一种异常毕赤酵母菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了属于微生物【技术领域】的一种异常毕赤酵母菌及其应用。本发明的异常毕赤酵母菌（Pichia?anomala），菌株为YPL6，保藏号为：CGMCC?No.8041。所述异常毕赤酵母菌（Pichia?anomala）YPL6及其代谢产物对桃采后褐腐病菌、苹果采后灰霉病菌、苹果采后青霉病菌和梨采后青霉病菌具有抑制作用；对桃采后褐腐病、苹果采后灰霉病、梨采后青霉病、苹果采后青霉病具有抑制作用。
【专利说明】一种异常毕赤酵母菌及其应用【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，具体涉及一种异常毕赤酵母菌及其应用。
【背景技术】
[0002]植物真菌病害给农业生产带来了巨大的损失，而果实采后真菌病害是一类重要的病害，造成了果实的大量减产，严重影响了果实的食用价值和市场价值，导致了果农的经济收入降低。在发达国家，果实采后病害引起的损失量占果实总量的15%以上，在发展中国家由于缺少必要的防控技术和设备，果实采后病害引起的损失量占总量的30%甚至更高上。果实采后病害的发生已给现代农业生产尤其是高端果蔬产品生产与加工造成了严重影响。而目前，国内大多的研究多集中于果实的田间及园间防治，而对于果实采后病害的防治工作做的相对较少。
[0003]由Botrytis cinerea病原菌引起的苹果灰霉病和由P.expansum病原菌引起的青霉病菌是苹果果实主要的采后病害。目前在世界范围，苹果灰霉病和苹果请霉病都是影响苹果产业发展的重要因素。苹果灰霉病和青霉病多发于苹果采摘、运输及贮存期间，因此，对苹果灰霉病和青霉病的防控显得非常重要。而目前，国内对二者病害能够有效防治的手段不多，即便是化学农药，有效的种类也不是很多。而苹果作为人们桌上的经常食用的果实，对食品安全方面要求较高。
[0004]由Monilinia spp.病原真菌引起的桃褐腐病目前在世界范围内都是桃子的第一大病害，也是影响桃产业发展的第一大问题。据统计，在发达国家如美国、以色列、意大利、法国等，采后褐腐病导致的损失量就占桃总产量的10%-30%;在发展中国家由于缺少必要的防治技术和相关设备其损失量达30%-50%，甚至更高；有些地区，桃褐腐病的大面积严重发生，几乎导致桃果实绝收。因此，对桃褐腐病的防治和控制显得迫切和重要。
[0005]目前生产中对苹果灰霉·病、青霉病和桃褐腐病的防治仍然以化防为主，但由此带来的“3R”负面影响非常严重。化学农药的大量使用严重破坏了生态环境，导致果实中大量的农药残留，影响人们身体健康。生物防治，利用拮抗微生物防治病害，已成为病害综合防治的重要组成部分，是化学农药试剂应用最有前景的替代手段之一。
[0006]异常毕赤酵母菌(Pichia anomala)在自然环境中普遍存在,主要存在于含糖量较为丰富的果实表面和花上。该菌生长速度快，营养简单，生长力强。在作为生防防治方面，它拥有自己独特的优势:1)该酵母菌对环境的污染较少，不产生毒素；2)该酵母菌不产生抗生素，对人类相对比较安全；3)相对于真菌而言，该酵母菌不产生致敏孢子；4)该酵母生长所需营养比较简单；5)该酵母适合商业化大规模生产；6)酵母菌细胞结构简单，基因组较小，比较容易在分子水平上进行操作。因此，它具有很好的应用前景。
[0007]异常毕赤酵母菌(Pichia anomala)在自然界中分布十分广阔,而目前国内还未有防治苹果灰霉病、青霉病和桃褐腐病的异常毕赤酵母菌(Pichia anomala)的报道。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种异常毕赤酵母菌(Pichia anomala),菌株为YPL6,保藏号为:CGMCC N0.8041。
[0009]本发明的目的也在于提供一种病原菌抑制剂，其活性成分为上述异常毕赤酵母菌和/或上述异常毕赤酵母菌的代谢物。
[0010]所述病原菌抑制剂对下述至少一种病原菌具有抑制作用:
[0011]A、桃采后褐腐病菌；
[0012]B、平果米后灰霉病囷；
[0013]C、平果米后青霉病囷；
[0014]D、梨米后青霉病菌。
[0015]所述桃米后褐腐病菌为Monilinia fructicola、Monilinia Iaxa 或 Moniliniafructigena ;所述苹果采后灰霉病菌为Botrytis cinerea ;所述苹果采后青霉病菌为Penicillium expansum ;所述梨米后青霉病菌为 Penicillium expansum。
[0016]本发明的目的还在于提供一种病害抑制剂，其活性成分为上述异常毕赤酵母菌和/或上述异常毕赤酵母菌的代谢物。
[0017]所述病害为下述至少一种:
[0018]A、桃采后褐腐病；
[0019]B、平果米后灰霉病；
[0020]C、平果米后青霉病；
`[0021]D、梨米后青霉病。
[0022]本发明的异常毕赤酵母菌(Pichia anomala),菌株为YPL6,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为=CGMCC N0.8041。
[0023]所述异常毕赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6为从果实表面分离得到。所述异常毕赤酵母菌(Pichia anomala)YPL6 的 5.8S rDNA 基因及 TS1/ITS2 序列如 SEQ ID N0.1 所示，26S rDNA基因序列如SEQ ID N0.2所示。
[0024]所述异常毕赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6的形态学特征为:白色奶油样菌落，营养体细胞出芽生殖，两极出芽，柠檬状细胞，无假菌丝。25°C在5%Difco麦芽糖琼脂培养基上通过细胞与芽接合形成子囊孢子，每个子囊包含1-2个盔甲状的子囊孢子。
[0025]所述异常毕赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6的生理生化特征:可进行葡萄糖发酵，不可进行棉子糖和乳糖发酵；碳源同化方面:山梨糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、D-甘露醇为阳性，半乳糖、乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、核糖醇、赤藓糖醇为阴性。所述异常毕赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6于含有5% (质量含量)氯化钠的培养基中均可正常生长，于PH4.0-5.5的培养基中均可正常生长，在环境温度为4°C下生长势弱，在40°C以上不可生长；最佳适宜生长温度为25_30°C。所述异常毕赤酵母菌(Pichia anomala)YPL6产具有抑菌作用较强的物质。
[0026]本发明的目的还在于提供上述异常毕赤酵母菌和/或其代谢物在抑制病原菌、制备病原菌抑制剂、抑制病害、制备病害抑制剂中的应用。
[0027]上述异常毕赤酵母菌(Pichia anomala)DPP2的用途中，所述病原菌为下述至少一种:
[0028]A、桃采后褐腐病菌；[0029]B、平果米后灰霉病囷；
[0030]C、平果米后青霉病囷；
[0031]D、梨米后青霉病菌；
[0032]所述病害为下述至少一种:
[0033]A、桃釆后褐腐病；
[0034]B、平果米后灰霉病；
[0035]C、苹果米后青霉病；
[0036]D、梨米后青霉病。
[0037]其中，所述桃米后褐腐病菌为Monilinia fructicola、Monilinia Iaxa 或Monilinia fructigena ;所述苹果釆后灰霉病菌为Botrytis cinerea ;所述苹果釆后青霉病菌为 Penicillium expansum ;所述梨米后青霉病菌为 Penicillium expansum。
[0038]所述异常毕赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6的代谢物可从所述异常毕赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6的发酵液中获得。
[0039]所述异常毕赤酵母菌(Pichia anomala)YPL6的代谢物具体可按照如下方法制备:在液体培养基(包括YPDJD等能使酵母菌生长的液体培养基)中培养所述异常毕赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6,除去液体培养物(发酵液)中的异常毕赤酵母菌(Pichia anomala)YPL6即得到所述异常毕赤酵·母菌(Pichia anomala) YPL6的代谢物。
[0040]本发明中的异常毕赤酵母菌(Pichia anomala)YPL6对桃釆后褐腐病菌、苹果釆后灰霉病囷、平果米后青霉病囷和梨米后青霉病囷具有抑制作用；对桃米后掲腐病、平果米后灰霉病、梨米后青霉病、苹果米后青霉病具有抑制作用。
[0041]生物材料保藏说明
[0042]分类命名:异常毕赤酵母菌(Pichia anomala)
[0043]菌株编号:YPL6
[0044]保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0045]保藏机构简称:CGMCC
[0046]地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号
[0047]保藏日期:2013年8月16日
[0048]保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.8041。
【专利附图】
【附图说明】
[0049]图1为异常毕赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6显微镜下细胞形态，YPL6生长于YNBD 培养基上，280C，48h，“一” 代表 20 μ m。
[0050]图2为异常毕赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6在桃子上对桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)引起的病斑的抑制效果。
[0051]图3为异常毕赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6在苹果上对苹果灰霉病菌(Botrytis cinerea)引起的病斑的抑制效果。
[0052]图4为异常毕赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6在苹果上对青霉病菌(Penicillium expansum)引起的病斑的抑制效果。【具体实施方式】
[0053]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0054]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0055]下述实施例中所用到的病原菌，公众可从野外采集，也可从北京市农林科学院获得:
[0056]桃褐腐病菌一链核盘菌(Monilinia fructicola(wint.)Rehm)(王菲等.桃褐腐病的发生与防治.果树花卉.2012年第5期p58)； [0057]苹果采后灰霉病菌一灰葡萄孢(Botrytis cinerea Per.ex Fr)；
[0058]苹果米后青霉病菌一展青霉菌(Penicilliumexpansum Link, 1809)；
[0059]梨米后青霉病菌一展青霉菌(Penicilliumexpansum Link, 1809)；
[0060]实施例1
[0061]本发明所述异常毕赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6的分离与菌株鉴定
[0062]1、样品采集
[0063]从有中国有机苹果园，采集果实。
[0064]2、菌株的分离筛选及拮抗筛选
[0065]从有机水果上分离菌株，采用常规梯度稀释涂布分离，用PDA (含有硫酸链霉素)和YPD琼脂(含有硫酸链霉素)共2种培养基分别在28°C条件下培养，挑取菌落形态差异较大并可纯培养的细菌，在YB)琼脂培养基上纯化保存，并以苹果灰霉病菌为靶标病原菌进行拮抗菌的初筛和多次复筛，最终得到一株抑菌活性强的酵母菌菌株，命名其为YPL6。
[0066]3、菌株的鉴定
[0067]对菌株Y68进行形态学、生理生化特性和部分保守序列的分析。参考《TheYeasts,a Taxonomic Study》(Kurtzman, C.P.(1998a).Williopsis Zender.1n TheYeasts, a Taxonomic Study, 4th edn,pp.529-920.Edited by C.P.Kurtzman&J.ff.Fell.Amsterdam:Elsevier.)中描述方法进行生理生化测定和分子生物学鉴定。
[0068]结果表明，YPL6的形态学特征:白色至奶油色的奶油样菌落，营养体细胞出芽生殖，有简单至复杂的假菌丝。25°C在5%Difco麦芽糖琼脂培养基上通过细胞与芽接合形成子囊孢子，每个子囊包含1-4个盔甲状的子囊孢子。所述异常毕赤酵母菌(Pichiaanomala) YPL6的生理生化特征:可进行葡萄糖发酵，不可进行棉子糖和乳糖发酵；碳源同化方面:山梨糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、D-甘露醇为阳性，半乳糖、乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、核糖醇、赤藓糖醇为阴性。所述异常毕赤酵母菌(Pichia anomala)YPL6于含有5% (质量含量)氯化钠的培养基中均可正常生长，于PH4.0-5.5的培养基中均可正常生长，在环境温度为4°C下生长势弱，在40°C以上不可生长；最佳适宜生长温度为25-32°C。所述异常毕赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6具有较强的抑菌活性。
[0069]异常毕赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6在显微镜下细胞形态，如图1所不，为YPL6生长于YNBD培养基上，280C，48h, “一”代表20 μ m。
[0070]异常毕赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6的5.8S rDNA基因及ITS1/ITS2核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其26S rDNA基因D1/D2区域核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0071]实施例2
[0072]本发明所述异常毕赤酵母菌(Pichia anomala) YPL6抑菌谱的测定[0073]供试病原菌:
[0074]桃褐腐病菌一链核盘菌(Moniliniafructicola (wint.) Rehm);
[0075]苹果采后灰霉病菌一灰葡萄孢(Botrytis cinerea Per.ex Fr)；
[0076]苹果米后青霉病菌--展青霉菌(Penicilliumexpansum Link, 1809)；
[0077]梨米后青霉病菌一展青霉菌(Penicilliumexpansum Link, 1809)；
[0078]选择上述病原菌为指示真菌，采用果实体内人为打孔接种生测法(以防治苹果采后灰霉病为例进行说明)。
[0079]具体操作如下:
[0080]果实体内人为打孔接种法为:将病原菌菌株在YPD液体培养基上28°C恒温培养48h，用蒸馏水调至菌液浓度为lX108cfu/ml。苹果灰霉病菌B.cinerea在PDA平板上25°C恒温培养5-7天，收集灰霉菌孢子，用蒸馏水制成IX 108cfu/ml的孢子悬浮液；成熟的苹果，先用0.5%次氯酸钠消毒之后，用灭过菌的移液器枪头，沿着苹果腰部插孔，每个果子扎孔3个，每个孔为30mmX 30mm。每孔接种30 μ I YPL6菌液，室温晾干，然后再接种30 μ I的病原菌孢子悬浮液。最后，处理的果子放置于25°C下，5-7天后，测定果实腐烂斑大小。腐烂斑小于IOmm被视为不发病。根据腐烂病斑的占总接种孔数的多少，计算发病率，未发病的病斑数占总接种孔数的多少，计算病斑抑制率。
[0081]桃褐腐病菌、苹果采后青霉病菌和梨采后青霉病菌的操作同上。
[0082]实验结果表明所述异常毕赤酵母菌(Pichia anomala)YPL6桃采后褐腐病病菌、苹果采后灰霉病菌、苹果采后青霉病菌等具有较强的抑制效果。结果见图2，图3，图4及表1。
[0083]表1.实验室条件下P.anomala YPL6对不同果实上病原菌的病斑抑制效果
【权利要求】
1.一种异常毕赤酵母菌(Pichia anomala)，菌株为YPL6，保藏号为:CGMCC N0.8041。
2.一种病原菌抑制剂，其活性成分为权利要求1所述异常毕赤酵母菌和/或权利要求1所述异常毕赤酵母菌的代谢物。
3.根据权利要求2所述的病原菌抑制剂，其特征在于，所述病原菌抑制剂对下述至少一种病原菌具有抑制作用: A、桃米后揭腐病囷； B、苹果采后灰霉病菌； C、苹果采后青霉病菌； D、梨米后青霉病菌。
4.根据权利要求3所述的病原菌抑制剂，其特征在于，所述桃采后褐腐病菌为Monilinia fructicola、Monilinia Iaxa 或 Monilinia fructigena ;所述苹果米后灰霉病菌为Botrytis cinerea ;所述苹果采后青霉病菌为Penicillium expansum ;所述梨采后青霉病菌为 Penicillium expansum。
5.一种病害抑制剂，其活性成分为权利要求1所述异常毕赤酵母菌和/或权利要求1所述异常毕赤酵母菌的代谢物。
6.根据权利要求5所述的病害抑制剂，其特征在于，所述病害为下述至少一种: A、桃米后褐腐病； B、平果米后灰霉病； C、苹果米后青霉病； D、梨米后青霉病。
7.权利要求1所述异常毕赤酵母菌和/或权利要求1所述异常毕赤酵母菌的代谢物的下述任一应用: 1)权利要求1所述异常毕赤酵母菌和/或权利要求1所述异常毕赤酵母菌的代谢物在抑制病原菌中的应用； 2)权利要求1所述异常毕赤酵母菌和/或权利要求1所述异常毕赤酵母菌的代谢物在制备病原菌抑制剂中的应用； 3)权利要求1所述异常毕赤酵母菌和/或权利要求1所述异常毕赤酵母菌的代谢物在抑制病害中的应用； 4)权利要求1所述异常毕赤酵母菌和/或权利要求1所述异常毕赤酵母菌的代谢物在制备病害抑制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述病原菌为下述至少一种: A、桃米后揭腐病囷； B、苹果采后灰霉病菌； C、苹果采后青霉病菌； D、梨米后青霉病菌； 所述病害为下述至少一种: A、桃米后褐腐病； B、平果米后灰霉病； C、苹果米后青霉病；D、梨米后青霉病。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述桃釆后褐腐病菌为Moniliniafructicola、Monilinia Iaxa 或 Monilinia fructigena ;所述苹果米后灰霉病菌为Botrytis cinerea ;所述苹果釆后青霉病菌为Penicillium expansum ;所述梨釆后青霉病菌为 Penicillium expansum。`
【文档编号】C12N1/16GK103740603SQ201410036291
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月26日 优先权日:2014年1月26日
【发明者】全利红 申请人:北京绿环国际科技有限公司