一种基于纳米金标记的金黄色葡萄球菌可视化检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于纳米金标记的金黄色葡萄球菌可视化检测方法，将与金黄色葡萄球菌的目标DNA互补配对的且经巯基修饰的DNA1和DNA2分别与10~14纳米的纳米金连接制成DNA1-适配体探针和DNA2-适配体探针，用DNA提取试剂盒提取待测物中的DNA,然后将DNA1-适配体探针和DNA2-适配体探针混匀后，加入待测物中的DNA，混匀，在90~95℃热处理4~6分钟后，降温至37℃以下，在400~900纳米进行UV-vis扫描，即可实现对待测物中的金黄色葡萄球菌的定量检测。与现有技术相比，该方法灵敏度高、操作简单、成本低。
【专利说明】一种基于纳米金标记的金黄色葡萄球菌可视化检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种基于纳米金标记的金黄色葡萄球菌可视化检测方法。
【背景技术】
[0002]金黄色葡萄球菌在自然界中广泛分布，可以引起食物中毒和胃肠炎等多种疾病。根据美国疾病预防与控制中心的统计，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒，占到整个细菌性食物中毒病例的33%，位居第二位，而加拿大则高达45%。传统的检测方法由于其操作复杂、特异性以及灵敏度不好的缺点，已经无法满足人们对于食品安全越来越高的要求了。因此，对于食品中金黄色葡萄球菌的快速、准确的检测，越来越引起人们的关注。
[0003]传统的检测方法主要是应用国标法进行检测，但是国标法需要较长的时间才能得到准确的检测结果，无法满足快速检测的目的。目前快速检测金黄色葡萄球菌的方法主要有纸片法、免疫学方法、分子生物学方法和生物传感器检测法等四种方法。其中免疫学的方法主要有免疫荧光法(IFA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫沉淀法、免疫层析法、免疫磁珠法、免疫印迹技术等。分子生物学的方法主要包括PCR技术、基因芯片等。这些方法各有其优缺点，其中一些存在如成本较高、操作复杂、稳定性差等问题，一定程度上限制了其推广与应用。
[0004]因此，非常有必要开发一种成本较低、操作简单、特异性强、灵敏度高、检测时间较短的金黄色葡萄球菌的检测技术。纳米金由于具有独特的光学、化学、电化学及催化性能，已被广泛应用于生物学和化学传感器的研究中。近年来，应用纳米金及纳米金的团聚对靶物质进行可视化检测的报道越来越多，这些靶物质主要包括一些食源性致病菌、毒素、金属离子、农药残留、食品非法添加剂等，纳米金除了在检测方面有着十分重要的应用外，在生命科学分析及癌症的诊断与治疗方面也有着非常广泛的应用。但是，到目前为止，还没有将纳米金用于金黄色葡萄球菌的检测`中。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种灵敏度高的基于纳米金标记的金黄色葡萄球菌可视化检测方法。
[0006]为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案:
[0007]一种基于纳米金标记的金黄色葡萄球菌可视化检测方法，将与金黄色葡萄球菌的目标DNA互补配对的且经巯基修饰的DNAl和DNA2分别与10~14纳米的纳米金连接制成DNAl-适配体探针和DNA2-适配体探针，用DNA提取试剂盒提取待测物中的DNA，然后将所述的DNAl-适配体探针和DNA2-适配体探针混匀后，加入所述的待测物中的DNA，混匀，在90~95°C热处理4~6分钟后，降温至37°C以下，在400~900纳米进行UV-vis扫描，即可实现对待测物中的金黄色葡萄球菌的定量检测。
[0008]具体地，所述的金黄色葡萄球菌的目标DNA序列为Y -CGA GGA TTT TCC MT GAGGTG GCC GA-3/ 。
[0009]具体地，所述的DNAl的序列为Y SH-TCG GCC ACC TCA T-3 ^，所述的DNA2的序列为 5' -TGG AAA ATC CTC G-3' SH。
[0010]具体地，所述的纳米金的制备方法包括依次进行的如下步骤:
[0011](I)用王水对容器进行浸泡，然后用超纯水对所述的浸泡后的容器进行清洗并烘干;
[0012](2)在所述的烘干后的容器中按体积比为100~125:1加入所述的超纯水和质量百分浓度为2~3%氯金酸溶液，搅拌均匀后煮沸8~12分钟，然后加入质量百分浓度为0.8~1.2%的柠檬酸三钠溶液，继续煮沸8~12分钟，其中所述的柠檬酸三钠溶液与所述的氯金酸溶液的体积比为10~13:1 ;
[0013](3)停止加热，继续搅拌12~18分钟，冷却至10~40°C，即得所述的纳米金。
[0014]具体地，所述的超纯水的电阻率大于等于18.2ΜΩ.cm。
[0015]具体地，所述的DNAl-适配体探针制备方法包括依次进行的如下步骤:
[0016](I)将所述的纳米金在3~5°C，13000~15000r/min离心30~40分钟后，吸出
上清液；
[0017](2)将浓度为10_5mOl/L的DNAl加入到所述的上清液中，在35~40°C下摇床孵育20~30小时，形成纳米金-DNAl溶液，其中，所述的DNA1、上清液的体积比为1:45~55 ；
[0018](3)将十二烷基磺酸钠(SDS)加入到所述的纳米金-DNAl溶液中，然后再分多次加入0.8~1.2mol/L的NaCl，使所述的NaCl的终浓度达到0.3~0.4mol/L,每次加入所述的NaCl后，超声处理8~12秒；
[0019](4)将经步骤(3)处理后的纳米金-DNAl溶液在35~40°C陈化20~30小时；
[0020](5)将经步骤(4)陈化后的纳米金-DNAl溶液在3~5°C 13000~15000r/min离心30~40分钟，吸出上清液，再用IXPBS缓冲液溶解沉淀，如此重复离心多次，以去除未连接到纳米金上的DNA，即得所述的DNAl-适配体探针。
[0021 ]具体地，所述的 I X PBS 缓冲液的配方为 0.lmol/L NaCl、IOmmoI/L Na2HPO4'IOmmoI/L NaH2PO4, pH 值为 7.4。
[0022]具体地，所述的DNA2-适配体探针的制备方法包括依次进行的如下步骤:
[0023](I)将所述的纳米金在3~5°C，13000~15000r/min离心30~40分钟后，吸出
上清液；
[0024](2)将浓度为10_5mOl/L的DNA2加入到所述的上清液中，在35~40°C下摇床孵育20~30小时，形成纳米金-DNA2溶液，其中，所述的DNA2、上清液的体积比为1:45~55 ；
[0025](3)将十二烷基磺酸钠(SDS)加入到所述的纳米金-DNA2溶液中，然后再分多次加入0.8~1.2mol/L的NaCl，使所述的NaCl的终浓度达到0.3~0.4mol/L,每次加入所述的NaCl后，超声处理8~12秒；
[0026](4)将经步骤(3)处理后的纳米金-DNA2溶液在35~40°C陈化20~30小时；
[0027](5)将经步骤(4)陈化后的纳米金-DNA2溶液分别在3~5°C 13000~15000r/min离心30~40分钟，吸出上清液，再用I XPBS缓冲液溶解沉淀，如此重复离心多次，以去除未连接到纳米金上的DNA，即得所述的DNA2-适配体探针。
[0028]具体地，所述的I X PBS 缓冲液的配方为 0.lmol/L NaCl、IOmmoI/L Na2HPO4'IOmmoI/L NaH2PO4, pH 值为 7.4。
[0029]具体地，所述的DNAl-适配体探针、DNA2-适配体探针、待测物中的DNA的体积比为 1:1:4 ~10。
[0030]检测原理:DNA1、DNA2和金黄色葡萄球菌的目标DNA是完全互补配对的，当检测体系中出现金黄色葡萄球菌的目标DNA时，DNAU DNA2就会与金黄色葡萄球菌目标DNA杂交在一起，从而使纳米金之间的距离拉近，由于纳米金的颜色具有光距离依赖特性，因此就会引起纳米金颜色的变化；目标DNA浓度不同，纳米金聚集的程度也就不同，从而导致纳米金溶液呈现出不同颜色的变化，由此实现金黄色葡萄球菌的可视化检测。
[0031]由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点:
[0032]本发明对金黄色葡萄球菌的目标DNA的检测限为0.5pmol/L,在I~1000pmol/L范围内线性良好(R2=0.9921);对金黄色葡萄球菌的检测限达到了 25cfu/mL，而且在30~9800cfu/mL范围内线性良好(R2=0.9958)，因此，本发明中的检测方法灵敏度高；并且本发明中的DNAl-适配体探针、DNA2-适配体探针易于制备，因此本发明操作简单，且成本较低。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1是纳米金的透射电镜图；
[0034]图2是纳米金的紫外-可见吸收图谱；
[0035]图3是特异性实验，其中，a为金黄色葡萄球菌，b为鼠伤寒沙门氏菌，c为大肠杆菌，d为单增李斯特菌，e为阪崎杆菌；
[0036]图4是检测金黄色葡萄球菌的目标DNA的标准曲线，其中，横坐标的单位为pmol/L ；
[0037]图5是检测金黄色葡萄球菌的标准曲线，其中，横坐标的单位为lOcfu/mL。
【具体实施方式】
[0038]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。
[0039]实施例1
[0040]1、合成金黄色葡萄球菌的目标DNA及巯基修饰的与金黄色葡萄球菌的目标DNA互补配对的DNAl和DNA2 (购自上海生工生物工程股份有限公司)
[0041]金黄色葡萄球菌的目标DNA:5' -CGA GGA TTT TCC AAT GAG GTG GCC GA-3'；
[0042]短连DNAl 序列:5' SH-TCG GCC ACC TCA T-3'；
[0043]短连DNA2 序列:5' -TGG AAA ATC CTC G_3' SH ；
[0044]2、制备纳米金
[0045]I)用王水(体积比为3:1的浓盐酸和浓硝酸)浸泡相关容器，再用超纯水清洗，烘干;
[0046]2)在容器中加入99.16mL超纯水(电阻率≥18.2ΜΩ)和0.84mL2.5%氯金酸溶液，用转子搅拌均匀，煮沸IOminJPA 10mLl%的柠檬酸三钠溶液，溶液立即变为深蓝黑色，继续煮沸IOmin ；[0047]3)停止加热，持续搅拌15min，在室温下冷却，得到了酒红色的纳米金溶液，并通过透射电子显微镜以及紫外-可见吸收图谱对所制备的纳米金进行表征，表征图谱参见图1和图2。
[0048]3、制备DNAl-适配体探针
[0049]取ImL纳米金置于1.5mL离心管中，4°C 14000r/min离心35min,吸出500 μ L的上清液，取10 μ L浓度为10_5mOl/L的DNAl加入到上清液中，37°C摇床孵育24h ;将5mg SDS加入到纳米金-DNAl溶液中，逐次加入lmol/L的NaCl，使NaCl的终浓度达到0.36mol/L，每次加入NaCl后，超声处理IOs左右；然后在37°C陈化24h ;再在4°C，HOOOrpm离心35min，吸出上清液，再用 I XPBS (0.lmol/L NaCl, 10mmol/L Na2HP04/NaH2P04, pH7.4)溶解沉淀，如此重复2次，以去除未连接到纳米金上的DNA，保存在4°C条件下备用。
[0050]4、DNA2-适配体探针的制备方法和DNAl-适配体探针的制备方法相同
[0051]5、提取 DNA
[0052]利用成品试剂盒提取金黄色葡萄球菌的目标DNA。
[0053]6、金黄色葡萄球菌的检测
[0054]分别取50 μ L制备好的DNAl-适配体探针和DNA2-适配体探针，置于无菌的离心管中，混匀，再加入10 μ L不同浓度的金黄色葡萄球菌的目标DNA，混匀，95°C热处理5min，然后放置于4°C环境中；观察颜色变化并在400~900nm进行UV-vis扫描，根据A700/A525的值和金黄色葡萄球菌的目标DNA的浓度绘制出金黄色葡萄球菌的目标DNA的标准曲线，参见图4 ;根据A700/A525的值和金黄色葡萄球菌的菌落个数绘制出金黄色葡萄球菌的标准曲线，参见图5。
[0055]实施例2
[0056]分别提取金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、单增李斯特菌、阪崎杆菌的DNA，并将上述5种DNA以相同的浓度加入到DNAl-适配体探针和DNA2-适配体探针的混合液中，其他条件均与实施例1相同，实验数据参见图3。
[0057]实施例3
[0058]对市售的无菌奶进行加标回收实验，实验方法如实施例1所述，实验结果参见表1，表1为牛奶中金黄色葡萄球菌的检测回收率(n=5)。
[0059]表1
[0060]
【权利要求】
1.一种基于纳米金标记的金黄色葡萄球菌可视化检测方法，其特征在于:将与金黄色葡萄球菌的目标DNA互补配对的且经巯基修饰的DNAl和DNA2分别与10~14纳米的纳米金连接制成DNAl-适配体探针和DNA2-适配体探针，用DNA提取试剂盒提取待测物中的DNA,然后将所述的DNAl-适配体探针和DNA2-适配体探针混匀后，加入所述的待测物中的DNA，混匀，在90~95°C热处理4~6分钟后，降温至37°C以下，在400~900纳米进行UV-vis扫描，即可实现对待测物中的金黄色葡萄球菌的定量检测。
2.根据权利要求1所述的可视化检测方法，其特征在于:所述的金黄色葡萄球菌的目标 DNA 序列为 5' -CGA GGA TTT TCC AAT GAG GTG GCC GA-3'。
3.根据权利要求1所述的可视化检测方法，其特征在于:所述的DNAl的序列为5' SH-TCG GCC ACC TCA T-3/，所述的 DNA2 的序列为 5' -TGG AAA ATC CTC G-3/ SH。
4.根据权利要求1所述的可视化检测方法，其特征在于:所述的纳米金的制备方法包括依次进行的如下步骤: (1)用王水对容器进行浸泡，然后用超纯水对所述的浸泡后的容器进行清洗并烘干； (2)在所述的烘干后的容器中按体积比为100~125:1加入所述的超纯水和质量百分浓度为2~3%氯金酸溶液，搅拌均匀后煮沸8~12分钟，然后加入质量百分浓度为0.8~1.2%的柠檬酸三钠溶液，继续煮沸8~12分钟，其中所述的柠檬酸三钠溶液与所述的氯金酸溶液的体积比为10~13:1 ; (3)停止加热，继续搅拌12~18分钟，冷却至10~40°C，即得所述的纳米金。
5.根据权利要求4所述的可视化检测方法，其特征在于:所述的超纯水的电阻率大于等于 18.2M Ω.cm。
6.根据权利要求1所述的可视化检测方法，其特征在于:所述的DNAl-适配体探针制备方法包括依次进行的如下步骤`: (1)将所述的纳米金在3~5°C，13000~15000r/min离心30~40分钟后，吸出上清液； (2)将浓度为10_5mOl/L的DNAl加入到所述的上清液中，在35~40°C下摇床孵育20~30小时，形成纳米金-DNAl溶液，其中，所述的DNA1、上清液的体积比为1:45~55 ； (3)将十二烷基磺酸钠加入到所述的纳米金-DNAl溶液中，然后再分多次加入0.8~1.2mol/L的NaCl，使所述的NaCl的终浓度达到0.3~0.4mol/L,每次加入所述的NaCl后，超声处理8~12秒； (4)将经步骤(3)处理后的纳米金-DNAl溶液在35~40°C陈化20~30小时； (5)将经步骤(4)陈化后的纳米金-DNAl溶液在3~5°C13000~15000r/min离心30~40分钟，吸出上清液，再用IXPBS缓冲液溶解沉淀，如此重复离心多次，以去除未连接到纳米金上的DNA，即得所述的DNAl-适配体探针。
7.根据权利要求6所述的可视化检测方法，其特征在于:所述的IXPBS缓冲液的配方为 0.lmol/L NaClUOmmol/L Na2HPO4、IOmmoI/L NaH2PO4, pH 值为 7.4。
8.根据权利要求1所述的可视化检测方法，其特征在于:所述的DNA2-适配体探针的制备方法包括依次进行的如下步骤: (I)将所述的纳米金在3~5°C，13000~15000r/min离心30~40分钟后，吸出上清液；(2)将浓度为10_5mOl/L的DNA2加入到所述的上清液中，在35~40°C下摇床孵育20~`30小时，形成纳米金-DNA2溶液，其中，所述的DNA2、上清液的体积比为1:45~55 ； (3)将十二烷基磺酸钠加入到所述的纳米金-DNA2溶液中，然后再分多次加入0.8~`1.2mol/L的NaCl，使所述的NaCl的终浓度达到0.3~0.4mol/L,每次加入所述的NaCl后，超声处理8~12秒； (4)将经步骤(3)处理后的纳米金-DNA2溶液在35~40°C陈化20~30小时； (5)将经步骤(4)陈化后的纳米金-DNA2溶液分别在3~5°C13000~15000r/min离心30~40分钟，吸出上清液，再用I XPBS缓冲液溶解沉淀，如此重复离心多次，以去除未连接到纳米金上的DNA，即得所述的DNA2-适配体探针。
9.根据权利要求8所述的可视化检测方法，其特征在于:所述的IXPBS缓冲液的配方为 0.lmol/L NaClUOmmol/L Na2HPO4、IOmmoI/L NaH2PO4, pH 值为 7.4。
10.根据权利要求1所述的可视化检测方法，其特征在于:所述的DNAl-适配体探针、DNA2-适配体探针、待测物`中的DNA的体积比为1: 1:4~10。
【文档编号】C12Q1/68GK103555832SQ201310481326
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年10月15日
【发明者】俞晔, 王周平, 袁京磊, 杜国兴, 周强, 王玥 申请人:中华人民共和国张家港出入境检验检疫局, 江南大学