本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用南瓜膳食纤维制备抗氧化性膳食纤维的方法。
背景技术：
南瓜是我国普遍种植的瓜菜，资源丰富。南瓜含有果糖、果胶、甘露醇、多种维生素和氨基酸等营养成分，以及南瓜多糖、膳食纤维、β- 胡萝卜素、南瓜籽碱和葫芦巴碱等多种生理活性物质，其多糖和果胶类水溶性膳食纤维含量较高，是极好的水溶性膳食纤维资源，但目前尚未加以利用。
膳食纤维作为一种重要的食品组成成分，被称为“第七大营养素”，具有顺肠通便、调节控制血糖浓度、降血脂等多种生理功能。
按溶解性，膳食纤维可以分为水溶性膳食纤维(SDF) 和水不溶性膳食纤维(IDF)。其中SDF在预防糖尿病、心血管疾病、降低胆固醇等方面具有比IDF 更强的生理活性。
SDF 是由半乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等聚合而成的高分子碳水化合物。单糖分子上含有大量的羟基，这些羟基能够发生酯化反应、醚化反应、羧甲基化及乙酰化反应。研究表明硫酸酯化是一种有效的化学修饰，多糖大分子单糖分子上的羟基被硫酸根所取代，具有抗凝血、抗肿瘤、抗病毒等生理活性，近年来一些硫酸酯化的香菇多糖、灵芝多糖、茯苓多糖等已应用于临床。
水溶性膳食纤维经硫酸酯化后具有较强的抗氧化性。常用硫酸酯化的方法有：浓硫酸法、氯磺酸- 吡啶法、三氧化硫- 吡啶法、氯磺酸- 甲酰胺法。浓硫酸酯化需要在低温条件下反应，否则由于浓硫酸的碳化作用使产物颜色较深，操作条件苛刻；三氧化硫- 吡啶法成本高，仅适用于实验室水平；而氯磺酸- 吡啶法是目前采用较多的方法。氯磺酸- 吡啶法采用的氯磺酸是一种强氧化剂，遇水会发生剧烈分解，酯化试剂需要在-4℃严格无水条件下制备，制备条件苛刻，酯化剂稳定性差，易结块，获得酯化产物颜色深，无机盐含量高。
针对上述酯化方法存在的缺陷，硫酸酯化方法不断地改进。陕西科技大学杨阳等( 南瓜挤压改性水溶性膳食纤维硫酸酯化修饰，食品与发酵工业，2014，40，61-64) 采用氨基磺酸- 吡啶法硫酸酯化南瓜膳食纤维，获得硫酸酯化南瓜水溶性膳食纤维取代度为1.29，但是吡啶毒性大，易挥发，并且气味刺鼻，反应产物在该体系中呈褐色粘稠状，不易搅拌。
目前，对于氨基磺酸-DMF法硫酸酯化制备抗氧化性南瓜膳食纤维尚未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种抗氧化性膳食纤维的制备方法。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
1) 将南瓜膳食纤维与南瓜膳食纤维重量20～40％的蒸馏水搅拌混合均匀后静置30～120min，静置后进行挤压改性，然后依次经烘干、粉粹以及过筛得南瓜膳食纤维挤压改性物( 即挤压改性南瓜膳食纤维) ；
2) 向南瓜膳食纤维挤压改性物中加入蒸馏水后于50～70℃浸提1～2h，南瓜膳食纤维挤压改性物与蒸馏水的质量比为1:20～1:40，浸提结束后抽滤并收集滤液，将滤液真空浓缩后加入1～4 倍体积的95％乙醇并静置过夜( 水提醇沉法)，然后离心并收集沉淀，将沉淀烘干得南瓜水溶性膳食纤维；
3) 将南瓜水溶性膳食纤维悬浮于N,N- 二甲基甲酰胺(DMF) 中得混合物A，在条件下向混合物A 中加入氨基磺酸，然后在超声频率为20～40kHz、温度为50～80℃的条件下反应1～3h，反应结束后冷却至室温，然后用2～4mol/L NaOH 水溶液调节pH 值为中性，然后加入1～4 倍体积的95％乙醇并静置过夜，然后离心并收集沉淀，将沉淀溶于蒸馏水并装入透析袋中，然后用蒸馏水透析2～4 天，然后向透析液( 指透析袋内的液体) 中加入1～4 倍体积的95％乙醇并静置过夜，然后离心并收集沉淀，将沉淀烘干得硫酸酯化南瓜水溶性膳食纤维( 命名为SSDF)。
所述挤压改性是在螺杆挤压机螺杆转速为700～900r/min 条件下挤压膨化。
所述真空浓缩的条件为：温度为45～60℃，真空度为0.06～0.09MPa，浓缩至滤液体积的1/4～1/6。
所述混合物A 中每1g 南瓜水溶性膳食纤维悬浮于60～90mL N,N- 二甲基甲酰胺中。
所述南瓜水溶性膳食纤维与氨基磺酸的质量比为1:1～1:4。
所述南瓜膳食纤维的制备方法包括以下步骤：将南瓜浆与蒸馏水搅拌混合均匀后用2～4mol/L NaOH 水溶液调节pH 为10～14，南瓜浆与蒸馏水的质量比为1:3～1:5，然后于50～80℃保温10min 得混合物B，向混合物B 中加入蒸馏水体积1～3％的双氧水，然后于50～80℃搅拌反应1～3h，搅拌反应结束后用流水洗涤至中性，洗涤后依次烘干、粉碎以及过筛，得南瓜膳食纤维。
所述烘干的温度均为35～60℃ ；所述过筛均采用20～80 目筛。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
(1) 本发明选用氨基磺酸为酯化剂，DMF 为反应溶剂，将超声波用于辅助南瓜SDF硫酸酯化，可以制备获得具有良好生理活性的南瓜膳食纤维。
(2) 本发明以氨基磺酸为酯化剂，DMF 为反应介质，反应条件温和、毒性低，且DMF介质易干燥，性质温和，不易挥发，南瓜SDF 在其中容易分散，产物颜色浅，在分离纯化方面简单易行。
(3) 本发明将超声波用于辅助南瓜SDF 硫酸酯化，缩短了酯化时间，降低了酯化温度，减少南瓜SDF 在强酸环境下的降解，增加酯化反应速率，制得的硫酸酯化南瓜水溶性膳食纤维颜色浅，得率高。
(4) 本发明首次研究硫酸酯化南瓜水溶性膳食纤维的抗肿瘤活性，经试验证实，本发明制备的硫酸酯化南瓜水溶性膳食纤维对乳腺癌细胞增殖有明显的抑制作用。
(5) 本发明通过对南瓜浆进行处理，不仅起到脱色作用，还提高了处理产物中南瓜膳食纤维的含量，通过进一步对南瓜膳食纤维进行挤压改性处理，不仅显著提高SDF 构成比例，同时提高SDF 持水力、膨胀力等。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
南瓜膳食纤维的制备：称取一定质量南瓜浆，按照料液比为1:4(g:mL) 的比例加入蒸馏水，搅拌均匀，用2mol/L 氢氧化钠水溶液调节pH 为13，于70℃保温10min，然后加入蒸馏水体积2％的双氧水，70℃搅拌反应2h，待反应结束后过100 目筛，筛上物用流水洗涤至中性，将其置于65℃真空烘箱中烘干、粉碎并过40目筛，即得南瓜膳食纤维。
实施例1
1) 称取一定质量20目南瓜膳食纤维，加入南瓜膳食纤维质量20％的蒸馏水，搅拌均匀，静置30min，随后在螺杆转速为700r/min 条件下挤压膨化，挤压处理后将挤出物置于45℃烘箱中烘干，粉碎并过40目筛，获得挤压改性南瓜膳食纤维；
2) 称取一定质量40目挤压改性南瓜膳食纤维，按1:20 的料液比(g:mL) 加入蒸馏水，于60℃浸提1h，抽滤并收集滤液，滤液在温度为60℃，真空度为0.07MPa 下真空浓缩至1/5 体积，加入4 倍体积95％乙醇醇沉，静置过夜，离心并收集沉淀，将沉淀置于45℃烘箱中烘干，即得南瓜SDF ；
3) 准确称取1.0g 南瓜SDF，将其悬浮于60mL DMF 中，在搅拌条件下加入2.0g 氨基磺酸，随后于超声频率为20kHz、温度为50℃下反应3h，反应结束后冷却至室温，随后用2.5mol/L 氢氧化钠水溶液调节pH 值为中性，加入4 倍体积95％乙醇醇沉，静置过夜，然后离心并收集沉淀，将沉淀溶于蒸馏水并装入透析袋中，蒸馏水透析3 天，透析液加入4 倍体积95％乙醇醇沉，静置过夜，离心并收集沉淀，将沉淀置于45℃烘箱中烘干，即得到0.763g的SSDF。
实施例2
1) 称取一定质量40目南瓜膳食纤维，加入南瓜膳食纤维质量30％的蒸馏水，搅拌均匀，静置60min，随后在螺杆转速为800r/min 条件下挤压膨化，挤压处理后将挤出物置于50℃烘箱中烘干，粉碎并过60 目筛，获得挤压改性南瓜膳食纤维；
2) 称取一定质量60 目挤压改性南瓜膳食纤维，按1:25 的料液比(g:mL) 加入蒸馏水，于70℃浸提1.5h，抽滤并收集滤液，滤液在温度为50℃，真空度为0.06MPa 下真空浓缩至1/5 体积，加入4 倍体积95％乙醇醇沉，静置过夜，离心并收集沉淀，将沉淀置于50℃烘箱中烘干，即得南瓜SDF ；
3) 准确称取1.0g 南瓜SDF，将其悬浮于70mL DMF 中，在搅拌条件下加入3.0g 氨基磺酸，随后于超声频率为30kHz、温度为60℃下反应2h，反应结束后冷却至室温，随后用2.5mol/L 氢氧化钠水溶液调节pH 值为中性，加入4 倍体积95％乙醇醇沉，静置过夜，然后离心并收集沉淀，将沉淀溶于蒸馏水并装入透析袋中，蒸馏水透析3 天，透析液加入4倍体积95％乙醇醇沉，静置过夜，离心并收集沉淀，将沉淀置于50℃烘箱中烘干，即得到0.612gSSDF。
实施例3
1) 称取一定质量40目南瓜膳食纤维，加入南瓜膳食纤维质量40％的蒸馏水，搅拌均匀，静置90min，随后在螺杆转速为900r/min 条件下挤压膨化，挤压处理后将挤出物置于65℃真空烘箱中烘干，粉碎并过80 目筛，获得挤压改性南瓜膳食纤维；
2) 称取一定质量80 目挤压改性南瓜膳食纤维，按1:30 的料液比(g:mL) 加入蒸馏水，于60℃浸提2h，抽滤并收集滤液，滤液在温度为55℃，真空度为0.08MPa 下真空浓缩至1/6 体积，加入4 倍体积95％乙醇醇沉，静置过夜，离心并收集沉淀，将沉淀置于65℃真空烘箱中烘干，即得南瓜SDF ；
3) 准确称取1.0g 南瓜SDF，将其悬浮于80mL DMF 中，在搅拌条件下加入3.0g 氨基磺酸，随后于超声频率为35kHz、温度为70℃下反应2h，反应结束后冷却至室温，随后用2.5mol/L 氢氧化钠水溶液调节pH 值为中性，加入4 倍体积95％乙醇醇沉，静置过夜，然后离心并收集沉淀，将沉淀溶于蒸馏水并装入透析袋中，蒸馏水透析3 天，透析液加入4 倍体积95％乙醇醇沉，静置过夜，离心并收集沉淀将沉淀置于65℃真空烘箱中烘干，即得到0.609g的SSDF。
实施例4
1) 称取一定质量40目南瓜膳食纤维，加入南瓜膳食纤维质量20％的蒸馏水，搅拌均匀，静置120min，随后在螺杆转速为800r/min 条件下挤压膨化，挤压处理后将挤出物置于60℃烘箱中烘干，粉碎并过40 目筛，获得挤压改性南瓜膳食纤维；
2) 称取一定质量40 目挤压改性南瓜膳食纤维，按1:40 的料液比(g:mL) 加入蒸馏水，于70℃浸提1.5h，抽滤并收集滤液，滤液在温度为45℃，真空度为0.09MPa 下真空浓缩至1/5 体积，加入4 倍体积95％乙醇醇沉，静置过夜，离心并收集沉淀，将沉淀置于60℃烘箱中烘干，即得南瓜SDF ；
3) 准确称取1.0g 南瓜SDF，将其悬浮于90mL DMF 中，在搅拌条件下加入4.0g 氨基磺酸，随后于超声频率为30kHz、温度为80℃下反应1h，反应结束后冷却至室温，随后用2.5mol/L 氢氧化钠水溶液调节pH 值为中性，加入4 倍体积95％乙醇醇沉，静置过夜，然后离心并收集沉淀，将沉淀溶于蒸馏水并装入透析袋中，蒸馏水透析3 天，透析液加入4 倍体积95％乙醇醇沉，静置过夜，离心并收集沉淀，将沉淀置于60℃烘箱中烘干，即得到0.543g的SSDF。
本发明首先在碱性环境下制备南瓜膳食纤维；其次对南瓜膳食纤维进行挤压改性处理，经挤压改性处理后水溶性膳食纤维含量从原料中的4.7％增加到27.3％；随后采用水提醇沉法提取水溶性膳食纤维；然后采用氨基磺酸-N,N- 二甲基甲酰胺法对南瓜水溶性膳食纤维进行硫酸酯化修饰，获得硫酸酯化南瓜SDF 取代度为0.23～0.97，酯化反应条件温和，产物颜色浅，产率高。
本发明对制得的抗氧化性南瓜SDF（硫酸酯化南瓜SDF，简称SSDF） 分别进行自由基清除能力的测定及对人乳腺癌细胞MM231 的增殖抑制作用研究。自由基清除能力测定结果表明，与未酯化南瓜SDF 相比，硫酸酯化南瓜SDF 对羟自由基、超氧阴离子自由基及氧自由基清除能力显著增强，当浓度为5mg/mL，对自由基清除能力分别提高22.04％、51.86％、38.98％。对乳腺癌细胞MM231的增值抑制作用研究结果表明，硫酸酯化南瓜SDF 对乳腺癌细胞MM231 的增值具有明显抑制作用，利用Graphpad 软件计算IC50 得到南瓜SDF、SSDF 对MM231 细胞48h 的IC50 分别为265.4mg/L，16.58mg/L。由此说明，本发明制得的抗氧化性南瓜膳食纤维具有良好的生物活性。