一种用于改良玉米株型和提高玉米产量的基因的获得方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及植物基因工程【技术领域】，提供了一种用于改良玉米株型和提高玉米产量的基因：玉米细胞色素氧化酶基因ZmCYP72A，该基因扩增自玉米叶片cDNA中，用包含该ZmCYP72A基因的全长片段的DNA序列构建过表达载体，然后将ZmCYP72A基因过表达载体导入农杆菌菌株，并用农杆菌介导法侵染玉米幼胚，建立了转基因玉米株系。发明人进一步培育后将转基因玉米株系与野生型植株进行比较，发现利用该基因所得的转基因农作物具有生育期缩短、株型矮小、产量提高等表型，该转基因阳性植株应用于生产，改良成熟期、株型、产量等重要农艺性状，用于提高作物的产量和品质，具有重要的经济价值和社会效益。
【专利说明】—种用于改良玉米株型和提高玉米产量的基因的获得方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物基因工程【技术领域】，提供了一种用于改良玉米株型和提高玉米产量的基因的获得方法和应用。
【背景技术】
[0002]玉米是集粮食、饲料、工业加工等多种用途于一身的重要作物，其转基因技术始于1986年(Fromm et al.，Nature, 319:791-793)。随着转基因技术的深入发展和全基因组测序的完成，玉米已经成为基础性和应用性研究的重要单子叶模式作物。近些年来，由于世界人口数量增加及畜牧产业和玉米加工产业的迅速发展，全球玉米需求量剧增，提高玉米产量成为农业生产和社会经济的迫切需要。[0003]植物CYP450按照功能主要分为两大类，生物合成方面主要参与了植物木质素中间物、植物激素、留醇、萜类、黄酮类、异黄酮和呋喃香豆素等物质的合成。代谢方面则主要是将有毒物质转变为无毒物质，包括环境毒素、农药、有机染料等(Brazier et al.Phytochem.2002，59:149-156; Chappie, Annu.Rev.Plant Biol.1998，49:311-343)。细胞色素 P450在植物次生代谢、合成及解毒等方面具有复杂而广泛的功能，并且参与激素类物质的代谢过程。CYP72是研究较早的一个P450家族，Irmler等发现(Plant J.2000，24:797-804)CYP72A1能催化吲哚生物碱合成途径的早期步骤，即由马钱苷转化为次番木鳖苷的过程。450基因往往以基因簇的形式参与到吲哚生物碱对植物生长发育和抗逆活动中，这可能与他们的协同作用有关(Chappie, Annu.Rev.Plant Biol.1998，49:311-343)。CYP71C家族有4个成员(CYP71C1-4)串联形成一个家簇共同作用于玉米重要次生防御物质DMBOA (2，4-二羟基-7-甲氧基-1,4-苯并噁嗪-3-酮)合成途径(Frey et al.Mol.Gen.Genet.1995，246:100-109;Frey et al.Sc1.1997，277:696-699;Baitey et al.PlantPhysiol.1991，95:792-796)。因此如何更好的利用植物CYP450为玉米的转基因开拓新的领域成为本领域的研究方向，特别是如何实现玉米植株的改良和产量的提高，成为亟待解决的问题之一。
【发明内容】
[0004]本发明的发明人针对上述现有技术的情况，结合长期研究和探索，提供了一种用于改良玉米株型和提高玉米产量的基因，该基因为玉米细胞色素氧化酶基因ZmCYP72A，该基因扩增自玉米叶片cDNA中，用包含该ZmCYP72A基因的全长片段的DNA序列构建过表达载体，然后将ZmCYP72A基因过表达载体导入农杆菌菌株，并用农杆菌介导法侵染玉米幼胚，建立了转基因玉米株系。发明人进一步培育后将转基因玉米株系与野生型植株进行比较，发现利用该基因所得的转基因农作物具有生育期缩短、株型矮小、产量提高等表型，该转基因阳性植株应用于生产，改良成熟期、株型、产量等重要农艺性状，用于提高作物的产量和品质，具有重要的经济价值和社会效益。[0005]发明人提供一种用于改良玉米株型和提高玉米产量的基因，该基因含有一个保守的P450结构域，属于CYP450超家族72A亚家族，因此命名为ZmCYP72A基因，其核苷酸序列如SED IDNO:1所示，该基因全长为1584bp，氨基酸序列如SED ID NO: 2所示，编码527个氨基酸。
[0006]该基因从玉米自交系齐319的叶片cDNA中扩增获得，其具体步骤如下:
[0007]1.玉米RNA的提取和纯化 [0008]2cDNA第一链的合成
[0009]3ZmCYP72A基因的克隆
[0010]以反转录的cDNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增:
[0011]上游引物:5’-GTGGATCCTGCGGTCAGTAACGAAAGT-3，如 SEQ ID NO:3 所示
[0012]下游引物:5’-GTGGATCCCAAGCCGCCACCAATGGC-3，如 SEQ ID NO:4 所示
[0013]其中划横线部分为BamHI酶切位点；
[0014]PCR扩增体系为I μ I上游引物(50pmol/μ L), I μ I下游引物(50pmol/μ L),5 μ 110XPCR buffer, 5 μ I dNTP 混合液(10mmol/L)，0.5 μ I Taq DNA 聚合酶(5U)，4 μ IcDNA模板，加ddH20将总体积补充至50 μ I ;
[0015]扩增条件为:94°C预变性3分钟；94°C变性I分钟，60°C退火I分钟，72°C延伸1.5分钟，循环33次；72°C延伸10分钟。
[0016]取4 μ I PCR产物与pMD19-T Simple载体连接，操作步骤按照TaKaRa公司产品pMD19-TSimple Vector说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA，酶切鉴定后进行序列测定。扩增产物经测序分析，其序列如SEQ ID N0:1所示，表明扩增产物为ZmCYP72A基因。
[0017]现有技术中也有该基因家族其他成员的研究，但是其主要侧重于该类基因在植物次生代谢、合成及解毒等方面的应用，并未发现其具有与本发明类似的功能，发明人认为这与本发明的基因与现有基因功能具有较大的不同有关。
[0018]获得上述的目标基因后，发明人利用其构建了植物表达载体pZP21 IUB1::ZmCYP72A，该载体为利用限制性内切酶BamHI酶切扩增得到的ZmCYP72A基因DNA片段，并将其连接在pZP211::UBI空表达载体获得；发明人进一步利用获得的该载体转化农杆菌。
[0019]最后发明人利用农杆菌介导转化玉米幼胚，并最终筛选获得了具有抗性的植株，并最终验证发现该植株具有生育期缩短、株型矮小、产量提高等表型，该转基因阳性植株应用于生产，改良成熟期、株型、产量等重要农艺性状，用于提高作物的产量和品质，具有重要的经济价值和社会效益。
[0020]上述步骤中，玉米RNA的提取和纯化可直接采用现有工艺，也可采用本发明中所记载的工艺；cDNA第一链的合成的也是相同的情况，也可以采用现有的工艺或者试剂盒，但是上述两者均优选采用本发明所记载的具体工艺。
[0021]综上所述，本发明的发明人首次提供了一种用于改良玉米株型和提高玉米产量的基因:玉米细胞色素氧化酶基因ZmCYP72A，利用包含该ZmCYP72A基因的全长片段的DNA序列构建过表达载体，然后将ZmCYP72A基因过表达载体导入农杆菌菌株，并用农杆菌介导法侵染玉米幼胚，建立了转基因玉米株系。发明人进一步培育后将转基因玉米株系与野生型植株进行比较，发现利用该基因所得的转基因农作物具有生育期缩短、株型矮小、产量提高等表型，该转基因阳性植株应用于生产，改良成熟期、株型、产量等重要农艺性状，用于提高作物的产量和品质，具有重要的经济价值和社会效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为植物表达载体pZP211UB1::ZmCYP72A载体结构图；
[0023]图2为转基因玉米植株的获得过程示意图，
[0024]图中A为转基因愈伤组织在筛选培养基的梯度筛选；B为愈伤组织分化候选转基因幼苗；C为候选转基因植株炼苗；D为候选转基因植株移栽育苗基质；E为候选转基因植株温室种植；
[0025]图3为候选转基因植株的PCR特异性扩增结果示意图，
[0026]图中A为筛选标记基因NPTII的检测结果，B为目的基因ZmCYP72A的检测结果；其中，M表示分子量标记，PC表示阳性质粒，WT表示野生型对照，L表示候选转基因植株；
[0027]图4为候选转基因植株的实时定量PCR检测结果，
[0028]其中，WT表示野生型植株，L表示候选转基因植株；
[0029]图5为候选转基因植株的Southern杂交结果，
[0030]其中，PC表示阳性质粒，WT表示野生型对照，NC表示阴性对照，L表示候选转基因植株；
[0031]图6为阳性转基因植株与野生型植株的株型对比示意图，
`[0032]图中左侧WT为野生型植株和右侧L38为阳性转基因植株；
[0033]图7为阳性转基因植株与野生型植株株高的数据统计数据图，
[0034]图中A为株高的数据统计，B为穗位高度的数据统计；C为茎周长的数据统计山为棒三叶叶面积的数据统计，D中每组柱状图从左至右依次为穗下位叶，穗位叶和穗上位叶；
[0035]其中，WT表示野生型对照，L表示候选转基因植株；
[0036]图8为阳性转基因植株生育期表型示意图，
[0037]图中标尺左侧野生型植株，标尺右侧为阳性转基因植株，可见阳性转基因植株成熟速率明显加快；
[0038]图9为阳性转基因植株绿叶面积的数据统计图，
[0039]其中，WT表示野生型对照，L表示候选转基因植株；
[0040]图10为阳性转基因植株与野生型植株考种数据统计分析示意图；考种数据包括穗长、穗粗、穗粒数、千粒重、单穗产量等，星号表示差异显著(T检验，P〈0.05)，其中，WT表示野生型对照，L表示候选转基因植株。
【具体实施方式】
[0041]以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件；其中本发明将上述表达载体导入植物细胞中，导入方法都是本领域人员熟知的，这些方法包括但不仅限于:农杆菌介导的转化法、基因枪法、电激法、子房注射法等。本发明所用选择标记基因为新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)，可进一步包括其它选择标记基因和报告基因。本发明选用的筛选抗生素为巴龙霉素，选用卡那霉素和G418等抗生素也可起到相同筛选效果；除此之外，本发明所采用的均为本领域现有技术。
[0042]实施例1、ZmCYP72A基因克隆及植物表达载体构建
[0043]1.1玉米RNA的提取和纯化
[0044]取2_3g新鲜的玉米自交系齐319材料在液氮中研磨，迅速将研磨好的样品移入15mlCTAB 提取液中(2% (ff/V) CTAB,2% (ff/V) PVP, IOOmM Tris-HCl (pH8.0),25mM EDTA,
2.0M NaCl，2% (ff/V) β -巯基乙醇，0.5g/L亚精胺)，立即涡旋震荡30s，65°C水浴片刻，加与CTAB提取液等体积的氯仿:异戊醇的混合物，其中氯仿:异戊醇的体积比为24:1，振荡混匀；室温下1000Orpm离心15分钟，转移上清液到另一干净管中，加入与上清液等体积的氯仿:异戊醇混合物(体积比24:1)混匀静置，重复抽提一次，室温下1000Orpm离心15分钟，转移水相到另一离心管中。根据溶液体积加入8M LiCl，使LiCl终浓度为2M，4°C过夜沉淀(最多16小时)。4°C离心20分钟，去掉上清液，用500 μ 170%乙醇漂洗沉淀，用500 μ I SSTE液(1.0M NaCl,0.5% (ff/V) SDS, IOmM Tris-HCl (ρΗ8.0), ImM EDTA (ρΗ8.0))溶解沉淀，将溶液转移到1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇混合物(体积比24:1)，再抽提一次。上清液中加入2倍体积的乙醇，_70°C沉淀30分钟或_20°C沉淀2小时，4°C 12000rpm离心20分钟，沉淀DNA，先用400 μ 170%乙醇漂洗沉淀，再加入400 μ 1100%乙醇漂洗沉淀，干燥沉淀后，用50 μ I DEPC ddH20溶解沉淀。
[0045]为确保RNA质量达到测序要求，分别使用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测纯化后的RNA样品纯度和浓度，其中纯度和浓度标准为:RNA纯度为0D260/280和0D260/230均在1.8-2.0范围内，RNA浓 度在1.0-2.0 μ g/ μ I范围内。
[0046]1.2cDNA第一链的合成
[0047]在0.2ml DEPC处理的离心管中顺序加入Iu 150 μ M Oligo dT Primer和15.5 μ I总RNA，70°C变性6分钟，迅速冰浴10分钟。在上述离心管中顺序加入2 μ I dNTPMixture (IOmM),5 μ 15XPrimerScript Buffer,0.5 μ I RNase Inhibitor (40U),I μ IPrimerScript RTase (200U)，加 DEPC-H20 至 25 μ I。在 PCR 仪上运行程序为 25°C，10 分钟；42°C,90分钟；95°C，5分钟。程序结束后，样品于_80°C冻存待用。
[0048]1.3ZmCYP72A 基因的克隆
[0049]以反转录的cDNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增:
[0050]上游引物:5’-GTGGATCCTGCGGTCAGTAACGAAAGT-3，如 SEQ ID NO:3 所示
[0051]下游引物:5’-GTGGATCCCAAGCCGCCACCAATGGC-3，如 SEQ ID NO:4 所示
[0052]划横线部分为BamHI酶切位点，PCR扩增体系为1μ I上游引物(50pmol/μ L)，I μ I 下游引物(50ρ--θ1/μ υ，5μ 110XPCR buffer, 5 μ I dNTP 混合液(10mmol/L)，0.5 μ ITaqDNA聚合酶(5υ)，4μ I cDNA模板，加ddH20将总体积补充至50 μ I。扩增条件为:94°C预变性3分钟；94°C变性I分钟，60°C退火I分钟，72°C延伸1.5分钟，循环33次；72°C延伸10分钟。
[0053]取4 μ I PCR产物与pMD19-T Simple载体连接，操作步骤按照TaKaRa公司产品pMD19-TSimple Vector说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(lOOmg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA，酶切鉴定后进行序列测定。扩增产物经测序分析，其序列如SEQ ID N0:1所示，表明扩增产物为ZmCYP72A基因。
[0054]1.4 植物表达载体 pZP211UB1:: ZmCYP72A 的构建
[0055]用限制性内切酶BamHI酶切扩增得到的ZmCYP72A基因的DNA片段；用BamHI单酶切PZP211::UBI空表达载体，二者均通过电泳检测并回收目的片段。利用T4连接酶连接酶切后的片段，操作步骤按照Fermentas公司产品T4DNA Iigase说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，在含有壮观霉素(50mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落，在含有壮观霉素(50mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA并进行酶切鉴定。将酶切鉴定正确的表达载体PZP211UB1::ZmCYP72A转化农杆菌LBA4404感受态细胞，并获得可供转化使用的农杆菌菌株。本发明采用的是电击法转化农杆菌。
[0056]实施例2、农杆菌介导的玉米幼胚转化及抗性植株的获得
[0057]侵染前一天挑取农杆菌(携带重组质粒的农杆菌单菌落)接种于含有50mg/L壮观霉素的YEP培养基中，28°C，220rpm摇菌过夜，第二天一早沉淀并用AB诱导培养基重悬，培养5小时后沉淀菌体，侵染液重悬菌体备用。
[0058]收集自交系齐319授粉后10-13d的幼胚(长度在1.0mm-1.5mm之间)放在预侵染培养基中，收集完全后，2700rpm离心5秒，弃去培养基，加预侵染培养基2ml重新悬浮，2700rpm离心5秒，46°C水浴3分钟，冰浴I分钟，2700rpm离心5秒，弃去培养基。加2ml预侵染培养基，4°C 2700rpm离心IOmin,弃去培养基,加入Iml农杆菌悬浮菌液到离心管中，2700rpm离心30s,室温放置5min。
[0059]将侵染的幼胚转移至带滤纸的灭菌空培养皿中，吸干菌液后转移至共培养培养基中28°C暗培养3天，移至梯度筛选培养基中(见图2A)，每2周更换一次培养基，梯度筛选3次(巴龙霉素三个浓度梯 度分别为25mg/L、50mg/L、100mg/L);筛选后的愈伤组织转入分化培养基(见图2B)。2周后，将分化得到的幼苗转入生根培养基(见图2C)，将长出3根以上壮根的幼苗炼苗(见图2D)，经过7天左右的炼苗期后，移栽至温室(见图2E)。
[0060]本实施例中的预侵染培养基为添加了 1.5mg/L2, 4-D的MS培养基(Murashige andSkoog, 1962)，筛选培养基为添加了 2.0mg/L2，4-D的N6培养基(朱志清等，1974)，其中的2，4-D为2，4- 二氯苯氧乙酸。
[0061]实施例3、候选转基因植株的分子检测
[0062]3.1候选转基因植株的PCR检测
[0063]米用CTAB法(Sambrook and Russell,分子克隆实验指南,2001)提取转基因玉米植株基因组DNA，分别设计引物检测标记基因NPTII和目的基因ZmCYP72A，引物对序列如下:
[0064]标记基因NPTII基因引物对如下:
[0065]上游引物:5’-GTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTG-3’，如 SEQ ID NO:5 所示；
[0066]下游引物:5’-AGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGC-3’，如 SEQ ID NO:6 所示；
[0067]标记基因NPTII扩增序列长度为650bp，扩增条件:扩增条件为:94°C预变性5分钟；94°C变性I分钟，59°C退火I分钟，72°C延伸50秒，循环35次；72°C延伸10分钟。
[0068]目的基因ZmCYP72A引物对如下:[0069]上游引物:5’-TTTAGCCCTGCCTTCATACG-3’，如 SEQ ID NO:7 所示；
[0070]下游引物:5’-ACTTTCGTTACTGACCGCA-3’，如 SEQ ID NO:8 所示；
[0071]目的基因ZmCYP72A扩增序列长度为660bp，扩增条件:扩增条件为:94°C预变性3分钟；94°C变性I分钟，61°C退火I分钟，72°C延伸50秒，循环35次；72°C延伸10分钟
[0072]如图3中A所示为对筛选标记基因NPT II基因的检测结果，该基因扩增序列长度为650bp ;图3中B为目的基因ZmCYP72A的检测结果，扩增序列长度为660bp。
[0073]3.2利用Southern杂交技术对候选转基因植株进行鉴定
[0074]以候选转基因植株功能期叶片为实验材料，参照CTAB法提取总基因组DNA，按照Roche公司地高辛试剂盒的说明书步骤进行Southern杂交检测,检测结果如图5所示，WT(野生型对照)中只能检测到一条内源带，部分转基因株系L65、L47、L38中内源带和目的基因ZmCYP72A均能检测到，目的基因ZmCYP72A为单拷贝插入，确定为阳性转基因植株。
[0075]检测探针引物对序列为:
[0076]上游引物:5’-AATGGCAAGAGAGAGCAAG-3’，如 SEQ ID NO:9 所示；
[0077]下游引物:5’-GCGGTCAGTAACGAAAGTA-3’，如 SEQ ID NO:10 所示；
[0078]3.3实时定量PCR分析ZmCYP72A基因在阳性转基因植株中的表达水平
[0079]提取分子检测为阳性转基因植株的总RNA，并反转录为cDNA。
[0080]设计内参基因Actin的引物，标定内参。
[0081]上游引物:5’-GCCACCGATCCAGAC`ACTGTACTTCC-3’，如 SEQ ID NO:11 所示；
[0082]下游引物:5’-ATTCAGGTGATGGTGTGAGCCACAC-3’，如 SEQ ID NO:12 所示；
[0083]设计目的基因的检测引物:
[0084]上游引物:5’-CTCCCAATGCGGTTACTCC-3’，如 SEQ ID NO:13 所示；
[0085]下游引物:5’-CTATCGTTCACCTGGTTCGG-3’，如 SEQ ID NO:14 所示；
[0086]扩增条件:94°C预变性3分钟；94°C变性15s, 56 °C (Actin基因)或63 °C (巨的基因)退火30秒，72°C延伸30秒，40个循环；95°C变性15秒，60°C退火30秒，95°C延伸15秒，绘制曲线。
[0087]由图4结果可以看出，阳性转基因植株体内ZmCYP72A基因的表达量均高于野生型植株，说明ZmCYP72A基因不仅整合到阳性转基因植株的基因组内，而且在阳性转基因玉米体内转录水平得到有效表达。
[0088]实施例4、阳性转基因植株的表型分析和考种数据
[0089]使用卷尺测量授粉10天的阳性转基因植株和野生型植株的高度(图6)，并统计株高(图7A)、穗位高(图7B)、茎周长(图7C)、棒三叶叶面积(图7D)等相关表型数据。由图7可以看出，阳性转基因植株株高和穗位高明显降低，茎周长和棒三叶叶面积均略有降低。
[0090]观察阳性转基因植株生育期表型示意图(图8)发现，转基因植株(标尺右侧)顶部3-4片叶呈现绿色，三分之一叶尖处干枯，同一生长时期的野生型(标尺左侧)植株底部3-4片叶完全干枯，其余部位大都呈现绿色，可见阳性转基因植株成熟速率明显加快。
[0091]阳性转基因植株绿叶面积的数据统计发现(图9)，生育期第102天-105天(叶片开始衰老)，转基因植株与野生型植株的绿叶面积百分比基本相同，随着植株生育期的延长，转基因植株中绿叶面积百分比下降迅速，观察发现阳性转基因植株成熟速率明显加快，与野生型相比差异显著，但转基因植株间比较差异不明显。总体来说，转基因植株生育期比野生型植株生育期提前3天。
[0092]对玉米果穗的穗长、穗粗、穗粒数、千粒重和单穗产量等性状进行测定，并统计结果(图10)。阳性转基因玉米果穗穗长显著增长，穗粗基本不变，转基因植株的单穗穗粒数相比于野生型增多26.3%。虽然阳性转基因植株的千粒重相比于野生型有所降低，但是单穗产量却有一定的提高，总体来说，阳性转基因植株比野生型具有更高的产量和更高的应用价值。
[0093]除此之外本发明中ZmCYP72A基因及含有该基因的植物表达载体也可以用于生产其它可以改良农艺性状的转基因植物，如小麦、水稻、高粱等作物，包括此类转基因植物的器官、组织、细胞及其 种子和后代。
【权利要求】
1.玉米细胞色素氧化酶基因ZmCYP72A在改良玉米株型和提高玉米产量的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用该基因获得一种植物表达载体PZP211UB1::ZmCYP72A。
3.一种用于改良玉米株型和提高玉米产量的基因，其特征在于，该基因为玉米细胞色素氧化酶基因ZmCYP72A，其核苷酸序列如SED ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SED IDNO:2所示。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于:所述的基因从玉米自交系齐319的叶片cDNA中扩增获得。
【文档编号】C12N15/82GK103627716SQ201310653350
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】赵翔宇, 张宪省, 别晓敏, 张伟杨, 刘娜 申请人:山东农业大学