容器中的混合 物，使混合物均匀混合； (3) 调节pH值：向步骤（2)中的混合物中加入NaOH溶液和/或HC1溶液调节pH值，使 混合物的pH值达到7. 0-7. 2 ; (4) 灭菌：将步骤（3)中调节pH值后的混合物进行湿热灭菌，灭菌后冷却至室温； (5) 称取生物素和牛血清蛋白：取0. 0001-0. 0003份的生物素和0. 5-1. 0份的牛血清 蛋白放入灭菌后的容器中，然后向容器中加入20份的蒸馏水，并用玻璃棒搅拌，使生物素 和牛血清蛋白溶解在蒸馏水中，形成混合溶液； (6) 过滤除菌：将步骤（5)中的混合溶液经无菌滤膜过滤除菌，此过程为无菌操作； (7) 无菌原料混合：将步骤（6)中的除菌后的混合溶液加入到步骤（4)中湿热灭菌后的 混合物中，此过程为无菌操作。
7. 如权利要求6所述的分枝杆菌增菌液的制备方法，其特征在于，步骤（1)中所述肉汤 0. 47份、脑心浸液肉汤0. 5份、甘油0. 25份、聚茴香脑磺酸钠0. 02份、吐温80为0. 02份、 油酸0.06份。
8. 如权利要求6所述的分枝杆菌增菌液的制备方法，其特征在于，步骤（1)中所述原料 还包括0. 10-0. 125份的胰蛋白胨和/或酪蛋白胰酶水解物。
9. 如权利要求8所述的分枝杆菌增菌液的制备方法，其特征在于，所述胰蛋白胨和/或 酪蛋白水解物为0. 12份。
10. -种由6-9中任一项所述的分枝杆菌增菌液的制备方法制备的分枝杆菌增菌液。
【文档编号】C12N1/20GK104419653SQ201310384401
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月29日 优先权日:2013年8月29日
【发明者】张敏, 王娜, 杨伟伟 申请人:山东鑫科生物科技股份有限公司