专利名称：异常毕赤酵母的制作方法
技术领域：
本发明涉及异常毕赤酵母，属于微生物领域。
背景技术：
高档次白酒深受消费者欢迎，但质高量少，其价格也逐年上涨。大量高档次以下的白酒需要使用成香成味物质含量较高的调味酒来进行勾调，从而达到较高的质量水平，符合相应的质量标准。传统的调味酒生产是以纯粮固态和半固态发酵的工艺模式进行的，一般使用大曲作为糖化发酵剂，而利用大曲中的多种细菌、酵母菌、霉菌和各种酶类(淀粉酶、果胶酶、纤维素酶、酸性蛋白酶等酶类)共同作用而获得目的产物。而现代调味酒生产逐渐趋向于纯菌种发酵，根据风味要求的不同，使用特殊功能性菌种进行相应风味调味酒的生产。其中，酯香调味酒的生产主要利用产酯酵母进行发酵。在生物领域，酵母作为模式生物，常用来作为表达外源基因的宿主菌。毕赤酵母作为一种甲醇利用型酵母菌，自20世纪80年代年开发以来，通过不断的研究，至今已有多个种属被开发出来，主要包括Candida和Pichia两个种属，共有30余种。其中尤以毕赤酵母发展最快，研究最清楚，也是目前行业内生产酯香调味酒使用较多的菌种之一。但由于酿酒行业是一个传统行业，从食品安全角度考虑，目前国内还未有酒类企业对外宣称利用转基因菌株直接进行白酒生产。因而，通过自然选育，并使用传统人工诱变的方式是目前酒类行业获取特殊功能性菌株的常用途径。尽管一些企业和研究机构对EA风味物质的生成进行过研究，也获得了一些高产乙酸乙酯的特殊功能性菌株，其相比传统大曲，虽然在产酯能力上有所提升，但总体上来看产酯量仍不能满足生产要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一株高产乙酸乙酯的异常毕赤酵母。本发明提供的异常毕赤酵母Pichia anomala JNC-EA002,该菌株于2012年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo. 5955，保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。该菌株特点如下在麦芽汁琼脂培养基上，30°C，培养24h后，菌落略突起，乳白色，表面褶皱，边缘平滑。通过显微镜观察，该菌株细胞形态为球形、卵圆形至长圆形，出牙生殖。本发明还提供了异常毕赤酵母在生产乙酸乙酯中的用途。本发明还提供了异常毕赤酵母在酿酒中的用途。本发明还提供了异常毕赤酵母在生产调味酒中的用途。本发明的菌株异常毕赤酵母Pichia anomala JNC-EA002,是从剑南春集团有限责任公司的曲药和糟醅中分离得到，先通过生产性能选育，再经过进一步紫外线(UV)诱变所获得的一株高产乙酸乙酯的菌株。
本发明菌株采用下述流程进行选育样品采集一增殖培养一纯种分离一生产性能测试一制备菌悬液一诱变前培养一诱变一变异菌株的分离筛选一遗传稳定性试验本发明的有益效果本发明的异常毕赤酵母产酯能力强，传代性好，适合长期规模化生产使用。本发明的异常毕赤酵母的产酯能力可达到8. 75g/L，为乙酸乙酯的生产提供了新的选择；也可用于酿酒生产和调味酒的生产。本发明提供的异常毕赤酵母P ichia anomala JNC-EA002,该菌株于2012年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.5955。
图I、多株菌株代谢产物中乙酸乙酯的含量，纵坐标为乙酸乙酯的含量(单位g/L)。图2、出发株和诱变株产酯能力分析，纵坐标为乙酸乙酯的含量(单位g/L)。
具体实施例方式本发明的异常毕赤酵母Pichia anomala JNC-EA002已于2012年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 5955，保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。该菌株特点如下在麦芽汁琼脂培养基上，30°C，培养24h后，菌落略突起，乳白色，表面褶皱，边缘平滑。通过显微镜观察，该菌株细胞形态为球形、卵圆形至长圆形，出牙生殖。本发明还提供了异常毕赤酵母在生产乙酸乙酯中的用途。本发明还提供了异常毕赤酵母在酿酒中的用途。本发明还提供了异常毕赤酵母在生产调味酒中的用途。本发明的异常毕赤酵母产乙酸乙酯能力强，可用于生产乙酸乙酯；该菌株是从浓香型大曲和糟醅中分离得到的，适用于酿酒生产；乙酸乙酯是白酒中的主要香味物质，故可用本发明的异常毕赤酵母生产调味酒。下述实施例中糖化液的制备中所用到的糖化发酵设备(糖化罐、喷射液化器、真空闪急冷却系统等)均由宜宾岷江集团岷江机械厂设计制造。下述实施例中的气相色谱为安捷伦(Agilent)公司6890GC，色谱柱为HP-INN0WAX,检测器温度280°C，进样口温度260°C，分流比为20 1，程序升温条件为40°C保持8min，再以5°C /min的速度升至100°C，再以15°C /min的速度升至220°C，保持8min。下述实施例中所使用的培养基均属于购买的合成培养基，麦芽汁培养基和马铃薯培养基均为北京奥博星生物有限公司产品，麦芽汁培养基的货号02-183，马铃薯培养基的货号02-023 ;酵母膏培养基为北京双旋培养基制造有限公司产品，货号为02-22。实施例I自然选育以下菌种均为剑南春集团公司的曲药和糟醅中分离纯化得到的产乙酸乙酯较高的功能性菌种。具体过程如下
①样品的采集曲药样品采集贮存期在2至3个月的浓香型大曲，选取10匹以上的半块曲砖(不同贮存室)经过粉碎、混合，获得曲药综合样。粉碎细度为能通过20目筛(即筛子20孔/cm3)的细粉含量占曲药总量的80%。糟醅选用中上层优质母糟(出窖糟)，取五点，即四角和中心部位的糟醅，每点各取200g混匀，作为I个糟醅子样品。随机取10 口窖池(不同班组)的出窖糟，获得10各糟醅子样品。在每个糟醅子样品中各取200g混匀，即选育所需的糟醅综 合样。②菌株培养曲药综合样按20g/瓶的标准装入盛有IOOmL无菌水的250mL三角瓶中；糟醅综合样按IOOg/瓶的标准装入盛有IOOmL无菌水的250mL三角瓶中。浸泡2个小时，每半小时震荡一次。取各浸泡液的上清液10mL，加入到IOOmL已灭菌(115°C，20min)的麦芽汁液体培养基中，混匀，30°C恒温、好氧培养24h。然后各取O. 5mL培养液涂在马铃薯(PDA)培养基平板上，30 0C，培养24h。选取不同菌落形态的酵母菌在麦芽汁琼脂培养基上进行纯化培养。实施例2生产性能测试菌悬液的制备用无菌棉签蘸少许蒸馏水，让棉签浸润。在已纯化的菌落上轻轻转动棉签，让棉头沾满菌种。将沾满菌种的棉签迅速插入盛装20mL无菌水的比浊管中。旋转棉签让菌种分散在无菌水中，由内向外，由慢到快，旋转抽出棉签。将菌悬液放在涡旋振荡器上摇匀后，插入细胞浓度仪中。继续通过此方法或者添加无菌水的方法，分别调整各种菌悬液的菌液浓度为IO6个/mL。发酵吸取2mL菌悬液和3mL无水乙醇，加入到已配制好的IOOmL麦芽汁培养基中(115°C，灭菌20min)，30°C恒温，好氧，静置培养72h。培养结束后，把所有发酵液倒入2000mL圆底蒸馏烧瓶中，并加入60mL质量分数为96%的酒精(分析纯)和340mL纯水。将圆底烧瓶放入2000mL电热套中，通过实验室蒸馏(蒸馏电压220V)，进行等体积蒸馏，将发酵液中乙酸乙酯全部蒸馏出来，得馏出液IOOmL,做气相色谱分析，了解每株菌株的产酯能力，挑选出生产性能高的优势菌株。分析结果见表I和图I。表I分离纯化所得产酯能力较强菌株的主要代谢产物
权利要求
1.异常毕赤酵母，保藏号为CGMCCNo. 5955。
2.权利要求I所述异常毕赤酵母在生产乙酸乙酯中的用途。
3.权利要求I所述异常毕赤酵母在酿酒中的用途。
4.权利要求I所述异常毕赤酵母在生产调味酒中的用途。
全文摘要
本发明涉及异常毕赤酵母，属于微生物领域。本发明要解决的技术问题是提供一株高产乙酸乙酯的异常毕赤酵母。本发明提供的异常毕赤酵母Pichia anomala JNC-EA002的保藏号为CGMCC No.5955。本发明还提供了该菌株在生产调味酒方面的应用。本发明的异常毕赤酵母菌株产酯能力强，适合于调味酒的大规模生产。
文档编号C12R1/84GK102876592SQ20121035857
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月24日 优先权日2012年9月24日
发明者谢义贵, 唐胜春, 石永凌 申请人:四川剑南春(集团)有限责任公司