一种减少l-丝氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌syps-062代谢副产物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种减少L-丝氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062代谢副产物的方法。本发明利用分子生物学技术顺次将L-丝氨酸脱氨酶（L-serinedeaminase）的编码基因sdaA，及L-丙氨酸和L-缬氨酸生物合成途径中的转氨酶编码基因alaT和ilvE在谷氨酸棒杆菌SYPS-062△S基因组顺序敲除，最终构建一株sdaA,alaT和ilvE组合敲除的重组菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062△S-Ⅲ。
【专利说明】一种减少L-丝氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062代谢副产物的方法
【技术领域】
[0001]发明涉及一种减少L-丝氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062代谢副产物的方法及其应用，属于工业生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]L-丝氨酸，化学名为α-氨基-β-羟基丙酸，分子式为C3H7NO3，分子量105.10。L-丝氨酸属于非必需氨基酸，具有许多重要的生理功能，在医药、食品、化妆品等领域具有较为广泛的应用。
[0003]L-丝氨酸是一种瓶颈氨基酸，近年来，虽然有很多关于L-丝氨酸生产方法的研究报告，但迄今为止尚缺乏较为经济、有效的工业化生产方法，我国至今没有实现产业化，产品需求主要依赖进口。2010年我国丝氨酸市场需求量为350吨，其中国内生产的20%基本采用水解天然蛋白质的方法，该方法操作费时，收率和产量低，成本高，不适合大规模的生产，同时存在较为严重的污染问题。因此，研究和开发发酵法生产L-丝氨酸的新菌种、新工艺对于打破日本等国长期以来在L-精氨酸等品种上的垄断具有十分重要的意义，也将进一步提升我国发酵法生产氨基酸的整体技术水平，完善我国氨基酸工业，调整药用氨基酸的产品结构，满足国内药用氨基酸市场需求。
[0004]目前，国内外生产L-丝氨酸的方法主要有化学合成法、蚕丝水解法、酶法、前体发酵法等生物法，但是利用糖质原料通过直接发酵法生产L-丝氨酸的报道较少。其中以甘氨酸为前体经丝氨酸羟甲基转移酶催化生产L-丝氨酸生产技术己经工业化，最近又开发了采用具有高活丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)的甲醇同化菌由甘氨酸生产L-丝氨酸的方法，日本主要以甘氨酸为前体发酵 生产L-丝氨酸，但前体物价格昂贵，生产成本高。国内主要以蚕丝水解法生产L-丝氨酸，即将废蚕丝、蚕蛹、丝胶水解，以提取L-丝氨酸；此法操作复杂，需处理大量的洗脱液，所得的氨基酸常为混合氨基酸，还需进一步分离、精制，不适合大规模的生产。因此，由于生产技术难度高，生产成本大，价格居高不下，严重限制了 L-丝氨酸的应用。
[0005]为了能够获得L-丝氨酸的高效生产菌株和简化下游产物的分离纯化工艺，在构建高产菌株的时候需要除了需要提高菌株目标产物生物合成途径的效率，还需考虑尽可能地减少代谢副产物的积累。谷氨酸棒杆菌是氨基酸生产的重要菌株，现已用于L-谷氨酸、L-赖氨酸和L-苏氨酸的氨基酸的工业化生产。江南大学药学院制药工程实验室从土壤中筛选到一株能够利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌SYPS-062，通过随机诱变筛选和代谢工程改造获得的重组菌株能够利用蔗糖发酵大量积累L-丝氨酸，但是发酵液中还存在有L-丙氨酸和L-缬氨酸两种代谢副产物。
[0006]谷氨酸棒杆菌中L-丝氨酸、L-丙氨酸和L-缬氨酸三种氨基酸是以丙酮酸为中心代谢物形成代谢物三角，见图1。L-丝氨酸通过L-丝氨酸脱氨催化其脱水脱氨生成丙酮酸，另外两种副产物L-丙氨酸和L-缬氨酸均是以丙酮酸为前体物质生物合成而来。L-丝氨酸向丙酮酸转化，一个方面是使得目标产物产量降低，产物丙酮酸积累会影响菌体生理特性的同时增加发酵液中L-丙氨酸和L-缬氨酸在的含量，两种氨基酸的积累不仅造成碳骨架和氮源的大量流失浪费，而且会增加下游产物的分离提取工艺的复杂性和影响中产物的纯度。
【发明内容】
[0007]本发明根据谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸的同时，发酵液中积累L-丙氨酸和L-缬氨酸两种代谢副产物。本发明的目的在于，采用基因工程手段将催化相关代谢反应的酶编码基因在基因组水平实现敲除，减少通过L-丝氨酸脱氨酶(L-serine deaminase)催化L-丝氨酸向丙酮酸转化，以及丙酮酸生物合成L-丙氨酸和L -缬氨酸的能力，提高主产物L-丝氨酸积累的同时降低副产物L-丙氨酸和L-缬氨酸的合成能力。
[0008]选择将L-丝氨酸脱氨酶(L-serine deaminase)的编码基因sdaA,以及L-丙氨酸和L-缬氨酸生物合成途径中的转氨酶编码基因和i7妨在谷氨酸棒杆菌SYPS-062AS基因组顺序敲除，最终构建一株S ?凡a 7a 和i 7妨共敲除的重组菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S-1II。
[0009]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
分别按照如下实验方案分别将和i7妨三个基因在基因组敲除，最终构建获得三重基因缺失的重组菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S-1II，具体构建过程如下:
(1)基因扩增:根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列信息，设计引物以谷氨酸棒杆菌SYPS-062 基因组DNA为模板，分别扩增目的基因上游序列和下游片段，通过交叉PCR的方法获得目的基因缺失的片段，再将该片段连接至PMD19-T，对目的基因序列进行测序验证，确证重组克隆质粒序列的准确性；
(2)重组敲除质粒的构建:将所述步骤(1)中的连接有目的片段的重组克隆质粒PMD19-T-供进行双酶切处理，将目的片段连接至相同双酶切处理的质粒pK19m0hsac凡转化至疋coli JM109感受态细胞，筛选验证阳性克隆；
(3)基因的重组整合:提取步骤(2)构建的用于目的基因整合修饰的重组质粒m^obsacB-geneX,电激转化至谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S及其系列衍生菌株感受态细胞，通过两次筛选获得成功敲除目的基因的重组菌株。
[0010](4)重组菌株的验证:利用引物通过PCR扩增验证重组菌株。
[0011]重复如上的实验，最终获得重组菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S-1II
(6)将重组菌谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Λ S及其系列衍生菌株Λ S-1, Δ S-1I和Λ S-1II进行摇瓶发酵实验，测定其L-丝氨酸的生产能力和副产物的积累情况，分别计算主副产物在占总产物的摩尔百分率。
[0012]本发明的优点和积极效果如下:
本发明以L-丝氨酸产生菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S为出发菌株，协调发酵液中主要的三种代谢产物L-丝氨酸、L-丙氨酸和L-缬氨酸的合成和降解之间关系。三种氨基酸是以丙酮酸作为中心的代谢三角关系，L-丝氨酸通过降解途径生成丙酮酸，丙酮酸通过代谢转化为L-丙氨酸和L-缬氨酸，为了实现降低主产物的L-丝氨酸的降解，减少副产物L-丙氨酸和L-缬氨酸的合成。对于菌体自身代谢来讲，使得菌体在满足对两种副产物氨基酸需求的前提下最大程度限制其生物合成，实现代谢流向L-丝氨酸生物合成途径的迁移，经济性利用碳骨架和氮源；从菌株理性代谢改造和下游产物的分离提取关联性看，在进行菌株改造时需要充分考虑下游分离纯化工艺过程，如代谢副产物对于产物的分离纯化工艺和成本的影响，在设计菌株改造方案时全面理性设计。
[0013]最终的重组菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S-3在发酵过程中能够防止L-丝氨酸通过转化为丙酮酸而降解，同时希望最大可能地减少副产物L-丙氨酸和L-缬氨酸的合成积累。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S以丙酮酸为中心的代谢物三角简图:_一步生物催化反应；》_多步生物催化反应；3-PG，三磷酸甘油酸；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸；L-Ser, L-丝氨酸；Pyr，丙酮酸；L_Ala，L-丙氨酸；L_Val，L-缬氨酸。
[0015]图2用于基因WaJ敲除的敲除质粒构建和重组菌Λ S-1的PCR验证:Α，泳道I:DL-2000 DNA Marker ;泳道2 ,sdaA的上游序列和该基因5’端294bp，该片段总长度为550bp ;泳道3 基因3’端333bp和下游251bp，该片段共计605bp ;泳道4 缺失602bp片段Λ sdaA ;泳道5 -.sdaA未缺失原始序列；B,重组克隆质粒pMD19_T Δ sdaA用Sall和历idIII 酶切验证，泳道 1:DL-5 000 DNA Marker ;泳道 2 和泳道 3:pMD19-T Δ
和pMD19_T Δ sdaA-2#的双酶切验证；C,重组基因敲除质粒pK19mohsaci? Δ sdaA的双酶切验证，泳道 1:DL-5 000 DNA Marker ;泳道 2 和泳道 3:pK19mohsaM Δ schA-1# 和pK19mohsaM Δ sdaA~2#的双酶切验证；D，重组工程菌PCR验证目的基因sdaA是否成功敲除，泳道I和泳道2:分别为单克隆重组工程菌株Λ S-1-1#和Λ S-1-2# PCR扩增验证基因sdaA的完整性；泳道3:出发菌株Λ S PCR扩增验证基因的完整性，泳道4，DL-2 000DNA Marker。
[0016]图3用于基因敲除的敲除质粒构建和重组菌Λ S-1I的PCR验证。Α，泳道1:DL-2 000 DNA Marker ;泳道2:基因上游632bp片段；泳道3:基因下游629bp片段；泳道4:基因W缺失777 bp片段AW;泳道5:基因W未缺失原始序列；B，重组克隆质粒PMD19-T用Sall和历酶切验证，泳道1:DL_5 000 DNA Marker ;泳道2和泳道3:pMD19-T Δ alaT-l#和pMD19_T Δ alaT~2#的双酶切验证；C，重组基因敲除质粒pK19mohsaci? Δ aIaT的双酶切验证，泳道1:DL_5 000 DNA Marker ;泳道2至泳道6:pK19mohsaci? T1-1S 至 pK19mohsaci? /\alaT~^ 的双酶切验证；D,重组工程菌 PCR 验证目的基因是否成功敲除，泳道1:DL-2 000 DNA Marker ;泳道2:出发菌株Λ S-1 PCR扩增验证基因alaT的完整性；泳道3和泳道4:分别为单克隆重组工程菌株Λ S-11-1#和Δ S-11-2# PCR扩增验证基因alaT的完整性。
[0017]图4用于基因i7妨敲除的敲除质粒构建和重组菌Λ S-1II的PCR验证。Α，泳道1:DL-2 000 DNA Marker ;泳道2:基因iIvE上游691bp片段；泳道3:基因ilvE下游706bp片段；泳道4: 基因ilvE缺失987 bp片段Λ HvE ;泳道5:基因ilvE未缺失原始序列；B，重组克隆质粒pMD19-T Δ HvE用Bamm和HindiII的双酶切验证，泳道1:DL-5 000 DNA Marker ;泳道2:pMD19_T Δ HvE-W的双酶切验证；C，重组基因敲除质粒pK19mohsaci? Δ HvE的酶切验证，泳道1:DL_5 OOO DNA Marker ;泳道2:pK19mohsaM Δ ilvE~l#的双酶切验证；D，重组工程菌PCR验证目的基因ilvE是否成功敲除，泳道1:DL-2 000 DNA Marker ;泳道2:出发菌株Λ S-1I PCR扩增验证基因ilvE的完整性；泳道3和泳道4:分别为单克隆重组工程菌株Λ S-1I1-1#和Λ S-1I1-2# PCR扩增验证i7妨基因。
[0018]图5系列重组工程菌株发酵结束发酵液中主要氨基酸占总酸的摩尔比例。
【具体实施方式】
[0019]以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应指出，以下实例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
[0020]实施例1:重组菌谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S-1的构建
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列信息，设计用于构建敲除的重组敲除质粒的引物，引物序列如下:
sdaA -1:5’ -TATGAAAGCTTCCAGGGCAAG-3’ {Hin d III)
sdaA-2:5’ -CCCATCCACTAAACTTAAACACGACACCGTTCCCTTTG-3’
sdaA-?,:5’ -TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGCTGCCGGGTTGTGTG-3’
sdaA-A:5’ -GTGCCAGACAACCTTGATATC-3’
分别用引物和sdaA-2扩增上游片段，以引物和50^-4扩增下游片段，分别用琼脂糖凝胶电泳纯化上下游片段，见图2，长度分别为561bp和591bp ;分别以上游片段和下游片段作为模板，以引物和-4进行交叉PCR扩增上下游融合片段，利用琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物，结果见图2-A。
[0021]将目的片段连接至克隆载体pMD19_T simple vector转化至疋co7i JM109感受态细胞，挑取单菌落培养提取质粒，Sall和"i/7dIII酶切鉴定，见图2-B，即为阳性重组克隆质粒PMD19-T;利用限制性内切酶1和历‘/7(1 III酶切重组克隆质粒pMD19_TAsi/a儿将回收片段与用相同处理的pK19mohsaci?混合,T4 DNA Iigase过夜处理。连接产物转化至JM109。挑取单菌落培养提取质粒，5^71和历‘/?(1111酶切鉴定，见图2-C,该转化子含有重组敲除质粒pK19mohsaci? sdaA。
[0022]将pK19mohsaM Δ sdaA电击转化至谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S感受态细胞，进行两次重组和筛选，长出的单菌落包括回复野生型和目的片段缺失型，分别挑取单菌落进行PCR扩增验证基因表型，结果见图2-D，目的重组工程菌株PCR结果为图2-D泳道I和泳道I。
[0023]实施例2:重组菌谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S-1I的构建
利用敲除基因sdaA的谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S-1为改造对象，将催化丙酮酸转氨生成L-丙氨酸的转氨酶编码基 因在基因组水平永久敲除。设计合成如下引物用于构建敲除alaT的重组质粒:
alaT-Ι -GCAGTCGACCAGTTCGCGGAATTTGTG-3，{Sal I ) alaT-2:5’ -CCCATCCACTAAACTTAAACATGCCTGATCCGCGCCCAC-3’ alaT-3:5’ _TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGAGCAATACGCACGTGGAT_3’ aIaT-A:5’ ~CGTCTTCCTGAAAGCTTCCTG~3，QiindlW )具体实验步骤参考实施例1，重组敲除质粒构建过程和重组菌谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S-1I验证结果见图3。
[0024]实施例3:重组菌谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S-1II的构建
利用已敲除基因sdaA和alaT的谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S-1I为改造对象，将催化α -酮异戊酸转氨生成L-缬氨酸的转氨酶B编码基因ilvE在基因组水平永久敲除。设计合成如下引物用于构建敲除17妨的重组质粒:
HvE-1:TATAgfi^r^TTATCCAGCTCCGCCAATG (5a?H I)
il vE-2: CCCATCCACTAAACTTAAACAAGCAAGGAAACGTTGAAG
il vE-?>: TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCCTTCAGACGATCGGGTG
ilvB-4:ATT44^7TTGCTGCAAGTCCCAAATC Qiind III)
具体实验步骤参考实施例1，重组敲除质粒构建过程和重组菌谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S-1II验证结果见图4。
[0025]实施例4:重组菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S-1II用于发酵生产L-丝氨酸 利用接种环将出发菌株和重组工程菌划线于种子培养基固体平板中，将平板置于30°C
恒温培养箱中培养至长出单菌落，接种环分别划取一环菌体接种至20ml种子培养基中，30 0C，120rpm培养至对数生长中期，按照5%的接种比接种至25ml摇瓶发酵培养基中，30 °C，120rpm 发酵 96h。
[0026]发酵结束，利用HPLC检测发酵液中氨基酸的含量，发酵液样品处理及HPLC的条件如下:` 将发酵液用ddH20稀释至合适浓度，以异硫氰酸苯酯(PITC)作为衍生剂将氨基酸衍生化，产物苯氨基酸硫甲酰衍生物(PTC-AA)在254nm有稳定的强紫外吸收，高效液相色谱仪为 DIONEX Ultimate 3000 series HPLC system,米用 Venusil-ΑΑ 氨基酸分析专用柱(4.6X250 mm, 5 Mm)，在紫外下检测衍生物。
[0027]流动相A相:92.6 mM乙酸钠，用冰醋酸将pH调节到6.50±0.05 ;流动相B相:80%乙腈，流速1.0 ml/min,柱温:4(TC,紫外检测器波长254 nm。梯度洗脱程序为:0~4 min, 100% A ;4~16 min, 97 % A;16~17 min, 89 %;17~32 min, 79 % A ;32~34 min, 66 % A ;34~38min,O % A ；38.01，100 % A。
[0028]氨基酸标准品和样品衍生化步骤:
(1)准确量取氨基酸混合标准液及样品200μ1，分别置于1.5ml离心管中；
(2)每管中准确加入正亮氨酸内标液20μ I ；
(3)分别向每个离心管中加入三乙胺乙腈溶液100μ1，异硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μ I，混匀，室温放置反应Ih ；
(4)加入正己烷400μ 1，剧烈震荡后放置IOmin ；
(5)取下层PTC-AA溶液，用0.45 μ m针式过滤器过滤；
(6)取滤过清液100μ 1，加入400 μ I ddH20稀释，摇匀，进样20μ I 样品衍生化反应中所需的溶液如下:
三乙胺乙腈:三乙胺1.4ml+乙腈8.6ml，混匀；_20°C保存。
[0029]异硫氰酸苯酯乙腈溶液:PITC 25μ 1，加入乙腈2ml，混匀。(密闭，4°C放置保质期为7天)正亮氨酸内标液:秤取正亮氨酸10mg，加入0.1 M盐酸溶液IOml使其溶解，混匀，4°C保存。
[0030]其中种子培养基为:
蛋白胨 1.0%，葡萄糖 2.0%，酵母粉 0.5%，牛肉膏 1.0%，NaCl 0.3%, pH 7.0-7.2,121°C高温灭菌IOmin ;固体培养基加入琼脂2.0%。
[0031]摇瓶发酵培养基为:
蔗糖 10.0%, (NH4)2SO4 3.0%, CaCO3 6.0%, K2HPO4 0.3%, MgSO4.7H20 0.05%, FeSO4.7H200.002%,MnSO4.Η20 0.002%,生物素 50 μ g/L，硫胺素 450 μ g/L, pH 7.0，115°C灭菌 7 min ；用于谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Λ S-1II发酵时，培养基中添加250mg/L L-Val, L-Leu和L-1le0
[0032]最终的重组工程菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S-1II，发酵96h发酵液中L-丝氨酸占总氨基酸的摩尔比例较出发菌株提高38.39%，同时另外两种副产物L-丙氨酸和L-缬氨酸占总氨基酸的摩尔比例较出发菌株减少40.65%，其中L-缬氨酸在总氨基酸的摩尔比例减少至2.09%ο`
【权利要求】
1.一种减少L-丝氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062代谢副产物的方法，其特征在于:将基因和i7妨在L-丝氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Λ S基因组实现组合敲除，分别构建获得基因工程菌谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S-1，谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S-1I 和谷氨酸棒杆菌 SYPS-062 Δ S-1II。
2.如权利要求1的基因儿其特征在于:该基因编码L-丝氨酸脱氨酶，催化L-丝氨酸脱氨脱水生成丙酮酸，其核苷酸序列见序列I。
3.如权利要求1的基因其特征在于:该基因编码丙氨酸转氨酶，催化丙酮酸转氨生成L-丙氨酸，其核苷酸序列见序列2。
4.如权利要求1的基因i7妨，其特征在于:该基因编码转氨酶B，催化α-酮异戊酸转氨合成L-缬氨酸，其核苷酸序列见序列3。
5.如权利要求1的基因工程菌谷氨酸棒杆菌SYPS-062Δ S-1,谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S-1I和谷氨酸棒杆菌SYPS-062 Δ S-1II，其特征在于:L_丝氨酸占总氨基酸的摩尔比例分别为55.61%，57.21%和67.95% ;L-丙氨酸占总氨基酸的摩尔比例分别为25.89%，24.25%和24.49% ；L-缬氨酸占总氨基酸的摩尔比例分别为13.38%，13.95%和·2.02%。
【文档编号】C12R1/15GK103820485SQ201310391569
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2013年9月2日 优先权日:2013年9月2日
【发明者】许正宏, 史劲松, 罗玉常, 窦文芳, 张晓梅, 张旦旦, 陆震鸣, 许鸿瑜, 李恒, 李会, 耿燕, 赵芹芹, 方佳茂, 陈伟滨 申请人:江南大学, 广东环西生物科技股份有限公司