获得温敏不育系的方法
【专利摘要】本发明公开了一种定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法，其包括根据RNase ZS1设计靶标序列的步骤；和构建含靶标序列片段的pU3-gRNA载体的步骤；和构建含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体的步骤；和获得转基因苗的步骤；和突变位点的鉴定步骤；以及获得不带转基因成分的温敏不育系的步骤。本发明的方法彻底的失活了RNase ZS1蛋白的活性，实现人工培育不带转基因成分的温敏不育系，同时与利用化学、物理诱变获得的突变体没有本质的区别，具有目的性强，基因组的损伤小，规避了转基因带来的可能风险。
【专利说明】-种定点突变RNase Zs1获得温敏不育系的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水稻温敏不育系的突变方法，具体涉及一种定点突变RNase Zsi获得温 敏不育系的方法。
【背景技术】
[0002] 水稻（Oryza sativa L.)是最主要的粮食作物之一，全世界超过一半的人口都以 水稻为主食（Miura et al.，2010)。随着人口的增长和可耕地面积的减少，粮食的供需变得 越来越不平衡（Gupta et al.，2006)，增加粮食单位面积广量已成为解决粮食供需不平衡 的关键措施之一。幸运的是，杂交水稻可以比常规优质水稻提高20-30%的产量，在解决粮 食短缺的问题上起到了非常重要的作用，因此，杂交水稻的种植面积逐年上升，现已超过水 稻种植面积的 60% (cheng et al.，2007 ;Normile, 2008 ;Su et al.，2012)。
[0003] 根据所使用的不育系类型的不同，杂交水稻育种的方法主要分为两系法和三系法 (cheng et al.，2007)。三系法通过使用细胞质雄性不育系和恢复系产生杂种Fl代种子， 利用保持系和细胞质雄性不育系杂交保留细胞质雄性不育系（Wang et al.，2006 ;Fujii et al·，2009 ;Itabashi et al·，2011 ;Luo et al·，2013 ;Chen et al·，2014);但是只有少 数水稻品种可以作为恢复系，这大大降低了恢复系与不育系间的遗传多样性，限制了杂种 优势的利用（Zhang et al.，1994 ;Zhou et al.，2012 ;Zhang et al.，2013)。而两系法主 要利用光/温敏雄性核不育系来实现，因为光/温敏不育系育性受日长和温度调控，在不 育条件下可作为不育系，在可育条件下可作为保持系，一系两用。而且由于不受核质互作影 响，几乎所有的正常品种都可以作为恢复系（袁隆平，1994 ;Zhang et al.，1994 ;Ding et al.，2012a)。基于这个本质上的差异，两系法杂交技术具有更为广泛的恢复系，不需要特殊 的恢复基因，使得配组更加自由，利于亚种间杂种优势的利用，对提高杂交稻组合的产量、 米质、抗性等存在更大的潜在优势；不育系可一系两用，不需要保持系，简化了生产程序； 温敏不育受核基因控制，与细胞质无关，丰富了细胞质遗传物质的多样性，可以避免三系杂 交稻不育细胞质的负效应和细胞质单一可能带来的潜在危险（王效宁等，2005 ;Yang et al·，2007;蔡春苗等，2008 ;Zhou et al·，2012 ;Zhang et al·，2013)。因此，温敏不育系在 杂交水稻育种中潜力巨大，相比而言，目前广泛应用的为温敏不育系。
[0004] 安农S-I温敏不育水稻是第一个被发现的籼型温敏不育系（邓华凤等，1999)，温 敏不育材料往往通过自然突变获得，自然突变频率非常低，而用传统育种手段将自然突变 的温敏不育材料培育成为温敏不育系过程漫长，如何提高温敏不育系的培育效率已成为迫 切需要解决的问题。要突破传统育种的局限，必须使用基因工程手段。尽管，RNAi和反义 RNA技术可以实现对基因的抑制表达，但是并不能彻底删除基因的功能，基因残留的功能 会提高转基因植株的不育起点温度，不利于育种的安全，而且转基因植株中会残留外源序 列，涉及转基因安全问题。近年来，定点突变技术取得了突破性进展，比如ZFN(Zinc finger nucleases), TALEN(Transcriptionactivator-like effector nucleases)和 CRISPR/ Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated)已广泛应用于各种生物中。这些方法都是通过靶识别序列或引导序列将核 酸酶引导到靶标位置，然后核酸酶切割靶标DNA，在细胞自身修复系统的作用下将切断的 DNA修复链接起来，但是在修复过程中往往会导致碱基丢失。目前，已经通过RNAi技术干 涉RNase ZS1，获得温敏不育植株；但是RNAi技术只是降低了 RNase Zsi的表达量，并不能彻 底的使其失活，使转基因植株有较高的不育起点温度，且不育起点温度不稳定，影响制种安 全。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种定点突变RNase Zsi获得温 敏不育系的方法，彻底的失活了 RNase Zsi蛋白的活性，实现人工培育不带转基因成分的温 敏不育系，同时与利用化学、物理诱变获得的突变体没有本质的区别，具有目的性强，基因 组的损伤小，规避了转基因带来的可能风险。
[0006] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0007] -种定点突变RNase Zsi获得温敏不育系的方法，其包括
[0008] 利用 CRISPR/Cas9 系统根据 RNase Zsi (0s02g0214300 或 L0C_0s02gl2290)设计靶 标序列的步骤；和
[0009] 构建含靶标序列片段的pU3_gRNA载体的步骤；和
[0010] 构建含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体的步骤；和
[0011] 获得转基因苗的步骤；和
[0012] 突变位点的鉴定步骤；以及
[0013] 获得不带转基因成分的温敏不育系的步骤。
[0014] 本发明所述靶标双链片段中的一条链具有以下结构：5' -NX-NGG_3'，也可以是 5' -Nx-NAG-3'或5' -Nx-NGA-3'，N表示A，T，C和G中的任意一个，14彡X彡30。较佳的靶 位点序列以A或G开头。本发明根据靶标的设计原则在RNase Zsi的编码区可以找到148 个 5' -Nx-NGG-3'，121 个 5' -Nx-NAG-3'，133 个 5' -Nx-NGA-3' 序列作为靶标。
[0015] 上述方案中，构建含祀标序列片段的pU3_gRNA载体具体步骤为：首先合成带粘性 末端的靶标引物，将接头引物变性后移至室温冷却完成退火；将退火后的引物链接到经酶 切后的pU3-gRNA载体上，经PCR扩增和测序验证阳性质粒。
[0016] 上述方案中，构建含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体是将含靶标序列片段的 gRNA表达盒从pU3-gRNA上切下，然后链接到含Cas9表达盒的pCRISPR/Cas9载体上。
[0017] 上述方案中，获得转基因苗的步骤是将含靶标的pCRISPR/Cas9载体转化水稻愈 伤组织，经筛选，分化和生根成苗，将转基因植株种植于网室；通过潮霉素鉴定阳性转基因 植株。本发明中将含靶标的PCRISPR/Cas9载体转化水稻愈伤组织的方法是通过农杆菌介 导的遗传转化或基因枪法。也可以是能实现其转化的其他生物学方法。
[0018] 上述方案中，突变位点的鉴定步骤具体为：提取阳性植株的DNA，设计引物扩增上 述DNA，经纯化后，测序，分析突变情况。
[0019] 上述方案中，获得不带转基因成分的温敏不育系的步骤具体为：收获Ttl代实现定 点突变的植株的种子，在长日/高温条件下种植T 1代植株，通过表型观察和潮霉素阳性检 测分离到不带转基因成分但表型不育的植株种植于短日/低温条件下，育性恢复可育的植 株作为温敏不育株，经自交或回交等方法繁殖后获得温敏不育系。
[0020] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0021] 1.本发明所述的定点突变RNase Zsi获得温敏不育系的方法，利用上述技术定点 突变已克隆到的温敏不育基因，实现了人工培育温敏不育系，并且这种温敏不育系是可以 不带转基因成分的，与利用化学、物理诱变获得的突变体没有本质的区别，只是目的性强， 基因组的损伤小，规避了转基因带来的可能风险；
[0022] 2.本发明所述的定点突变RNase Zsi获得温敏不育系的方法加快了育种的进程， 节省了时间、成本；
[0023] 3.传统育种无论回交多少代都会或多或少的改变遗传背景，可能导致一些优良性 状丢失。本发明所述的定点突变RNase Zsi获得温敏不育系的方法不改变受体材料的遗传背 景，并可以通过将三系的保持系定点突变为温敏不育系，达到三系杂交稻改为两系杂交稻， 拓宽恢复系的筛选范围，提高杂种优势利用效率，进而提高产量和稻米品质；
[0024] 4.本实验室研究发现，安农S-I的育性主要受温度控制，不育起点温度在26°C 左右，发明人通过图位克隆和功能互补已经确定tms5编码RNase Zsi蛋白，温敏不育系中 RNase Zsi编码区第71位碱基由C突变成A，形成提前终止密码；本发明通过测序35个主 流实用型温敏不育系，发现33个温敏不育系的tms5序列与安农S-I -致，而另外2个温敏 不育系的 p/tmsl2_l 序列（参见 Hai Zhou et al·，Photoperiod and thermo-sensitive genic male sterility in rice are caused by a point mutation in a novel noncoding RNA that produces a small RNA. Cell Research，22(4) :649_660,2012)与培矮64S-致； 说明通过自然突变或传统的人工诱变tms5(RNaSe ZS1)失活的新突变是非常困难的；诱变 新的可用于两系杂交育种的温敏不育系也是非常困难的。因此，本方法改变了这一现状。
[0025] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为本发明实施例1所获得的tms5-l-6的T1代植株潮霉素阳性检测结果图， 其中1-12分别为tms5-l-6的T 1代植株中的12株；
[0027] 图2为实施例1中tms5-l-6-ll是tms5-l-6的T1代植株中第11株在不同温度条 件下生长时的花粉育性结果图，其中，HT表示高温，LT表示低温，WT表示转基因前的植株；
[0028] 图3为本发明实施例2获得的tms5-2不同温度条件下的花粉育性，其中ZHll表 示野生型水稻中花11，HT表示高温，LT表示低温；
[0029] 图4为本发明实施例3获得的tms5-3不同温度条件下的花粉育性，其中ZHll表 示野生型水稻中花11，HT表示高温，LT表示低温；
[0030] 图5为本发明应用实施例中转化籼稻品种获得的tms5-l不同温度条件下的花粉 育性，其中ZS97B表示野生型水稻籼稻三系保持系-珍汕97B，HT表示高温，LT表示低温。
【具体实施方式】
[0031] 实施例1
[0032] 在粳稻品种中花11中利用CRISPR/Cas9系统定点突变RNase Zsi (0s02g0214300) 获得温敏不育系，具体步骤如下：
[0033] 1)靶标序列设计：
[0034] Target-tms5-l(SEQ ID NO. I) :TGGAGGGCATCTCCATCGGCGG (位于 0s02g0214300 编 码区的107-128).
[0035] 2)含 Target-tms5-l 片段的 pU3-gRNA 载体构建：
[0036] 首先合成带粘性末端的靶标引物tms5-l F(SEQ ID NO. 2): GCCGTGGAGGGCATCTCCATCGG，tms5-l R(SEQ ID N03) :AAACCCGATGGAGATGCCCTCCA;将接头引 物变性后移至室温冷却完成退火，将退火后的引物链接到经酶切后的pU3-gRNA载体上；经 PCR扩增和测序验证阳性质粒；
[0037] 3)含 Target-tms5_l 片段的 pCRISPR/Cas9 载体构建：
[0038] 将含Target-tms5_l片段的gRNA表达盒从pU3_gRNA上切下，然后链接到含Cas9 表达盒的pCRISPR/Cas9载体上；
[0039] 4)转基因苗的获得：
[0040] 将含靶标的pCRISPR/Cas9载体通过农杆菌介导的遗传转化转化水稻愈伤组织； 经筛选，分化和生根成苗，将转基因植株种植于网室，通过潮霉素鉴定阳性转基因植株；
[0041] 5)突变位点的鉴定：
[0042] 提取阳性植株的 DNA，用引物 tms5-4F(SEQ ID NO. 4) :CGTGTTCACCCTTCCAACCT 和 tms5-4R(SEQ ID NO. 5) :GCTCGTGCTCCTGACCAATC扩增上述DNA，产物经纯化后送公司测序， 测序结果与转基因前的野生型植株序列比较，具体参见SEQ ID NO. 6-SEQ ID NO. 12;分析 突变情况；测序结果显示：突变植株占总阳性转基因植株的70%，突变类型为碱基插入或 删除，突变位置始于NGG上游第3到4个碱基之间；
[0043] WT(SEQ ID NO. 6) ：CGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCATCTCCATCGGCGGGCAGGAGACCTGCGTCA TCTTCCC
[0044] tms5-l-l(SEQ ID NO. 7) ：CGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCATCTCCATCGGACGGGCAGGAGACC TGCGTCATCTTCCC
[0045] tms5-l-2(SEQ ID NO. 8) :CGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCATCTCCA**GGCGGGCAGGAGACCT GCGTCATCTTCCC
[0046] tms5-l-3(SEQ ID NO. 9) :CGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCATCTCCA***GCGGGCAGGAGACCT GCGTCATCTTCCC
[0047] tms5-l-4(SEQ ID NO. 10) :CGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCATCTCC******GGGCAGGAGACC TGCGTCATCTTCCC
[0048] tms5-l-5(SEQ ID NO. 11) :CGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCATCT***********CAGGAGACC TGCGTCATCTTCCC
[0049] tms5-l_6(SEQ ID NO. I2) :CGAGGGCTACCCCGT****************GGCGGGCAGGAGACC TGCGTCATCTTCCC
[0050] 其中，tms5-l-l，-2, -3, -4, -5和-6表示不同的转基因株系；WT表示野生型；序 列中"Δ"表不插入的喊基，表不喊基缺失；喊基的缺失和插入说明定点突变成功；
[0051] 6)不带转基因成分的温敏不育系的获得：
[0052] 收获Ttl代实现定点突变的植株的种子，在长日/高温条件下种植T1代植株，通过 表型观察和潮霉素阳性检测分离到不带转基因成分（图1)但表型不育的植株种植于短日/ 低温条件下，结果参见图2,育性恢复可育的植株作为温敏不育株，经繁殖后获得温敏不育 系。
[0053] 图1结果表明，T1代植株中4、10和11是不带转基因成分的；图2结果表明10号 植株在高温下表现为花粉败育，而低温下表现为育性恢复。
[0054] 实施例2
[0055] 在粳稻品种中花11中利用CRISPR/Cas9系统定点突变RNase Zsi (0s02g0214300) 获得温敏不育系，具体步骤如下：
[0056] 1)靶标序列设计：
[0057] Target-tms5-2(SEQ ID NO. 13) :GCAGCTGAAGCTGTCAGGTGTGG (位于 0s02g0214300 编码区的552-574);
[0058] 2)含 Target-tms5_2 片段的 pU6_gRNA 载体构建：
[0059] 首先合成带粘性末端（下划线部分）的祀标引物tms5-2 F(SEQ ID NO. 14): GCCGCAGCTGAAGCTGTCAGGTG，tms5-2 R(SEQ ID N0.15) :AAACCACCTGACAGCTTCAGCTG;将接头 引物变性后移至室温冷却完成退火，将退火后的引物链接到经酶切后的pU6-gRNA载体上， 经PCR扩增和测序验证阳性质粒；
[0060] 3)含 Target-tms5_2 片段的 pCRISPR/Cas9 载体构建：
[0061] 将含Target-tms5-2片段的gRNA表达盒从pU6-gRNA上切下，然后链接到含Cas9 表达盒的pCRISPR/Cas9载体上；
[0062] 4)转基因苗的获得：
[0063] 将含祀标的pCRISPR/Cas9载体通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻粳稻品种 中花11愈伤组织，经筛选，分化和生根成苗，将转基因植株种植于网室；通过潮霉素鉴定阳 性转基因植株；
[0064] 5)突变位点的鉴定：
[0065] 提取阳性植株的 DNA，用引物 tms5-5F(SEQ ID NO. 16) :CAGGAGTTCCTCTTCATCTC 和 tms5-5R(SEQ ID NO. 17) :AGGCACCGTCAATGTATTCG 扩增上述 DNA，经纯化后送公司测序，分 析突变情况，测序结果与转基因前的野生型水稻中花比较，具体参见SEQ ID NO. 18-SEQ ID NO. 22 ;显示：突变植株占总阳性转基因植株的60%，突变类型为碱基插入或删除，突变位 置始于PAM序列TGG上游第3到4个碱基之间；
[0066] ZHll(SEQ ID NO. 18) ：TCCCTGGGAGCGAGATCAAGCAGCTGAAGCTGTCAGGTGTGGAGGTCTGT TGTTGTTGTTTTT
[0067] tms5-2-l(SEQ ID NO. 19) ：TCCCTGGGAGCGAGATCAAGCAGCTGAAGCTGTCAGCGTGTGGAGG TCTGTTGTTGTTGTTTTT
[0068] tms5-2-2(SEQ ID NO. 20) ：TCCCTGGGAGCGAGATCAAGCAGCTGAAGCTGTCA*GTGTGGAGGT CTGTTGTTGTTGTTTTT
[0069] tms5-2-3(SEQ ID NO. 21) :TCCCTGGGAGCGAGATCAAGCAGCTGAAGCTGTC**GTGTGGAGGT CTGTTGTTGTTGTTTTT
[0070] tms5-2-4(SEQ ID NO. 22) :TCCCTGGGAGCGAGATCAAGCAGCTGAAGCT****GGTGTGGAGGT CTGTTGTTGTTGTTTTT ；
[0071] 6)不带转基因成分的温敏不育系的获得：
[0072] 收获Ttl代实现定点突变的植株的种子，在长日/高温条件下种植T1代植株，通过 表型观察和潮霉素阳性检测分离到不带转基因成分但表型不育的植株种植于短日/低温 条件下，结果参见图3,育性恢复可育的植株作为温敏不育株，经繁殖后获得温敏不育系。
[0073] tms5-2-l，-2, -3和-4表示不同的转基因株系；ZHll表示野生型水稻中花11 ;序 列中"S"喊基表不插入的喊基，表不喊基缺失；喊基的缺失和插入说明定点突变成功。 图3的结果表明tms5-2突变植株在高温下表现为花粉败育，而低温下表现为育性恢复。
[0074] 实施例3
[0075] 在粳稻品种中花11中利用CRISPR/Cas9系统定点突变RNase Zsi (0s02g0214300) 获得温敏不育系，具体步骤如下：
[0076] 1)靶标序列设计：
[0077] Target-tms5-3(SEQ ID NO. 23) :AACCTCGTCCCCCTCGAGATTGG (位于 0s02g0214300 编码区的388-410);
[0078] 2)含 Target-tms5_3 片段的 pU3_gRNA 载体构建：
[0079] 首先合成带粘性末端（下划线部分）的靶标引物tms5-3 F(SEQ ID N0.24): GGCAACCTCGTCCCCCTCGAGAT，tms5-3R(SEQ ID N0.25) :AAACATCTCGAGGGGGACGAGGT;将接头 引物变性后移至室温冷却完成退火，将退火后的引物链接到经酶切后的pU3-gRNA载体上， 经PCR扩增和测序验证阳性质粒；
[0080] 3)含 Target-tms5_3 片段的 pCRISPR/Cas9 载体构建：
[0081] 将含Target-tms5-3片段的gRNA表达盒从pU3-gRNA上切下，然后链接到含Cas9 表达盒的pCRISPR/Cas9载体上；
[0082] 4)转基因苗的获得：
[0083] 将含靶标的pCRISPR/Cas9载体通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻粳稻品种 中花11愈伤组织，经筛选，分化和生根成苗，将转基因植株种植于网室，通过潮霉素鉴定阳 性转基因植株；
[0084] 5)突变位点的鉴定：
[0085] 提取阳性植株的 DNA，用引物 tms5-4F(SEQ ID NO. 4) :CGTGTTCACCCTTCCAACCT 和 tms5-4R(SEQ ID NO. 5) :GCTCGTGCTCCTGACCAATC扩增上述DNA，经纯化后送公司测序，分析 突变情况，测序结果及野生型水稻中花的序列参见SEQ ID NO. 26-SEQ ID NO. 31 :突变植株 占总阳性转基因植株的70%，突变类型为碱基插入或删除，突变位置始于NGG上游第3到4 个碱基之间；
[0086] ZHll(SEQ ID NO. 26) ：CAGTCCGAGCTCAGCCACAACCTCGTCCCCCTCGAGATTGGTCAGGAGCA CGAGCTCAGG
[0087] tms5-3-l(SEQ ID NO. 27) ：CAGTCCGAGCTCAGCCACAACCTCGTCCCCCTCGAAGATTGGTCAG GAGCACGAGCTCAGG
[0088] tms5-3-2(SEQ ID NO. 28) ：CAGTCCGAGCTCAGCCACAACCTCGTCCCCCTCGATGATTGGTCAG GAGCACGAGCTCAGG
[0089] tms5-3-3(SEQ ID NO. 29) :CAGTCCGAGCTCAGCCACAACCTCGTCCCCCTCGA*ATTGGTCAGG AGCACGAGCTCAGG
[0090] tms5-3-4(SEQ ID NO. 30) :CAGTCCGAGCTCAGCCACAACCTC****************GTCAGG AGCACGAGCTCAGG
[0091] tms5-3-5(SEQ ID NO. 31) :CAGTCCGAGCTCAGCCACAACCTC*********************G AGCACGAGCTCAGG
[0092] 其中，tms5-3-l，-2, -3, -4和-5表不不同的转基因株系；序列中方喊基"A"和"工" 表不插入的喊基，表不喊基缺失；喊基的缺失和插入说明定点突变成功；
[0093] 6)不带转基因成分的温敏不育系的获得：
[0094] 收获TO代实现定点突变的植株的种子，在长日/高温条件下种植Tl代植株，通过 表型观察和潮霉素阳性检测分离到不带转基因成分但表型不育的植株种植于短日/低温 条件下，结果参见图4,育性恢复可育的植株作为温敏不育株，经繁殖后获得温敏不育系。
[0095] 图4结果表明：tms5-3突变植株在高温下表现为花粉败育，而低温下表现为育性 恢复，说明其为温敏不育株。
[0096] 应用实施例4
[0097] 利用CRISPR/Cas9系统定点突变籼稻品种珍汕97B中RNase Zsl(0s02g0214300) 获得温敏不育系。
[0098] 1)籼稻转基因苗的获得：
[0099] 将实施案列1中构建好的含靶标的pCRISPR/Cas9载体通过农杆菌介导的遗传转 化法转化水稻籼稻品种珍汕97B组织，经筛选，分化和生根成苗，将转基因植株种植于网 室，通过潮霉素鉴定阳性转基因植株；
[0100] 2)突变位点的鉴定：
[0101] 提取阳性植株的 DNA，用引物 tms5-4F(SEQ ID NO. 4) :CGTGTTCACCCTTCCAACCT 和 tms5-4R(SEQ ID NO. 5) :GCTCGTGCTCCTGACCAATC扩增上述DNA，经纯化后测序，分析突变情 况，珍汕97B (ZS97B)序列及测序结果参见，突变植株占总阳性转基因植株的65%，突变类 型为碱基插入或删除，突变位置始于NGG上游第3到4个碱基之间；
[0102] ZS97B(SEQ ID NO. 32) ：CCGTCGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCATCTCCATCGGCGGGCAGGAGAC CTGCGTCATCT
[0103] tms5-l-7(SEQ ID NO. 33) ：CCGTCGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCATCTCCATTCGGCGGGCAGG AGACCTGCGTCATCT
[0104] tms5-l-8(SEQ ID NO. 34) :CCGTCGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCATCTCCA**GGCGGGCAGGA GACCTGCGTCATCT
[0105] tms5-l-9(SEQ ID NO. 35) :CCGTCGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCATCTC****GGCGGGCAGGA GACCTGCGTCATCT
[0106] tms5-l-10(SEQ ID NO. 36):CCGTCGAGGGCTACCCCGTGGAGGGCA*********GCGGGCAGG AGACCTGCGTCATCT ；
[0107] 其中，tms5-l_7, -8，-9，-I表不不同的转基因株系；序列中方碱基"I"表不插入 的喊基，表不喊基缺失；喊基的缺失和插入说明定点突变成功；
[0108] 3)不带转基因成分的温敏不育系的获得：
[0109] 收获Ttl代实现定点突变的植株的种子，在长日/高温条件下种植T1代植株，通过 表型观察和潮霉素阳性检测分离到不带转基因成分但表型不育的植株种植于短日/低温 条件下，结果参见图5,育性恢复可育的植株作为温敏不育株，经繁殖后获得温敏不育系。
[0110] 图5结果表明：珍汕97B背景下的tms5-l突变植株在高温下表现为花粉败育，而 低温下表现为育性恢复，说明其为温敏不育株，同时证明三系改两系的可行性。
[0111] 上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围， 本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所 要求保护的范围。
【权利要求】
1. 一种定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法，其特征在于：其包括 利用 CRISPR/Cas9 系统根据 RNase ZS1 (0s02g0214300 或 L0C_0s02gl2290)设计靶标序 列的步骤；和 构建含靶标序列片段的pU3-gRNA载体的步骤；和 构建含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体的步骤；和 获得转基因苗的步骤；和 突变位点的鉴定步骤；以及 获得不带转基因成分的温敏不育系的步骤。
2. 根据权利要求1所述的定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法，其特征在于，所 述RNase ZS1双链片段中的一条链具有以下结构：5'-Nx-NGG-3'，也可以是5'-Nx-NAG-3'或 5' -Nx-NGA-3'，N表示A，T，C和G中的任意一个，14彡X彡30。
3. 根据权利要求2所述的定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法，其特征在于，突 变后的特征表现为NGG或NAG或NGA上游第3个碱基与第4个碱基之间插入碱基或在其5' 和/或3'丢失喊基。
4. 根据权利要求1所述的定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法，其特征在于，构 建含靶标序列片段的pU3-gRNA载体具体步骤为：首先合成带粘性末端的靶标引物，将接头 引物变性后移至室温冷却完成退火；将退火后的引物链接到经酶切后的pU3-gRNA载体上， 经PCR扩增和测序验证阳性质粒。
5. 根据权利要求1所述的定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法，其特征在于，构 建含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体是将含靶位点序列片段的gRNA表达盒从pU3-gRNA 上切下，然后链接到含Cas9表达盒的pCRISPR/Cas9载体上。
6. 根据权利要求1所述的定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法，其特征在于，获 得转基因苗的步骤是将含靶标的PCRISPR/Cas9载体转化水稻愈伤组织，经筛选，分化和生 根成苗，将转基因植株种植于网室；通过潮霉素鉴定阳性转基因植株。
7. 根据权利要求6所述的定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法，其特征在于，将 含靶标的PCRISPR/Cas9载体转化水稻愈伤组织的方法是通过农杆菌介导的遗传转化或基 因枪法。
8. 根据权利要求1所述的定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法，其特征在于， 突变位点的鉴定步骤具体为：提取阳性植株的DNA，并设计引物扩增上述DNA，经纯化后，测 序，分析突变情况。
9. 根据权利要求1所述的定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法，其特征在于，获 得不带转基因成分的温敏不育系的步骤具体为：收获L代实现定点突变的植株的种子，在 长日/高温条件下种植?\代植株，通过表型观察和潮霉素阳性检测分离到不带转基因成分 但表型不育的植株种植于短日/低温条件下，育性恢复可育的植株作为温敏不育株，经繁 殖后获得温敏不育系。
【文档编号】C12N15/82GK104293827SQ201410496037
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月24日 优先权日:2014年9月24日
【发明者】周海, 庄楚雄, 陈亮, 李静, 姜大刚 申请人:华南农业大学