一种降低酱油中氨基甲酸乙酯前体物质的方法
【专利摘要】本发明公开了一种降低酱油中氨基甲酸乙酯前体物质的方法，属于微生物生产利用领域。本发明将嗜盐四联球菌在成曲与盐水混合时接种，使嗜盐四联球菌浓度达到106～107CFU/mL，成功降低了酱油中氨基甲酸乙酯前体物质--瓜氨酸的含量。并且在加入菌量为106CFU/mL大大提高了酱油中的游离氨基酸含量。本发明提供的方法具有良好的工业应用价值。
【专利说明】一种降低酱油中氨基甲酸乙酯前体物质的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种降低酱油中氨基甲酸乙酯前体物质的方法，属于微生物生产利用领域。
【背景技术】
[0002]氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate, EC)被世界卫生组织归为2A类致癌物质，与丙烯胺同等危险。它能够导致肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等严重性肿瘤疾病。氨基甲酸乙酯广泛存在于传统发酵食品中，包括酒类、酱油等食品。此前中国酱油中的氯丙醇超标而被欧盟禁购的事件引起轩然大波。如今酱油中的氨基甲酸乙酯引起了国际的广泛关注，而国内对酱油中氨基甲酸乙酯的降低方法未见报道。对此我国的酱油行业应该吸取由于某些品种的酱油中氯丙醇超标引起广泛关注而带来的被动局面的教训，及早地开展研究，突破国际市场对我国调味品出口筑起的技术壁垒。
[0003]酱油中氨基甲酸乙酯前体物质主要有乙醇、瓜氨酸、尿素。对中国南方一家酱油厂的日式酱油研究结果表明:发酵终点时原油中乙醇含量为2.5%、瓜氨酸含量为2.2g/L、尿素为57mg/L。通过底物反应实验得知，乙醇和瓜氨酸是酱油中EC的主要前提物质。本研究采用在酱油发酵过程中加入一株嗜盐四联球菌降解瓜氨酸，从而降低酱油中氨基甲酸乙酯的前体物质。嗜盐四联球菌是食品安全菌。在酱油发酵过程中加入它会大大提升酱油风味，缩短生产周期。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种降低酱油中氨基甲酸乙酯前体物质的方法，是在酱油酿造过程中添加嗜盐四联球菌，降解酱油酿造过程中氨基甲酸乙酯的主要前体物质——瓜氨酸的含量。
[0005]所述嗜盐四联球菌是在成曲拌盐水时接入，使混曲中的嗜盐四联球菌达到IO6?107CFU/mL。
[0006]所述嗜盐四联球菌优选嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus) BBE R23,保藏编号为CCTCC N0:M2013480，保藏日期为2013年10月20日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，中国武汉武汉大学。
[0007]所述方法的具体步骤为:(I)制曲:脱脂大豆与炒麦浸泡8h，121°C灭菌5min，降温至80°C放气。按比例接入麸皮、面粉，大豆、炒麦、麸皮、面粉的质量比为20:15:1: 1，同时接入米曲霉孢子，接种量为8xl09个/g，恒温箱中30°C培养，6-8h翻曲一次，培养46-48h后，曲变成嫩绿色，制曲完成。(2)发酵:成曲与20% (w/v)盐水以体积比为1:1.7的比例混合，并接种嗜盐四联球菌，控温10_15°C，发酵第7天接种107CFU/mL鲁氏酵母，发酵第14天接种107CFU/mL鲁氏酵母，常温发酵，第80天结束发酵。
[0008]本发明在酱油制作过程中加入一株嗜盐四联球菌，相比未接种嗜盐四联球菌，酱油中EC的重要前体物质瓜氨酸的含量减少了 98%。而且增加了酱油中的游离氨基酸含量， 为将来工厂化降低酱油中EC含量同时提高酱油营养价值打下坚实基础。
【具体实施方式】
[0009]EC含量的测定方法:
[0010]样品处理:将以ImL超纯水配制的含尿素、乙醇、瓜氨酸的95°C 30min热反应后的样品液，用0.22 μ m滤头过滤。
[0011]GC 条件:Agilent DB_WAX30mX 0.25mmX 0.25 μ m 毛细管柱；进样 口温度:230°C，柱室温度:初始温度60°C (5min)，以3.5°C /min程序升温至150°C (保持2min)，以10°C /min,升到220°C (保持IOmin);载气:高纯氦气，柱前压80kPa,流速lmL/min,不分流,进样2uL0
[0012]MS条件:接口温度:220°C ;电离方式:EI ;电子能量:70Ev ;电子源温度230°C，四级杆温度150°C ;调谐方式:标准调谐；SIM模式；定量离子62 ;定性离子74，89 ;外标法定量。
[0013]EC标准曲线制作:用超纯水将EC标样配制成40 μ g/L、60 μ g/L、80 μ g/L、100yg/L。用GC-MS检测，在以EC浓度为横坐标，峰面积为纵坐标制作标准曲线。Υ=1662.76χ-18902.71，R2=0.997。
[0014]酱油中瓜氨酸含量的检测:
[0015]样品预处理:取ImL酱油样品，加入25mL容量瓶中。用5%(w/v)的三氯乙酸定容至25mL,放在超声仪上超脱IOmin后，放置5min (防止过热)，再超脱lOmin。静置30min,玻璃棒混匀后在虑纸上过滤。取ImL样品经过0.22 μ m虑头过滤后进样检测。
[0016]检测条件:安捷伦液相色谱仪Agilent-1100 (美国安捷伦公司)；分析方法:采用邻二甲苯(0PA)、9-忽甲基氯甲酸酯(FMOC)进行柱前衍生；色谱柱:0DS HYPERS IL(250mmX4.6mmX5 μ m);柱温:40°C ;流速:1.0ml/min ;紫外检测器:激发波长338nm、接收波长 262nm(Pro, Hypro)。
[0017]流动相A相:称取8.0g结晶乙酸钠于IOOOmL烧杯中，加入IOOOmL水搅拌至所有结晶水溶解，再加入225uL三乙胺，搅拌并滴加5%的醋酸，将pH调到7.20±0.05 ;加入5μ L四氢呋喃，混合后备用。流动相B液:称取12.0g结晶乙酸钠于800mL烧杯中，加入400mL搅拌至所有结晶溶解，滴加5%醋酸将pH调到7.20±0.05，将此溶液加入800mL乙腈和800mL甲醇，混合后备用。梯度洗脱程序见表I。
[0018]表I氨基酸分析梯度洗脱表
[0019]
【权利要求】
1.一种降低酱油中氨基甲酸乙酯前体物质的方法，其特征在于，是在酱油酿造过程中接种嗜盐四联球菌，减少氨基甲酸乙酯瓜氨酸的产生；所述嗜盐四联球菌是在成曲与盐水混合时接入，使酱醪中嗜盐四联球菌达到IO6?107CFU/mL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述嗜盐四联球菌是嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus) BBE R23，保藏编号为 CCTCC N0:M2013480。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤为:(I)制曲:脱脂大豆与炒麦经浸泡、灭菌、降温后，加入麸皮、面粉，并接种米曲霉孢子，在30°C恒温培养，待曲变成嫩绿色，制曲完成；(2)发酵:成曲拌盐水时接种嗜盐四联球菌，控温10-15°C，发酵第7天接种107CFU/mL鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii),发酵第14天再接种鲁氏酵母IO7CFU/mL，常温发酵，第80天结束发酵。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，具体步骤为:(I)制曲:脱脂大豆与炒麦浸泡8h，121°C灭菌5min，降温至80°C放气，按比例加入麸皮、面粉，大豆、炒麦、麸皮、面粉的质量比为20:15:1:1，同时接入米曲霉孢子，接种量为SxlO9个/g，30°C恒温箱中培养，6-8h翻曲一次，培养46-48h，曲变成嫩绿色，制曲完成；(2)发酵:成曲与20%(w/v)盐水以体积比为1:1.7的比例混合，并接种嗜盐四联球菌，控温10-15°C，发酵第7天接种IO7CFU/mL鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii),发酵第14天再接种鲁氏酵母107CFU/mL,常温发酵，第80天结束发酵。
【文档编号】A23L1/238GK103907801SQ201410132103
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月2日 优先权日:2014年4月2日
【发明者】陈坚, 方芳, 杨希飞, 廖淡宜, 堵国成 申请人:江南大学