主动脉三维培养单细胞分离器的制造方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种动物组织体外培养及细胞培养的一种装置，主动脉三维培养单细胞分离器，包括两个载玻片，一个为普通载玻片，其上表面附有一层鼠尾胶原，另一个为有孔载玻片，其下表面附有一层道康宁有机硅灌封胶，将两个载玻片经过处理的面用双面胶粘合在一起，从有孔载玻片的孔洞中灌入冰浴的液体状基质胶，使之充填于两个载玻片之间。优点是：真实模拟了血管新生的状况，操作相对简单，容易观察；还能进行单细胞的研究与分离培养，并且单细胞生长在载玻片上看上去更清晰，容易观察。本实用新型主要用于培养新生血管的单个细胞及对单细胞进行分离研究。
【专利说明】主动脉三维培养单细胞分离器
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种动物组织体外培养及细胞培养的一种装置。
【背景技术】
[0002]血管新生(angiogenesis)是从已有血管发芽生成新血管的过程。血管新生可见于生理状态，如胚胎形成和组织的正常生长。此外，血管新生常见于某些病理情况，如肿瘤、伤口愈合等。血管新生在肿瘤的研究中有重要的价值，目前研究证实新生血管不仅可以增大瘤体，而且使肿瘤更容易发生转移和扩散，最终导致严重的后果。研究肿瘤的血管新生有助于了解恶性肿瘤发生、发展、侵袭和转移的生物学特性，并对阐明机制、估计预后以及进行抗血管新生治疗等有着重要的理论意义和临床价值。
[0003]国内外已经建立了许多研究新生血管的模型，体外模型是基于内皮细胞在支持基质上培养能形成管腔结构的原则建立的，如细胞或组织培养模型。体内模型是在动物体内研究血管新生，如角膜血管新生模型，鸡胚尿囊膜血管生长模型和聚合物植入模型。
[0004]角膜血管新生模型是将生长因子注射到角膜上，或加入在角膜上切口形成的小袋中，通过裂隙灯显微镜观察巩膜静脉窦血管丛向角膜内生长的情况。角膜试验手术操作难度大，手术后还无可避免存在炎症反应，而且生成的血管不规则，难以定量。
[0005]鸡胚尿囊膜血管生长模型(CAM)是将药物加到载体如明胶海绵、甲基纤维素、混合纤维素滤膜或滤纸上，放在开窗暴露的尿囊膜上，三天后观察尿囊膜上血管生长情况。CAM模型适用于大规模药物筛选，但是CAM本身的血管网络使新生成的血管难以辨识，而且7到8天开始有炎症反应，阻碍了新生血管的分辨。
[0006]聚合物植入模型，常用基质胶或海绵。基质胶法是将基质胶注射到小鼠或大鼠体内，温度升高使基质胶固化形成栓子。7天后用组织化学法或免疫组化法检测血管长入栓子的情况，或者检测栓子中血红蛋白含量。此方法的缺点是基质胶价格昂贵，分析比较耗时。
[0007]体外模型中细胞培养模型是将内皮细胞种植于预铺了胶原或纤维蛋白、基质胶的培养皿中，观察内皮细胞在平面上形成的毛细血管样结构。这种模型操作简单，能展示细胞由休眠到芽生的过程，但是由于细胞不是从已有的血管长出的，不能完全模拟真正的血管新生。
[0008]组织模型是将外植体如主动脉环包埋在基质如胶原凝胶、血浆凝块、纯化的纤维蛋白、基质胶或这几种蛋白的混合物中培养，观察从内膜长出的内皮细胞在凝胶内向四周形成毛细血管样结构。主动脉环模型模拟的条件更接近体内环境，它包含了周围的非内皮细胞，如平滑肌细胞和周细胞，还有基质支持。此外，内皮细胞不是传代的细胞，也没有处于增殖阶段，这更能够代表目前发现的体内血管新生的真实状况。因此，主动脉环模型是较为理想的血管新生模型，是目前血管新生研究中应用最广泛的检测方法。
[0009]在研究分子生物学机制时，有时需要对细胞进行分离和鉴定，并观察细胞形态，但上述这些模型都没办法达到单细胞研究，也不可能实现单细胞的分离。并且利用这些模型新生的血管，结构是立体的，很难用显微镜清晰的观察。
【发明内容】
[0010]为了克服现有技术存在的缺点，本实用新型的目的是在主动脉环模型的基础上发明一种能清晰地观察新生血管的单个细胞及对单细胞进行分离研究的仪器。
[0011]为了达到上述目的，本实用新型采用的技术方案是:主动脉三维培养单细胞分离器，其特征在于:包括两个载玻片，一个为普通载玻片，其上表面附有一层鼠尾胶原，另一个为有孔载玻片，其下表面附有一层有机硅灌封胶，将两个载玻片经过处理的面用双面胶粘合在一起，从有孔载玻片的孔洞中灌入冰浴的液体状基质胶，使之充填于两个载玻片之间。有孔载玻片的一面用有机硅灌封胶处理后，具有了疏水的特性，细胞培养液不会沾到此面，因此细胞不会贴在此面生长；而普通载玻片用鼠尾胶原处理后，细胞以其为生物支架贴附其上生长。两个载玻片之间的间隙厚度为双面胶的厚度，可以控制在0.2-0.5_，为一个细胞可以生长的空间。
[0012]本实用新型是对体外培养模型主动脉环组织培养的改进，将细胞的生长限定在两个载玻片中间的空间中，从而保证了一个细胞的生长，便于显微镜观察及拍照。
[0013]本实用新型与现有技术相比，优点是:本模型是在主动脉环模型基础上的改进，拥有主动脉环模型的优点，如真实模拟了血管新生的状况，操作相对简单，容易观察；还能进行单细胞的研究与分离培养，并且单细胞生长在载玻片上看上去更清晰，容易观察。本实用新型主要用于培养新生血管的单个细胞及对单细胞进行分离研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]下面结合附图对本实用新型做进一步的说明。
[0015]图1是本实用新型的结构分解示意图。
[0016]图2是本实用新型的结构示意图。
[0017]【具体实施方式】
[0018]如图1所示，本实用新型包括两个用双面胶4粘合在一起的载玻片，下面一个为普通载玻片I，其上表面附有一层鼠尾胶原，上面一个为有孔3的载玻片2,其下表面附有一层道康宁有机硅灌封胶，两个载玻片之间充填有冰浴的液体状基质胶。
[0019]制作时，有孔载玻片2和普通载玻片I需经过清洗、酸处理、酒精浸泡后晾干，在超净工作台中紫外线照射2小时，然后在超净工作台中，将有孔载玻片2的下表面和普通载玻片I的上表面分别用道康宁有机硅灌封胶和鼠尾胶原处理，将有孔载玻片2和普通载玻片I经过处理的向对面用双面胶4粘合在一起，再用紫外线照射2小时，此时双面胶也一起进行照射。然后将粘合、照射好的装置放到培养皿中，直接进行后续实验或封口膜密封，放置于4度冰箱保存。提前一天从-20度冰箱取出用于三维培养主动脉的基质胶，将其从有孔载玻片2的孔洞3注入用于三维培养主动脉的基质胶，借助虹吸作用使之充填于两个载玻片之间。
[0020]使用时，在超净工作台中，将大鼠的主动脉取出，PBS清洗，切成小片，放于有孔载玻片2的孔洞3中，将此装置连同培养皿在37摄氏度，5% C02的培养箱中孵育20分钟，基质胶凝固后，取出装置及培养皿，在超净工作台中加入培养液，再放回培养箱中，继续培养3到7天，隔一天换一次液。从主动脉游离出的细胞会在两个载玻片之间生长，大约一周左右会形成新生血管。有孔载玻片2涂的是疏水的有机灌封胶，细胞不会在这一面生长，而只能生长在用鼠尾胶原处理的普通载玻片I上。可以直接肉眼观察或用显微镜观察培养皿中普通载玻片上生长的细胞并进行拍照，也可以将此实用新型从培养皿中取出，将有孔载玻片2去掉，进行吖啶橙染色、免疫细胞化学染色及在超净工作台中进行分离培养等后续操作。双面胶3的厚度，即两个载玻片之间的距离控制在0.2-0.5mm之间，只允许单个细胞的生长，从而保证所研究的细胞是单细胞，最后分离培养得到的细胞是单克隆，并且单个细胞便于清晰地观察及拍照。
【权利要求】
1.主动脉三维培养单细胞分离器，其特征在于:包括两个用双面胶(4)粘合在一起的载玻片，下面一个为普通载玻片(1)，其上表面附有一层鼠尾胶原，上面一个为有孔(3)的载玻片(2),其下表面附有一层道康宁有机娃灌封胶,两个载玻片之间充填有冰浴的液体状基质月父。
2.根据权利要求1所述的主动脉三维培养单细胞分离器，其特征在于，两个载玻片的间距为 0.2-0.5mm。
【文档编号】C12M3/04GK203411544SQ201320241787
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年4月25日 优先权日:2013年4月25日
【发明者】颜凤, 蒋凡 申请人:颜凤