一种重组人激肽释放酶1及其编码基因和制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种重组人激肽释放酶1(Homo?sapiens?kallikrein1，hKLK1)及其编码基因、表达、纯化和包涵体复性方法，属于生物基因工程领域。KLK1对心脑血管疾病、糖尿病并发症等多种疾病均具有治疗作用，但是动物组织及人体液中提取的KLK1产量较低，且可能涉及安全性问题。本发明采用大肠杆菌表达系统对密码子优化后的重组人激肽释放酶1基因进行异源表达。此外，针对原核表达体系中的人激肽释放酶1多以包涵体的形式表达的问题，本发明还提供了重组人激肽释放酶1包涵体复性和纯化的方法，经一步纯化人激肽释放酶1纯度达到95%以上，并且具有较高活力。
【专利说明】—种重组人激肽释放酶1及其编码基因和制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组人激肽释放酶I及其编码基因，以及其表达、纯化和包涵体复性方法。
【背景技术】
[0002]激肽释放酶一激肽系统(kallikrein kinin system, KKS)作为一个复杂的内源性多酶系统，参与调控心血管、肾脏、神经系统等的生理功能，与心脏病、肾病、炎症反应、癌症等疾病的发生有着密切关系。KKS是体内主要的降压系统之一，由激肽原、激肽释放酶(kallikrein，KLK)和激肽组成。KLK分为两大类:血浆KLK和组织KLK，分别由前激肽释放酶和KLK前体转换而来。它们在分子量、底物、免疫学特性、基因结构和释放的激肽种类方面有很大差异。其中，组织KLKl分解高分子激肽原(High Molecular Weight Kininogen,LMWK)生成激肽，参与多种生理过程，对血压调节、电解质平衡、炎症反应等生理或病理过程进行调控，对心脑血管疾病、不孕不育症、糖尿病肾病、视网膜静脉阻塞都有疗效。
[0003]目前，市售的KLKl主要来源于猪的胰脏提取或是人尿液提取，猪KLKl用于人类疾病的治疗有较大的免疫原性，人尿提取的KLKl产量不高，而且可能带有一些人类疾病病原。市场上还没有重组KLKl产品，对于重组KLKl药品的开发还处于初级阶段，十分有必要进行重组KLKl的研究。虽然已有毕赤酵母菌株进行可溶表达KLKl蛋白的成功实例，但是酵母表达系统工艺复杂、耗时较长，且胞内表达不利于下游蛋白分离纯化。因此本发明通过基因工程手段提供了一种成本低廉且可以大量表达重组人激肽释放酶I表达系统和表达方法。
[0004]随着后基因组计划的进行，将不断地有新的功能基因被发现、克隆和表达，将会有越来越多的重组蛋白问世；在已有的重组蛋白表达体系中，大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)原核表达系统因其操作方便、价格低廉、高效表`达和稳定性好等优点而成为生产重组蛋白的首选表达体系，其中包括重组人干扰素a 2b、重组人干扰素a lb、重组人干扰素Y、重组人白介素_2、重组人粒细胞刺激因子等重组蛋白药物。但若以人源KLKl (Homosapiens kallikreinl,以下简称hKLKl)的原始核苷酸序列直接用大肠杆菌进行表达，由于种属差异，是无法最有效的表达hKLKl的，因此仍然需要寻找到一个更适合于大肠杆菌表达的hKLKl核苷酸序列和表达方法。另一方面，由于外源基因在E.coli中的高效表达，常导致重组蛋白聚集形成不溶性、无活性的包涵体；要想得到具有生物活性的重组蛋白，必须进行包涵体的体外重折叠复性，而包涵体的复性是一个非常复杂的过程，不仅与蛋白质复性的过程控制密切相关，还很大程度上取决于目的蛋白自身的性质。hKLKl蛋白具有5对二硫键，对于hKLKl蛋白复性具有十分高的技术难度，如果复性条件不适会导致分子内二硫键的错配，同时分子间共价结合或疏水结合易形成聚合体，造成产品质量不合格，易产生沉淀析出，影响蛋白回收率和蛋白活性。虽然已有大肠杆菌表达成功的hKLKl蛋白，但只是通过复性方法制备hKLKl蛋白作为抗原制备抗体，表达hKLKl蛋白也没有明确的活性(施伟庆，张磊，孙怀昌.人胰腺激肽释放酶cDNA的克隆、序列分析和原核表达[J].农业生物技术学报，2003,11 (2):169~172)。此外，有研究人员获得带His标签的大肠杆菌表达hKLKl蛋白，但是研究结果显示其表达的hKLKl蛋白活性极低，与猪胰腺激肽释放酶相比只有0.lIU/mL (李体远，杜珙，蔡筱彦，等.人组织激肽释放酶成熟蛋白在大肠杆菌中的高效表达[J].中国生物化学与分子生物学报，2003，19 (3):312~316)。因此，本发明所要解决的另一个技术问题是:使大肠杆菌表达的人激肽释放酶I包涵体复性为具有生物活性的蛋白酶，经过简单纯化使重组激肽释放酶I具有较高纯度和活性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是克服现有技术的不足之处，首先通过密码子优化的方式，提供一种可在大肠杆菌内高效表达且有活性的重组人激肽释放酶I的基因序列和表达、纯化、复性方法。
[0006]本发明提供了一种重组人激肽释放酶1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]本发明提供了编码上述所述重组人激肽释放酶I的基因，其碱基序列如SEQ IDNO:1所示。该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列，相比之下能显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。
[0008]本发明还提供了包含了上述所述编码重组人激肽释放酶I的基因的载体，所述的载体优选为原核表达质粒，优选为pET21b或pET28a，最优选为pET21b。
[0009]本发明还提供了包含有上述所述载体的大肠杆菌菌株，优选地，所述菌株选自大肠杆菌BL21 (DE3)菌株。
[0010]本发明还提供了重组人激肽释放酶I在大肠杆菌表达方法，包括如下步骤: [0011]该方法的步骤为:
[0012]1.挑取上述所述重组人激肽释放酶I的大肠杆菌单菌落，接入LB培养液，于37°C培养过夜；
[0013]2.取过夜培养物接入于LB培养液中，于37°C震荡培养至对数中期(0D_=1.5)；
[0014]3.在培养物中加入IPTG至0.5-1.2mmol/L，于37°C，诱导表达2-5h后，于4°C离心处理并收集含有重组人激肽释放酶I的大肠杆菌菌体沉淀。
[0015]上述所述LB培养液中均含有氨苄青霉素80-120 μ g/mL。
[0016]本发明还提供了重组人激肽释放酶I的包涵体纯化方法，包括如下步骤:
[0017]1.将收集得到的上述含有诱导重组人激肽释放酶I大肠杆菌菌体沉淀，用预冷的PBS重悬，并于4°C离心处理。
[0018]2.吸去上清，称菌体沉淀重量，按湿重每克菌体加入裂解缓冲液Buffer A5_15mL。
[0019]3.按湿重每克菌体加入5-8 μ L的浓度为80mmol/L的PMSF，5-50 μ L的50mg/mL溶菌酶，重悬混匀后10-37°C保存。
[0020]4.超声或高压破碎菌体，并于4°C以离心处理，弃上清。
[0021]5.沉淀用洗涤缓冲液Buffer B重悬，并于4°C以离心处理，沉淀包涵体。
[0022]6.包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，25°C下搅拌10_60min。
[0023]7.充分重悬混匀后以4°C离心处理，弃沉淀，取上清，即得到重组人激肽释放酶I变性溶液。
[0024]该纯化方法优选步骤如下:[0025]1.将收集得到的上述含有诱导重组人激肽释放酶I大肠杆菌菌体沉淀，用预冷的PBS重悬,4°C以6000rpm离心15min ;重复一次。
[0026]2.吸去上清，称菌体沉淀重量，按湿重每克菌体加入裂解缓冲液Buffer A12mL，使菌体重悬。
[0027]3.按湿重每克菌体加入7 u L浓度为80mmol/L的PMSF, 8 u L浓度为50mg/mL的溶菌酶，重悬混匀后25°C保存。
[0028]4.超声破碎菌体，样品置于冰上，超声20min，每次3s间隔3s。超声结束，4°C以13000rpm高速离心15min,弃上清。
[0029]5.沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，4°C以13000rpm高速离心15min，收集包涵
体沉淀，重复一次。
[0030]6.包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30min，至溶液澄清。
[0031]7.充分混匀后室温下以13000rpm的转速离心15min，弃沉淀，取上清，即得到重组人激肽释放酶I变性溶液。
[0032]本发明还提供了优化后的重组人激肽释放酶I的包涵体复性纯化方法，包括如下步骤:
[0033]取适量用变性缓冲液Buffer C溶解的上述所述的重组人激肽释放酶I变性溶液，测定其浓度，然后用变性缓冲液Buffer C将蛋白浓度稀释到0.lmg/mL，4°C稀释复性。复性至16h时，将复性后重组蛋白溶液用0.22-0.45um滤膜过滤，即得到低浓度的重组人激肽释放酶I复性溶液。用Buffer E为基础缓冲液，将低浓度的重组人激肽释放酶I复性溶液上亲和色谱柱纯化，用0.25-0.35M NaCUBuffer E缓冲液洗脱收集目的峰，得到重组hKLKl纯品。并可进一步超滤脱盐、浓缩，于真空冷冻干燥机低温真空干燥，即获得重组人激肽释放酶I冻干粉末。
[0034]本发明的经优化过的重组人激肽释放酶I的基因序列，更适于大肠杆菌表达系统的表达，所表达的重组人激肽释放酶I高于人激肽释放酶I天然基因序列在大肠杆菌表达系统的表达量，表达的hKLKl为无糖基化修饰KLKl蛋白，而且表达的hKLK活性更高。尤其是本发明的上述所述表达、复性、纯化方法是经过发明人反复多次实验摸索和验证得到的用于大肠杆菌表达系统表达重组人激肽释放酶I的最为有效的方法，该方法的表达量高，且表达得到包涵体复性后活性更高。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1表示重组人激肽释放酶I密码子优化前后核苷酸序列比较
[0036]其中，奇数行(即上端基因序列)为人激肽释放酶I天然基因核苷酸序列，即密码子优化前的序列；偶数行(即下端基因序列)为本发明的重组人激肽释放酶I的基因核苷酸序列，即密码子优化后的序列。
[0037]图2-a、图2-b为重组人激肽释放酶I密码子优化前后在大肠杆菌表达宿主中CAI指数。
[0038]其中，图2-a表示人激肽释放酶I天然基因核苷酸序列在大肠杆菌表达宿主中CAI指数经过程序计算为0.70 ;图2-b表示优化后的本发明的重组人激肽释放酶I密码子在大肠杆菌表达宿主中CAI指数经过程序计算为0.88。[0039]图3_a、图3_b为人激肽释放酶I密码子优化前后在大肠杆菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图。
[0040]其中，图3_a表示人激肽释放酶I天然基因核苷酸序列在大肠杆菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图，从图中可以看出:人激肽释放酶I天然基因核苷酸序列的低利用率密码子(利用率低于50%的密码子)出现百分比为20% ;图3-b表示优化后的本发明的重组人激肽释放酶I密码子在大肠杆菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图，优化后的本发明的重组人激肽释放酶I密码子序列的低利用率密码子出现百分比为O。
[0041]图4-a、图4-b为重组人激肽释放酶I密码子优化前后在大肠杆菌表达宿主中平均GC碱基含量分布区域图。
[0042]其中，图4_a表示人激肽释放酶I天然基因核苷酸序列在大肠杆菌表达宿主中平均GC碱基含量为:56.06% ;图4-b表示优化后的本发明的重组人激肽释放酶I密码子在大肠杆菌表达宿主中平均GC碱基含量为:53.36%。
[0043]图5-a、图5-b为重组人激肽释放酶I密码子优化前后mRNA的二级结构预测图。
[0044]图5-a人激肽释放酶I天然基因mRNA的二级结构预测图，图5_b为密码子优化后的本发明的人激肽释放酶I的二级结构预测图。
[0045]图6-a为重组人激肽释放酶I表达质粒pET21b_hKLKl的构建过程图。图6_b为重组人激肽释放酶I表达质粒pET28a-hKLKl的构建过程图。
[0046]图7-a为重组人激肽释放酶I基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0047]其中，泳道I为Nde I和Xho I酶切pET21b载体；泳道2为500bp DNA Ladder ；泳道3为两端含有Nde I和Xho I酶切位点的重组人激肽释放酶I基因PCR产物。
[0048]图7_b为重组人激肽释放酶I基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0049]其中，泳道I为Nde I和Xba I酶切pET28a载体；泳道2为500bp DNA Ladder ；泳道3为两端含有Nde I和Xba I酶切位点的重组人激肽释放酶I基因PCR产物。
[0050]图8-a、图8-b为重组人激肽释放酶I的SDS-PAGE凝胶电泳图。
[0051]图8-a为重组人激肽释放酶I的SDS-PAGE凝胶电泳图。将pET21b_hKLKl转入大肠杆菌BL21 (DE3)中，检测重组人激肽释放酶I的表达情况。
[0052]其中，泳道I为(10_230kDa)宽范围预染蛋白上样Marker ;泳道2为未加入IPTG诱导的重组人激肽释放酶I大肠杆菌裂解液；泳道3为加入IPTG诱导的重组人激肽释放酶I大肠杆菌裂解液。
[0053]图8-b为重组人激肽释放酶I的SDS-PAGE凝胶电泳图。将pET28a_hKLKl转入大肠杆菌BL21 (DE3)中，检测重组人激肽释放酶I的表达情况。
[0054]其中，泳道I (10_230KDa)宽范围预染蛋白上样Marker，泳道2为加入IPTG诱导的重组人激肽释放酶I大肠杆菌裂解液:泳道3为未加入IPTG诱导的重组人激肽释放酶I大肠杆菌裂解液。
[0055]图9为重组人激肽释放酶I的免疫印迹图。
[0056]其中，泳道l(10_230KDa)宽范围预染蛋白上样Marker，泳道2为:未加入IPTG诱导的重组人激肽释放酶I大肠杆菌裂解液，泳道3未加入IPTG诱导的重组人激肽释放酶I大肠杆菌裂解液。
[0057]图10重组人激肽释放酶I高效表达诱导条件优化的SDS-PAGE凝胶电泳图。[0058]其中，泳道I为(10-230kDa)宽范围预染蛋白上样Marker ;泳道2为0.5mmol/LIPTG诱导2h的含重组人激肽释放酶I大肠杆菌裂解液；泳道3为0.5mmol/L IPTG诱导3h的含重组人激肽释放酶I大肠杆菌裂解液；泳道4为0.5mmol/L IPTG诱导4h的含重组人激肽释放酶I大肠杆菌裂解液；泳道5为0.5mmol/L IPTG诱导5h的含重组人激肽释放酶I大肠杆菌裂解液；泳道6为0.8mmol/L IPTG诱导2h的含重组人激肽释放酶I大肠杆菌裂解液；泳道7为0.8mmol/L IPTG诱导3h的含重组人激肽释放酶I大肠杆菌裂解液；泳道8为0.8mmol/L IPTG诱导4h的含重组人激肽释放酶I大肠杆菌裂解液；泳道9为0.8mmol/L IPTG诱导5h的含重组人激肽释放酶I大肠杆菌裂解液；泳道10为1.2mmol/L IPTG诱导2h的含重组人激肽释放酶I大肠杆菌裂解液；泳道11为1.2mmol/L IPTG诱导3h的含重组人激肽释放酶I大肠杆菌裂解液；泳道12为1.2mmol/L IPTG诱导4h的含重组人激肽释放酶I大肠杆菌裂解液；泳道13为1.2mmol/L IPTG诱导5h的含重组人激肽释放酶I大肠杆菌裂解液。
[0059]图11为复性后的重组人激肽释放酶I包涵体SDS-PAGE电泳图。
[0060]其中，泳道I为(10_230KDa)宽范围的预染的蛋白上样Marker ;泳道2为用BufferA超声破碎后的重组人激肽释放酶I包涵体沉淀；泳道3为Buffer B第一次清洗后重组人激肽释放酶I包涵体沉淀；泳道4为Buffer B第二次清洗后重组人激肽释放酶I包涵体沉淀；泳道5为Buffer C变性后的重组人激肽释放酶I溶液；泳道6为稀释法复性后的重组人激肽释放酶I ;泳道7为复性后重组蛋白溶液过0.22 μ m滤膜，即得到重组人激肽释放酶I复性溶液；泳道8为hKLKl复性蛋白经亲和色谱柱纯化得到的重组人激肽释放酶I蛋白样品。
[0061]图12为重组人激肽酶I复性蛋白亲和色谱柱纯化样品UPLC检测效果图。检测结果显示重组人激肽释放酶I纯化后的蛋白纯度95%以上。
[0062]其中，在检测时间为10.5min时出现的单一蛋白洗脱峰为重组人激肽释放酶I纯
化蛋白样品。
[0063]图13为重组人激肽酶I蛋白样品N端氨基酸检测效果图。
[0064]其中，图13-a为重组人激肽释放酶I纯化蛋白样品N端的第一个氨基酸为蛋氨酸(Met)，图13-b为第二个氨基酸为异亮氨酸(lie)，图13_c为第三个氨基酸为缬氨酸(Val),图13-d为第四个氨基酸为甘氨酸(Gly)，图13_e为第五个氨基酸为甘氨酸(Gly)。
[0065]图14为重组人激肽酶I蛋白样品质谱高分辨分子量检测效果图。
[0066]其中，图14为重组人激肽酶I蛋白样品的质谱高分辨分子量检测峰。质谱图显示重组人激肽酶I蛋白为单一主峰，分子量为26526Da。
【具体实施方式】
[0067]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0068]实施例1重组人激肽释放酶I基因优化设计
[0069]1.密码子优化
[0070]发明人根据GenBank已公开的人激肽释放酶I (Homo sapiens kallikreinl)的cDNA序列(GenBank登录号:NM_002257.3)和GenBank已公开的人激妝释放酶I (Homosapiens kallikrein)的氨基酸序列(GenBank登录号:AAA59455.1)，由于hKLKl存在氨基酸多态性，结合已公开的中国人胰组织激肽释放酶基因(戴勇，彭武建，李体远，等.人胰激肽释放酶基因的克隆及融合蛋白的表达[J].中国现代医学杂志，2005，15 (16):2405~2409)，去除天然表达hKLKl的信号肽和前肽氨基酸序列，确定本发明基因优化前的hKLKl基因序列，对该基因进行密码子优化后得到本发明的重组人激肽释放酶I基因，如SEQ IDNO:1所示。
[0071]下面是对重组人激肽释放酶I进行密码子优化，优化前后各参数对比如下:
[0072]1.密码子适应指数(Codon Adaptation Index, CAI)
[0073]由图2-a可知，密码子没有优化前，人激肽释放酶I天然基因在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)为0.70。由图2-b可知，通过密码子优化后，使得本发明的重组人激肽释放酶I基因在大肠杆菌中CAI指数为0.88。通常CAI=I时被认为目的基因在表达系统中是最理想的高效表达状态，CAI指数越低表明该基因在该宿主中表达水平越差，因此可以看出密码子优化后得到的hKLKl基因序列可以提高hKLKl基因在大肠杆菌中的表达水平。
[0074]2.最优密码子使用频率(Frequency of Optimal Codons, FOP)
[0075]由图3_a可知，基于大肠杆菌表达载体，密码子没有优化前，人激肽释放酶I天然基因序列的低利用率密码子出现百分比为20%。这条未进行优化的基因含有串联稀有密码子，这些密码子可能降低翻译效率，甚至能够解散翻译装配物，导致目的基因无表达或表达量不高。由图3-b可知，通过密码子优化后，本发明的重组人激肽释放酶I基因在大肠杆菌系统中出现低利用率密码子的频率为O。
[0076]3.GC 喊基含量(GC curve)
[0077]GC含量理想分布区域为30%_70%，在这个区域外的出现任何峰都会不同程度地影响转录和翻译效率。由图4-a、图4-b的人激肽释放酶I基因的GC碱基平均含量分布区域图对比可知，由图4-a中显示人`激肽释放酶I天然基因中在优化前GC碱基平均含量为56.06%,由图4-b中显示出优化后的序列消除了 GC含量在30%-70%区域外所有碱基，最终得到优化后重组人激肽释放酶I的GC碱基平均含量为53.36%。
[0078]4.优化前后顺式作用元件情况如下:
[0079]
【权利要求】
1.一种人激肽释放酶I的编码基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID N0:2所示。
2.一种含有如权利要求1所述的编码基因的原核表达质粒。
3.如权利要求2所述的原核表达质粒，其特征在于，所述质粒为pET21b或pET28a。
4.一种含有如权利要求1所述的编码基因的大肠杆菌菌株。
5.如权利要求4所述的大肠杆菌菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
6.一种重组人激肽释放酶I在大肠杆菌表达方法，包括如下步骤: (1)将如权利要求5所述的大肠杆菌菌落接入LB培养液,于37°C培养过夜； (2)取过夜培养物接入于LB培养液中，于37°C震荡培养至对数中期(0D_=1.5)； (3)在培养物中加入IPTG至0.5-1.2mmol/L，于37°C，诱导表达2_5h后，于4°C离心处理并收集含有重组人激肽释放酶I的大肠杆菌菌体沉淀。
7.如权利要求6所述的LB培养液中含有氨苄青霉素80-120u g/mL。
8.—种重组人激肽释放酶I在大肠杆菌表达后的纯化与复性方法，包括如下步骤: (1)将含有诱导重 组人激肽释放酶I的大肠杆菌菌体沉淀，用预冷的PBS重悬，并于4°C离心处理； (2)吸去上清，按湿重每克菌体加入裂解缓冲液BufferA5_15mL ； (3)按湿重每克菌体加入5-8ii L的80mmol/L PMSF, 5-50 y L的50mg/mL溶菌酶，重悬混匀后10-37°C保存； (4)超声或高压破碎菌体，并于4°C离心处理，弃上清； (5)沉淀用洗涤缓冲液BufferB重悬，并于4°C以离心处理，沉淀包涵体； (6)包涵体沉淀用变性缓冲液BufferC溶解，25°C下搅拌10_60min ； (7)充分重悬混匀后以4°C离心处理，弃沉淀，取上清，即得到重组人激肽释放酶I变性溶液； (8)继续用变性缓冲液BufferC将上述所述的重组人激肽释放酶I变性溶液溶解并稀释到蛋白浓度0.lmg/mL，4°C稀释复性，复性至16h时，将复性后重组蛋白溶液用滤膜过滤，即得到低浓度的重组人激肽释放酶I复性溶液； (9)用BufferE为基础缓冲液，将所述低浓度的重组人激肽释放酶I复性溶液上亲和色谱柱纯化，用0.25-0.35M NaCUBuffer E缓冲液洗脱收集目的峰，得到重组hKLKl纯品。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的含有诱导重组人激肽释放酶I的大肠杆菌菌体沉淀为如权利要求6所述的大肠杆菌菌体沉淀。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于: 所述 Buffer A 配比为=Tris-HCl (含量为 35mmol/L)，NaCl (含量为 0.15mol/L)，EDTA(含量为lmmol/L)，以及PMSF (含量为0.lmmol/L)，溶液基质为蒸馏水，pH为7.4 ; 所述 Buffer B 配比为=Tris-HCl (含量为 35mmol/L)，NaCl (含量为 0.15mol/L)，EDTA(含量为lmmol/L)，Triton X-100 (含量为1% (v/v)),以及尿素(含量为1.5mol/L)，溶液基质为蒸懼水，pH为7.4 ; 所述 Buffer C 配比为=Tris-HCl (含量为 45mmol/L)，NaCl (含量为 0.20mol/L)，EDTA(含量为lmmol/L)，PMSF (含量为0.lmmol/L)，尿素(含量为8mol/L)，以及DTT (含量为lOmmol/L)，溶液基质为蒸馏水，pH为7.8 ;所述 Buffer D 配比为:Tris_HCl(含量为 35mmol/L)，EDTA(含量为 lmmol/L)，GSH:GSSG(摩尔比为5:1)，L-精氨酸(含量为0.5mol/L)，甘油(含量为25% (v/v)), NaCl (含量为·0.30mol/L)，溶液基质为蒸馏水，pH为7.8 ;所述Buffer E配比为:Tris_·HCl (含量为20mmol/L)，溶液基质为蒸馏水，pH为7.3。
【文档编号】C12N1/21GK103710367SQ201310718972
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】马永, 章成昌, 王安良, 周娇娇, 徐春林, 陈晨, 王耀方 申请人:江苏众红生物工程创药研究院有限公司, 常州京森生物医药研究所有限公司