一种与β-淀粉样前体蛋白裂解酶1特异性结合的核酸适配子及其应用的制作方法

一种与β-淀粉样前体蛋白裂解酶1特异性结合的核酸适配子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种与β-淀粉样前体蛋白裂解酶1特异性结合的核酸适配子及其应用。所述的核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的任意一种。核酸适配子或其化学修饰物作为BACE1抑制剂在制备治疗阿尔茨海默氏病药物中的应用。本研究通过SELEX技术成功筛选得到能以高亲和力结合BACE1的DNA适配子A1和A4，并证明该适配子具有抑制BACE1体外活性的作用。为新的强效特异的BACE1抑制剂的开发提供了研究基础，为AD治疗提供了新的方法和思路。
【专利说明】一种与β-淀粉样前体蛋白裂解酶1特异性结合的核酸适 配子及其应用

【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物医学领域，具体涉及一种与β -淀粉样前体蛋白裂解酶1特异性 结合的核酸适配子及其应用。

【背景技术】：
[0002] 阿尔茨海默氏病（Alzheimer' s disease, AD)是一种渐进性的中枢神经系统 退行性疾病，以认知功能障碍为主要临床表现，其他症状还包括执行功能障碍、精神障 碍等。晚期病人生活不能自理，常死于肺部感染等并发症；给患者家庭及社会带来巨大 的经济负担 [1]。据预测，全世界AD患者的发病人数将由2010年的三千六百万在2050 年增至三倍[2]。AD的发病原因尚不清楚。目前认为多种致病因子，诸如淀粉样前体 蛋白 / 淀粉样蛋白（amyloid precursor protein/amyloidi3，APP/Ai3)[3]、载脂蛋白 E4(ApolipoproteinE4，apoE4)[4'5]、tau[6' 7]、α 突触核蛋白（<1-8}〇111(316；[11)[8'9]、1?敵结合蛋 白（TDP-43) [8'1Q]及组蛋白去乙酰化酶 2(Histone deacetylase 2，HDAC2)[11]等相互作用， 参与AD的发病；其他如老龄[12]、氧化应激 [13]、炎症[14]、线粒体功能损害[15]等也可能与AD 发病有关。对于AD目前尚无有效的根治方法，临床常用的治疗AD的药物乙酰胆碱酯酶抑 制剂和NMDA受体拮抗剂只能暂时缓解症状。
[0003] AD的两大病理标志是神经元胞内的磷酸化tau形成的神经纤维缠结 (neurofibrillary tangles)及胞外的Αβ组成的淀粉样蛋白斑（amyloid plaques)。因此 Αβ -直被认为是AD重要的致病因素。近年来许多研究重新肯定了 Αβ在AD发病中的重要 性[16_22]。在八0产生过程中，β-分泌酶先水解APP生成可溶性APP氨基端产物β (soluble amyloid precursor protein beta, sAPPP)和羧基端产物C99。继而γ -分泌酶在不同位 点剪切C99,产生多种不同氨基酸长度的A β肽。此外在氨基肽酶、谷氨酰胺酰环化酶、异构 酶等介导的酶作用过程及Αβ肽链细胞外磷酸化反应的作用下，产生由各种Αβ肽链组成 的混合物。可以说Αβ是一群有不同长度、溶解度、稳定性、生物学及毒性特性的肽类混合 物的总称。Αβ的生成增多、降解减少或清除减少可导致各种Αβ单体和它们组成的低聚 物、纤维状物在脑内聚集、沉积，引起不同程度的神经毒性。其中可溶性Αβ低聚物的致病 性较Αβ单体和Αβ纤维强 [3，16，19]。Αβ低聚物可能通过影响抑制性中间神经元和谷氨酸 转运体来损害突触功能和相关的信号通路，改变神经元活性，诱发胶质细胞释放神经毒性 介质。因此抑制过多的Αβ产生或其活性是AD治疗的根本策略。
[0004] β -淀粉样前体蛋白裂解酶 I (beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1)，也称β-分泌酶l(P_secretase 1)，是最主要的β-分泌酶，是Αβ产 生过程中的限速酶。因此抑制BACEl的表达或活性将减少A β产生。BACEl包含501个氨 基酸，属跨膜的1型天冬氨酸蛋白酶。其在神经元中的表达水平最高。BACEl与AD的关系 密切。在AD脑内，淀粉样斑块围绕的神经元内BACEl水平升高。2012年，研究者发现APP 基因上临近BACEl蛋白水解位点的一个突变（Α673Τ)在非AD人群与AD病人中的出现频率 有显著的统计学差异，该突变可减少BACEl对APP的剪切，从而减少A β产生；这个发现为 抑制BACEl可对抗AD的论点提供了有力的证据[28]。除了 APP，BACEl可作用于其它底物及 调节因子。BACEl基因完全敲除的小鼠显示了因影响神经调节蛋白I (type III neuregulin 1，NRGl)信号而出现的外周神经系统髓鞘形成不足和精神分裂样行为，以及与电压门控钠 通道 β 亚单位（β-subunits of voltage-gated sodium channels，NavPs)相关的痛痫 样表现[31]。但是目前还不清楚这些改变是否完全由BACEl抑制所引起的。有报道通过一 种BACEl抑制剂治疗可增强APP转基因小鼠的α-分泌酶水解过程，减少脑内Αβ含量而 不影响NRGl通路。α -分泌酶水解APP增强时，能够使其水解产物可溶性APP氨基端产物 a (soluble amyloid precursor protein alpha, sAPPa)产生增加；而 sAPPa 具神经保 护作用。当BACEl完全抑制或敲除时，其他蛋白酶可代偿对BACEl底物的水解过程。NRGl 和Navi3 s信号通路也可能受其它一些未知的酶作用物所影响。近来一些研究提示部分抑 制BACEl已足够减少Αβ含量、改善AD模型动物的认知功能而不产生明显的毒害效应，提 示部分抑制BACEl活性将是一种有效的替代途径。目前，尚没有安全有效的BACEl抑制剂 应用于临床。
[0005] 长期以来，人们认为核酸的主要功能仅仅是携带遗传信息，但随后人们逐渐认识 到单链核酸分子具有执行各种各样的细胞功能的能力。单链RNA分子能够形成迥然不同 的三维结构，使它们可以特异识别各种分子靶标，甚至是执行类似于蛋白分子的催化作用。 例如，tRNA和rRNA分子是蛋白质合成的关键物质。关于转录、剪接及翻译机制的研究分析 显示蛋白质和某些RNA位点的特异相互作用对基因表达的调节非常重要。核酸的巨大的 组合多样化及能够形成多种多样的二级和三级结构的能力使直接筛选出具特定性能的核 酸序列成为可能。由此出现了在体外富集这些核酸分子的方法：指数富集的配基系统进化 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技术[38'39]。而 这些筛选出来的能以高度亲和力（解离常数值在纳摩尔级至皮摩尔级之间）与靶分子特异 结合的寡核苷酸分子（单链DNA或RNA)，被称为适配子 [38]。
[0006] SELEX技术通过数轮或数十轮重复筛选，得到特异结合靶分子的寡核苷酸序列。 每一轮筛选包括三个主要步骤：（1)体外构建的库容量约为IO 13-IO15的随机寡核苷酸文库 与靶分子孵育；（2)寡核苷酸-靶标复合物与未结合的寡核苷酸分离；（3)结合的寡核苷 酸序列经PCR扩增。随着筛选轮数的增加，可逐渐富集到与靶分子的结合亲和力逐步增加 的序列。现在已证实运用SELEX技术可以对非常广泛的靶物质进行筛选得到相应的适配 子；这些靶物质包括蛋白、多肽、核酸、多糖类、小分子有机物、病毒颗粒、细菌、活细胞及组 织 [4°]。SELEX技术也经过许多改进，出现了诸如消减SELEX[41' 42]、利用亲和层析和磁珠的 SELEX[43'44]、毛细管电泳 SELEX[45'46]、全细胞 SELEX[42'47]、微流体 SELEX[48'49]等方法。这些新 方法或能增加筛选效率，或能减低对靶标的要求，或能改进获得的适配子的功能。
[0007] 纯化蛋白质是最常用的SELEX筛选的靶标。以蛋白质为靶标筛选出的适配子，可 用于核酸-蛋白质作用机制的研究 [51];可高效特异地抑制靶蛋白[52]或用于寻找针对其他 蛋白质的新抑制剂[53];用来检测不同的靶分子 [54]。相比于抗体，适配子有如下优势：分子 量小；对热稳定，经历变性/复性后能恢复天然构象及结合靶标[55];易于生产；易于通过各 种化学反应进行修饰以提高其稳定性和对核酸酶的抵抗；易于结合荧光素等信号基团以增 强适配子的功能；免疫原性低；靶物质广泛，对于一些抗体不能识别的物质如离子、小分子 等也具特异亲和力[56]。因此适配子可以在许多生物学应用中代替抗体。目前适配子已广 泛地用于新药研发、疾病诊断及治疗、药物的体内运输、生物成像、试剂分析、食品检测等方 面的研究[57]。作用于中枢神经系统疾病的抗体类药物大多面临药物敏感性不高、体内毒性 及不能有效穿透血脑屏障的问题；由于其独特的特性，适配子有望代替抗体作为药物运输 载体、分子探针或抑制剂等在中枢神经系统疾病的诊治中发挥作用。一些针对朊病毒蛋白 的致病亚型（proteinase K-resistant isoform, PrPSc)的适配子已经被筛选出来，这些适 配子可以用于区别朊病毒的不同亚型，帮助诊断朊病毒病（Prion diseases)[58'59]。胶质瘤 是中枢神经系统最常见的实体瘤，研究者们分别利用不同的胶质瘤细胞株筛选出识别肿瘤 细胞表面肌糖蛋白（tenascin-C) [6°]或表皮生长因子受体III型突变体[61]的适配子，在胶质 瘤的靶向运输、分子成像方面展示了初步的应用。Cerchia等筛选出一组适配子可以从非致 瘤的T98G细胞中识别胶质瘤的致瘤株，其中5个适配子可干扰细胞外信号调节蛋白激酶磷 酸化，抑制恶性型瘤细胞增殖 [62]。此外还有针对AD的Αβ 4(|的适配子、针对帕金森病的酪 氨酸激酶受体Ret的适配子[64]，也有报道。虽然这些研究尚处于初步阶段，但显示了适配 子在中枢神经系统疾病诊治中的潜能。


【发明内容】
：
[0008] 本发明的第一个目的是提供一种与β -淀粉样前体蛋白裂解酶1特异性结合的核 酸适配子或其化学修饰物。
[0009] 本发明的与β -淀粉样前体蛋白裂解酶1特异性结合的核酸适配子或其化学修饰 物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2所示的任意一种。
[0010] 所述的化学修饰物是在上述核酸适配子中包括的至少一个核苷酸的核糖2'位上 的羟基被氢原子、氟原子、-0-酰基和氨基中任意一种所取代，以及在3'端或5'端加入FCM、 FITC、biotin的任意修饰。
[0011] 本发明的第二个目的是提供上述与β -淀粉样前体蛋白裂解酶1特异性结合的核 酸适配子或其化学修饰物作为BACEl抑制剂在制备治疗阿尔茨海默氏病药物中的应用。
[0012] 本研究利用SELEX技术，以纯化的人BACEl蛋白胞外段作为靶分子，从体外合成的 含30个核苷酸（nucleotides, nt)随机片段的ssDNA文库中筛选出以高亲和力特异结合 BACEl的适配子。利用基于生物素-链亲和素系统的间接ELISA法和pull-down实验来测定 适配子对BACEl的结合亲和力及特异性。利用突光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET)实验以检测适配子对BACEl体外活性的抑制作用。将适配子作用 于M17-APPsw细胞（一种AD细胞模型），进行双抗夹心ELISA和western blot实验，检测 适配子对AD细胞模型中BACEl活性的抑制效应。
[0013] 首先，体外构建合成两端为固定序列、中间为30nt的随机序列、全长为73nt的 ssDNA文库（Gp30)。以纯化的人BACEl蛋白胞外段为靶标，在微孔板上进行筛选。每一轮 筛选过程主要包括ssDNA文库与BACEl孵育结合、洗涤分离未结合的寡核苷酸序列、不对称 PCR扩增结合的寡核苷酸序列、切胶回收目的ssDNA得到次级文库、再将次文库与BACEl结 合进行下一轮筛选等重复步骤。从第四轮筛选开始，亚文库先与空白孔孵育进行反筛，以去 除非特异结合的序列。共进行了七轮SELEX筛选。
[0014] 将第七轮得到的ssDNA进行克隆、测序。用Primer 5.0软件分析测序结果，选择 两端的固定序列与原库相同、中间含有30nt随机片段的序列为目的序列，通过MEME在线软 件对所得序列进行同源性分析，用RNA STRUCTURE 5. 5软件测算二级结构。共挑选出四个 重复序列，命名为适配子八142、4344。其中序列41的出现频率最高。序列同源性分析未 发现四个序列均共有的模序。二级结构分析显示四个序列均以茎环结构为主。
[0015] 为验证适配子的靶蛋白及对靶蛋白的亲和力，利用经典的ELISA法及生物素-链 亲和素系统进行间接ELISA。将生物素标记的适配子呈两倍浓度梯度稀释，与BACEl孵育 后再与辣根过氧化物酶标记的链亲和素孵育，TMB显色，测定450nm的吸光度值。将所测得 的吸光度值与适配子的浓度通过Sigmaplot 12. 0软件进行非线性回归分析得出解离常数 (Kd)值。用anti-BACEl抗体与BACEl孵育作为对照比较结合亲和力；用无关适配子（U31) 与BACEl孵育作为对照比较结合特异性。结果显示适配子Al (其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示）及A4(其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示）的结合曲线拟合效果好，类似于BACEl抗 体的拟合曲线（R值均达到〇. 99, P〈0. 01)。而U31的结合曲线则不能拟合（P>0. 05)。适配 子 A1、A4 对 BACEl 的结合亲和力分别为 68. 5655±8· 1237ηΜ、15· 3497±2· 0262nM，与 BACEl 抗体对BACEl的亲和力（2· 7498±0· 2785nM)几乎相近。说明Al及A4能以高亲和力特异 结合BACEl。
[0016] 利用链亲和素磁珠 -pull down实验验证适配子是否能结合AD细胞模型 (M17-APPSW细胞）中的BACE1。选择重复频率最高的生物素标记的Al与链亲和素磁珠孵 育，再与M17-APPsw细胞蛋白提取液孵育。与适配子有相互作用的蛋白被固定在磁珠-适 配子复合物上，经洗涤后复合物通过SDS-PAGE胶分离，在PVDF膜上用BACEl抗体显影。生 物素标记的原文库Gp30、U31及不加适配子组作为对照。结果显示，Al组有明显的70KDa 的BACEl蛋白条带；Gp30组中70KDa处的条带极细；U31及不加适配子组均未在70KDa处显 现条带。说明Al能特异结合M17-APPSW细胞中的BACEl蛋白。
[0017] 下一步进行荧光共振能量转移实验检测Al是否能抑制BACEl的体外活性。BACEl 底物两端分别连接一个荧光供体和猝灭受体，随着供体能量转移至受体，供体发出的荧光 可被受体所猝灭。BACEl裂解底物时，由于不能发生能量转移，来自于供体的荧光不能被猝 灭，荧光信号增加。当加入抑制剂时由于底物裂解被抑制，荧光信号减低。利用这一原理，将 不同浓度的适配子Al加入BACE1及其荧光底物的混合物中，检测荧光强度的变化。BACE1的 一种特异抑制剂、Gp30及U31作为对照。随着浓度增加，标准抑制剂组中荧光值逐渐下降， 至500nM时荧光值较阳性对照显著减低（P〈0. 01)。Al组在250nM的终浓度时荧光值急速 下降（Ρ〈0· 01)。Gp30及U31组荧光值无显著减低。按抑制率（％)= IOO-(IFiZlFc1XlOO) 算出对BACEl活性的抑制率（IF i为加入测试物后的荧光值，IFtl为不加测试物即阳性对照 的荧光值）。将抑制率与测试物浓度的对数值进行线性回归分析，拟合曲线，估算出Al的半 数抑制浓度（IC 5tl)为139. 81nM，小于标准抑制剂的IC5tl (242. 50nM)。说明Al对BACEl体外 活性的抑制作用强。
[0018] 接着将不同浓度（200ηΜ-10μΜ)的Al加入M17-APPsw细胞中培养24h后进行 MTT实验以检测Al对细胞存活率的影响。结果显示Al终浓度在不超过3μ M的范围内 M17-APPsw细胞存活率不受影响。不同浓度（0. 1 μ Μ-3 μ Μ)Α1处理M17-APPsw细胞24h后 收集细胞蛋白提取液，进行双抗夹心ELISA法检测A β 4(|及A β 42含量。在Al终浓度为3 μ M 时，细胞内Αβ4(ι及Αβ42浓度较空白组（未予任何处理组）均有显著下降（Ρ〈0.01)。因此 用3 μ M的Al作用于细胞后，收集细胞蛋白提取液及培养基进行双抗夹心ELISA检测。3 μ M 的Gp30、U31处理组和空白组作为对照。结果显示M17-APPsW的细胞内分泌的A β 4(|及培养 基中分泌的A β 4Q浓度均较对照组显著下降（Ρ〈0. 01)。同样，M17-APPwt的细胞内A β 4Q及 培养基中A β 4(|浓度均较对照组显著下降（P〈0. 01)。与A β 4(|类似，M17-APPSW的细胞A β 42 及细胞培养基中Αβ42浓度均较对照组显著下降（Ρ〈0.01)。为检测Al对AD细胞模型中 sAPPP蛋白表达的影响，对AU Gp30及U31处理后的M17-APPsw细胞裂解物进行western blot实验。孵育的一抗分别为针对APP氨基端的APP抗体及anti-BACEl抗体。结果显 示Al组的sAPPP蛋白表达水平较各对照组显著下降（P〈0. 01、P〈0. 05)，各组间sAPPa及 BACEl的表达量无明显差异。上述结果提示Al能抑制AD细胞模型中BACEl活性。
[0019] 本研究通过SELEX技术成功筛选得到能以高亲和力结合BACEl的DNA适配子Al 和A4,并证明该适配子具有抑制BACEl体外活性的作用。为新的强效特异的BACEl抑制剂 的开发提供了研究基础，为AD治疗提供了新的方法和思路。

【专利附图】

【附图说明】
[0020] 图1.目的ssDNA的获得。A. anti-BACEl抗体鉴定BACEl蛋白的免疫印迹实验。 B.引物3的二级结构。C.引物3的由富含GC碱基的反向重复序列形成的茎环结构，能在扩 增时阻止正链延伸。D.不对称PCR产物电泳图：l，pUC18 DNA/Msp 1 ;2, ssDNA原库Gp30 ; 3,不对称PCR获得的不同长度PCR产物；4,切胶回收后获得的目的ssDNA。
[0021] 图2. RNA STRUCTURES 5. 5软件测算四个适配子序列的二级结构。A、B、C、D分别 为适配子A1、A2、A3、A4的二级结构。
[0022] 图3.适配子AU A4、anti-BACEl和无关对照适配子U31的结合曲线。
[0023] 图4. Al、标准抑制剂、Gp30和U31的FRET实验结果。A.不同浓度标准抑制剂对 荧光强度变化的影响。B.不同浓度适配子对荧光强度变化的影响。C.标准抑制剂的抑制 曲线。D. Al的抑制曲线。*与阳性对照组比较P〈0. 05 Γ与阳性对照组比较P〈0. 01。
[0024] 图5.生物素标记的适配子Al通过链亲和素磁珠与M17-APPSW细胞蛋白裂解物孵 育钓取靶蛋白。1，生物素标记的Al与细胞蛋白提取液孵育；2,生物素标记的原库GP30与 细胞蛋白提取液孵育；3,生物素标记的无关对照适配子U31与细胞蛋白提取液孵育；4,空 白对照（不加适配子）组。
[0025] 图6.不同浓度Al对M17-APPsw细胞存活率的影响。
[0026] 图7.不同浓度Al对M17-APPSW细胞中Αβ4(ι及Αβ42产量的影响。组与blank 组比较P〈〇. 01。
[0027] 图8.Al、Gp30、U31终浓度分别为3μΜ时Αβ4(ι浓度的比较。A.M17-APPSW细胞内 分泌的Αβ 4。浓度在Al组、Gp30组、U31组和blank组中的比较。Β. M17-APPSW细胞培养基 中分泌的A β 4(|浓度在各组中的比较。C. Ml7-APPwt细胞内分泌的A β 4(|浓度在各组中的比 较。D. M17-APPwt细胞培养基中分泌的Αβ 4。浓度在各组中的比较。#Al组与Gp30组、U31 组、blank 组比较 Ρ〈0· 01。##Gp30 组、U31 组与 blank 组比较 Ρ〈0· 01。#Gp30 组与 blank 组 比较 P〈0. 05。
[0028] 图9. AU Gp30、U31终浓度分别为3 μ M时Αβ 42浓度的比较。A.荧光显微镜观察 APPsred转染M17-APPsw细胞后的红色荧光。B. APPsred转染后M17-APPsw细胞内的A β 42 产量上升。C. M17-APPSW细胞内分泌的Αβ 42浓度在Al组、Gp30组、U31组和blank组中的 比较。D. M17-APPsw细胞培养基中分泌的Αβ 42浓度在各组中的比较。#Al组与Gp30组、 U31 组、blank 组比较 Ρ〈0· 01。#Gp30 组与 blank 组比较 Ρ〈0· 05。
[0029] 图10. Al对M17-APPsw细胞内sAPP α、sAPP β及BACEl蛋白表达量的影响。 A. sAPPa、sAPPP及BACEl在Al组、Gp30组、U31组和blank组中的蛋白免疫印迹图。Β、 C、D分别为sAPPii、sAPPa及BACEl的显影条带在各组中的定量分析图。组与Gp30 组、blank组比较Ρ〈0·01。 #A1组与U31组比较Ρ〈0·05。

【具体实施方式】：
[0030] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0031] 实施例1 :用微孔板法筛选针对结合BACEl胞外区并具有抑制活性的适配子
[0032] 实验一、文库的构建及引物的合成
[0033] 长度为73nt的随机ssDNA文库由Invitrogen公司合成，其两端为固定序列， 中间为30nt的随机序列，库容量约为101445。序列为：5' -GCAATGGTACGGTACTTCC(30N) CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'。
[0034] 根据文库两端固定序列分别设计相对应的引物序列为：
[0035] 引物 1 :5, -GCAATGGTACGGTACTTCC-3，
[0036] 引物 2 :5，-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3 '
[0037] 引物 3 :5, -GCTAAGCGGGTGGGACTTCCTAGTCCCACCCGCTTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTT GJ
[0038] 其中用于双链扩增PCR的是引物1和引物2 ;引物3的5'端还含有33个富含GC 碱基的反向重复序列（下划线碱基），用于与引物1进行PCR产生不同长度的单链DNA (不 对称PCR)，以便形成亚文库。引物1和引物2的5'端可通过标记生物素（biotin)用于观 察和测定适配子与BACEl蛋白的结合亲和力和特异性。
[0039] 实验二、微孔板法筛选针对BACEl胞外区蛋白的适配子
[0040] 1针对BACEl胞外区蛋白的适配子的SELEX筛选：
[0041] 主要包括孵育结合、分离、扩增、分离ssDNA、得到次级文库、再结合等重复步骤， SELEX整个筛选过程如下：BACEl胞外区蛋白购自sigma公司。
[0042] 筛选前一天，将BACEl胞外区蛋白溶于PBS后，包被于96孔板中，4°C过夜。筛选 前弃去包被上清，加入封闭液（3 % BSA)于37°C封闭2h后用200 μ L洗涤缓冲液洗孔。预 先将一定浓度的上述随机ssDNA文库于95°C加热5min，冰上冷却lOmin，加入200 μ L结 合缓冲液中混匀，室温放置30min，得到热变性处理过的DNA。洗孔后加入热变性处理过的 DNA，37°C孵育2h。孵育后用洗涤缓冲液洗孔以洗去未结合的DNA。未洗脱的DNA-蛋白复 合物中加入200 μ L PBS，于95°C加热器加热5min，冰上冷却5min后取适量上清为模板，用 引物2和引物3进行不对称PCR扩增，将所得单链产物切胶回收放入I. 5mL EP管中，加入 400 μ L/管的凝胶洗脱液，37°C振摇6h后，在上清中将洗脱液转移至新EP管中，加入1/10 体积的3mol/L NaAc(pH5. 2)，1/100体积的lmol/L MgCl2和2倍体积的无水乙醇，-20°C沉 淀过夜。4°C离心14, 000 rpm收集沉淀的ssDNA，然后用70%的预冷乙醇洗涤一次，待沉 淀干燥后用适量dd H2O溶解，用紫外分光光度计对ssDNA进行定量。此时得到的ssDNA作 为次文库用于下一轮筛选。为增加筛选压力，提高筛选的DNA适配子的特异性与亲和力，在 筛选过程中随着筛选轮数增加，逐渐减少文库及靶蛋白的投入量，减少孵育时间，增加鲑精 DNA投入量，增加洗涤时间，并从第四轮开始设立反筛过程（筛选前一晚用200yL PBS单独 包被一空白对照孔，3 % BSA封闭，孵育时先将DNA与空白对照孔于37°C结合40min，反筛去 除非特异结合的ssDNA，然后转移到BACEl包被孔与BACEl于37°C结合40min)。
[0043] 2筛选的次级文库制备：
[0044] 通过引物1和引物3进行不对称PCR扩增得到不同长度的ssDNA产物，并用尿素 胶分离。尿素胶分离过程：将玻璃板洗净晾干，把玻璃板固定在灌胶支架上，称取尿素，按配 方加入水后，在水浴锅中将尿素融化后在加入其它组分，将加好凝胶混匀后迅速倒入两玻 璃板间隙，并迅速斜插入梳子，防止产生气泡。待胶聚合好后，取下胶板，安装在电泳槽中， 在内外槽添加电泳缓冲液（I X TBE)。由于胶中含有尿素，尿素液会积聚在上样孔中，影响上 样，故上样前需先用ImL注射器针头冲洗加样孔，将尿素液吸掉。不对称PCR产物或ssDNA 样品加变性凝胶加样缓冲液混合，上样。连接电极（正极接下槽），在100V-200V恒压下进 行电泳。待条带电泳至凝胶的下部时中断电源，卸下玻璃板，将凝胶放置于溴化乙锭染色液 (0. 5 μ g/mL溴化乙锭，I XTBE)中染色lOmin。在凝胶成像仪上成像，观察检测条带并确定 目的条带的位置。
[0045] 3.切胶回收ssDNA次文库
[0046] 将溴化乙锭染色后的胶片放在铺好保鲜膜的长波紫外灯上，打开紫外灯，在防护 罩防护下观察DNA电泳条带，迅速用锐利刀片切取目的条带。将胶条切碎，放入I. 5mL EP 管中，加入400 μ L凝胶洗脱缓冲液，于37°C摇床上洗脱6h。将洗脱液吸到新的I. 5mL离心 管中，加入2. 5倍体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/L NaAc (ρΗ5· 2)，1/100体积的lmol/L MgC12,于-20°C冰箱放置过夜后取出，4°C、14, OOOrpm离心30min，弃上清，沉淀用4°C预冷 的70%乙醇冲洗后再离心弃上清，沉淀于室温干燥20min，将干燥好的DNA溶于50 μ L三蒸 水中，震荡混匀用紫外分光光度计测定DNA量，-20°C保存备用。选择适量DNA作为下轮筛 选用的次文库。
[0047] 上述实验结果显示见图1。纯化的人BACEl胞外片段作为SELEX筛选的靶蛋白。 蛋白免疫印迹实验检测到该蛋白于70KDa处呈现为一清晰的单一条带，与BACEl的分子量 一致（图1A)。靶蛋白与DNA原库孵育后，结合的BACE1-DNA复合物通过加热分离，用引物 1和引物3进行不对称PCR扩增，获得目的ssDNA单链。弓丨物3的5'端引入富含GC碱基 的反向重复序列，能够形成茎环二级结构，具有较高的Tm值，在Taq酶能较好发挥作用的温 度范围之内（55°C -65°C )仍可保持稳定的二级结构，从而阻止正链的延伸（图1B-C)。因 此，得到的PCR产物为两条长度不同的ssDNA单链，在尿素变性PAGE凝胶上分离，显示迁移 速率不同的两条带，短链位置与单链模板相当，长链位置相当于引物3延伸产物，比短链长 37个碱基（图1D)。对短链进行切胶回收后可获得73bp的目的ssDNA单链（图1D)，作为 次级亚文库用于下一轮筛选。
[0048] 4.克隆测序：
[0049] T载体克隆反应体系如下：
[0050]

【权利要求】
1. 一种与β-淀粉样前体蛋白裂解酶1特异性结合的核酸适配子或其化学修饰物，其 特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2所示的任意一种。
2. 根据权利要求1所述的核酸适配子的化学修饰物，其特征在于，所述的化学修饰 物是在上述核酸适配子中包括的至少一个核苷酸的核糖2'位上的羟基被氢原子、氟原 子、-0-酰基和氨基中任意一种所取代，以及在3'端或5'端加入FCM、FITC、biotin的任意 修饰。
3. 权利要求1所述的与β_淀粉样前体蛋白裂解酶1特异性结合的核酸适配子或其化 学修饰物作为BACE1抑制剂在制备治疗阿尔茨海默氏病药物中的应用。
【文档编号】C12N15/115GK104293794SQ201410495810
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月24日 优先权日:2014年9月24日
【发明者】石玉生, 张兴梅, 梁惠玉, 陈文君, 彭勇华 申请人:南方医科大学