本发明涉及乳酸链球菌素相关领域。
背景技术：
乳酸链球菌素(英文名称Nisin)亦称乳酸链球菌肽，是乳酸链球菌产生的一种多肽物质，由34个氨基酸残基组成，分子量约为3500Da。由于Nisin可抑制大多数革兰氏阳性细菌，如肉毒梭菌、金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、利斯特氏菌，并对芽孢杆菌的芽孢有强烈的抑制作用，因此被作为食品防腐剂广泛应用于食品行业。通常，产芽孢的细菌耐热性很强，如鲜乳采用135℃、2秒超高温瞬时灭菌，非芽孢细菌的死亡率为100％，芽孢细菌的死亡率90％，还有10％的芽孢细菌不能杀灭。若鲜乳中添加0.03～0.05g/kg Nisin就可抑制芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌孢子的发芽和繁殖。根据研究结果表明，乳酸链球菌素的抗菌作用是通过干扰细胞v膜的正常功能，造成细胞膜的渗透，养分流失和膜电位下降，从而导致致病菌和腐败菌细胞的死亡。
研究表明，乳酸链球菌素与EDTA2Na联合使用对沙门氏菌、大肠杆菌和其它革兰氏阴性菌亦具有抑制作用。申请号为200710178631.2的专利中介绍了一种由纳他霉素和乳酸链球菌素组成的复合生物防腐剂组方，该组方中还含有维生素C、乙二胺四乙酸钠(EDTA2Na)、麦芽糊精、三聚磷酸钠和六偏磷酸钠。该复合防腐剂对真菌和革兰氏阳性菌具有良好的抑菌作用。专利号为CN 103355730 B的发明专利公开了一种含有乳酸链球菌素的复合防腐剂的制备方法，该专利中复合防腐剂的配方为：壳聚糖2～6‰，竹叶抗氧化物1～2‰，六偏磷酸钠1～5％、纳他霉素0.5～1％、大蒜素1～2‰、抗坏血酸钠0.05～0.1％、麦芽糊精1～3％和NaCl 0.5～2％。但该专利所提供的方法在实际应用中具有以下缺点。首先，产品溶解度不好。壳聚糖和纳他霉素在pH＝6.5的前提下，溶解度很差，按照专利中提到的添加量可能不能完全溶解。其次，产品稳定性较低。大蒜素是一种油状的产品，可溶于乙醇、乙醚等，但在水中虽然大蒜素的水中溶解度为2.5％(10℃)，但静置后会有油状物沉淀物形成。大蒜素对热和碱不稳定，这会大大降低产品的有效性。
目前乳酸链球菌素具有非常广阔的市场和应用前景，目前全球产能在1000吨左右。但是由于乳酸链球菌素只能抑制大部分的革兰氏阳性菌，而不能抑制革兰氏阴性菌和真菌，这一点是乳酸链球菌素天然的缺陷，也限制了乳酸链球菌素的抑菌范围。有研究表明，乳酸链球菌素与乙二胺四乙酸钠(EDTA2Na)配合使用可以有效地抑制数量级为104～106的沙门氏菌、大肠杆菌等革兰氏阴性菌。但是这种组方仅见于研究报告中，而并未证明在实际生产应用中有效。而且乳酸链球菌素与乙二胺四乙酸钠在理论上对革兰氏阴性菌的抑菌能力也十分有限。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决目前单独使用乳酸链球菌素仅能对革兰氏阳性菌起到抑制作用的问题，本发明通过复配其他成分使复配组方对革兰氏阴性细菌及真菌也具有良好的抑制作用。
本发明的一种扩大乳酸链球菌素杀菌范围和提高杀菌能力的配方，它由浓度为0.1～1.0g/L的乳酸链球菌素溶液、浓度为5.0～50.0g/L的谷氨酸二乙酸四钠溶液、浓度为0.5～5.0g/L的葡萄糖酸溶液、浓度为5.0～50.0g/L的葡萄糖酸盐溶液、浓度为0.1～5.0g/L的肉桂酸钾溶液和浓度为1.0～10.0g/L的柠檬酸溶液制成的溶液；该溶液的pH＝2.5～7.5。
本发明包含以下有益效果：
1、乳酸链球菌素与螯合剂谷氨酸二乙酸四钠(GLDA)、葡萄糖酸和葡萄糖酸盐(优选葡萄糖酸锌)可以对革兰氏阴性菌产生较好的抑制作用，且抑制效果好于乳酸链球菌素与EDTA2Na单独复配。
2、乳酸链球菌素、GLDA、葡萄糖酸和葡萄糖酸盐，通过继续与肉桂酸钾进行复配不仅能够进一步增强对革兰氏阴性细菌的抑制能力，同时对真菌也具有良好的抑制能力。
本发明具有安全、经济、实用的特点，适用于食品、餐饮、日化、养殖等行业的抑菌、杀菌操作流程。谷氨酸二乙酸四钠(GLDA)由谷氨酸制成，而谷氨酸由植物原料发酵后制成，因此具有天然环保、降解性好、安全性高等优点，在欧盟可以被用于食品饮料加工中。GLDA是最近几年才被研发出来的新型螯合剂，其螯合效果优于常用的EDTA和柠檬酸钠，与一些抗菌成分复合使用时能够起到协同增效的作用。葡萄糖酸及葡萄糖酸盐是常用的食品添加剂或营养补充剂，被广泛应用于食品、医药及日化等领域。肉桂酸和肉桂酸钾是新型的食品添加剂，具有良好的抑菌作用。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种扩大乳酸链球菌素杀菌范围和提高杀菌能力的配方，它由浓度为0.1～1.0g/L的乳酸链球菌素溶液、浓度为5.0～50.0g/L的谷氨酸二乙酸四钠溶液、浓度为0.5～5.0g/L的葡萄糖酸溶液、浓度为5.0～50.0g/L的葡萄糖酸盐溶液、浓度为0.1～5.0g/L的肉桂酸钾溶液和浓度为1.0～10.0g/L的柠檬酸溶液制成的溶液；该溶液的pH＝2.5～7.5。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：它由浓度为0.5～1.0g/L的乳酸链球菌素溶液、浓度为10.0～40.0g/L的谷氨酸二乙酸四钠溶液、浓度为1.0～5.0g/L的葡萄糖酸溶液、浓度为10.0～40.0g/L的葡萄糖酸盐溶液、浓度为1.0～5.0g/L的肉桂酸钾溶液和浓度为2.0～8.0g/L的柠檬酸溶液制成的溶液；该溶液的pH＝2.5～7.5。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：它由浓度为0.5～0.8g/L的乳酸链球菌素溶液、浓度为20.0～40.0g/L的谷氨酸二乙酸四钠溶液、浓度为2.0～5.0g/L的葡萄糖酸溶液、浓度为20.0～40.0g/L的葡萄糖酸盐溶液、浓度为2.0～5.0g/L的肉桂酸钾溶液和浓度为2.0～6.0g/L的柠檬酸溶液制成的溶液；该溶液的pH＝2.5～7.5。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：它由浓度为0.6～0.8g/L的乳酸链球菌素溶液、浓度为30.0～40.0g/L的谷氨酸二乙酸四钠溶液、浓度为3.0～5.0g/L的葡萄糖酸溶液、浓度为30.0～40.0g/L的葡萄糖酸盐溶液、浓度为3.0～5.0g/L的肉桂酸钾溶液和浓度为3.0～6.0g/L的柠檬酸溶液制成的溶液；该溶液的pH＝2.5～7.5。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：它由浓度为0.1～0.8g/L的乳酸链球菌素溶液、浓度为5.0～40.0g/L的谷氨酸二乙酸四钠溶液、浓度为1.0～5.0g/L的葡萄糖酸溶液、浓度为5.0～40.0g/L的葡萄糖酸盐溶液、浓度为1.0～5.0g/L的肉桂酸钾溶液和浓度为1.0～5.0g/L的柠檬酸溶液制成的溶液；该溶液的pH＝2.5～7.5。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：它由浓度为0.1～0.5g/L的乳酸链球菌素溶液、浓度为5.0～30.0g/L的谷氨酸二乙酸四钠溶液、浓度为1.0～4.0g/L的葡萄糖酸溶液、浓度为5.0～30.0g/L的葡萄糖酸盐溶液、浓度为1.0～3.0g/L的肉桂酸钾溶液和浓度为2.0～8.0g/L的柠檬酸溶液制成的溶液；该溶液的pH＝2.5～7.5。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是：它由浓度为0.2～0.6g/L的乳酸链球菌素溶液、浓度为5.0～20.0g/L的谷氨酸二乙酸四钠溶液、浓度为2.0～3.0g/L的葡萄糖酸溶液、浓度为5.0～20.0g/L的葡萄糖酸盐溶液、浓度为2.0～4.0g/L的肉桂酸钾溶液和浓度为4.0～8.0g/L的柠檬酸溶液制成的溶液；该溶液的pH＝2.5～7.5。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是：它由浓度为0.2～0.4g/L的乳酸链球菌素溶液、浓度为10.0～20.0g/L的谷氨酸二乙酸四钠溶液、浓度为2.0～5.0g/L的葡萄糖酸溶液、浓度为10.0～20.0g/L的葡萄糖酸盐溶液、浓度为1.0～6.0g/L的肉桂酸钾溶液和浓度为2.0～8.0g/L的柠檬酸溶液制成的溶液；该溶液的pH＝2.5～7.5。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一不同的是：它由浓度为0.5g/L的乳酸链球菌素溶液、浓度为20.0g/L的谷氨酸二乙酸四钠溶液、浓度为1.0g/L的葡萄糖酸溶液、浓度为10.0g/L的葡萄糖酸盐溶液、浓度为2.0g/L的肉桂酸钾溶液和浓度为4.0g/L的柠檬酸溶液制成的溶液；该溶液的pH＝2.5～7.5。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一不同的是：它由浓度为0.5g/L的乳酸链球菌素溶液、浓度为20.0g/L的谷氨酸二乙酸四钠溶液、浓度为2.0g/L的葡萄糖酸溶液、浓度为20.0g/L的葡萄糖酸盐溶液、浓度为3.0g/L的肉桂酸钾溶液和浓度为4.0g/L的柠檬酸溶液制成的溶液；该溶液的pH＝2.5～7.5。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一不同的是：它由浓度为0.1g/L的乳酸链球菌素溶液、浓度为50.0g/L的谷氨酸二乙酸四钠溶液、浓度为0.5g/L的葡萄糖酸溶液、浓度为50.0g/L的葡萄糖酸盐溶液、浓度为0.1g/L的肉桂酸钾溶液和浓度为1.0g/L的柠檬酸溶液制成的溶液；该溶液的pH＝2.5～7.5。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：它由浓度为1.0g/L的乳酸链球菌素溶液、浓度为5.0g/L的谷氨酸二乙酸四钠溶液、浓度为5.0g/L的葡萄糖酸溶液、浓度为5.0g/L的葡萄糖酸盐溶液、浓度为0.1g/L的肉桂酸钾溶液和浓度为1.0g/L的柠檬酸溶液制成的溶液；该溶液的pH＝2.5～7.5。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：它由浓度为0.5g/L的乳酸链球菌素溶液、浓度为20.0g/L的谷氨酸二乙酸四钠溶液、浓度为2.0g/L的葡萄糖酸溶液、浓度为20.0g/L的葡萄糖酸盐溶液、浓度为1.0g/L的肉桂酸钾溶液和浓度为3.0g/L的柠檬酸溶液制成的溶液；该溶液的pH＝2.5～7.5。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的葡萄糖酸盐为葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸镁、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌、葡萄糖酸铜、葡萄糖酸铁或葡萄糖酸铋。其它与具体实施方式一相同。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
实验试剂：乳酸链球菌素(Nisin，效价≥1000IU/mL)，由安泰生物工程股份有限公司提供；谷氨酸二乙酸四钠(GLDA4Na，含量≥47％)，由阿克苏诺贝尔公司提供；葡萄糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸锌、肉桂酸钾、柠檬酸等试剂均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司提供。
测试菌株：金黄色葡萄球菌ATCC6538、大肠杆菌ATCC8099、铜绿假单胞菌ATCC15442和白假丝酵母ATCC10231均购自美国模式菌种保藏中心(英文简称ATCC)；沙门氏菌CMCC50335购自中国医学细菌保藏管理中心(英文简称CMCC)；柠檬酸杆菌CICC20211购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(英文简称CICC)。
菌株培养方法：金黄色葡萄球菌ATCC6538、大肠杆菌ATCC8099、沙门氏菌CMCC50335、柠檬酸杆菌CICC20211和铜绿假单胞菌ATCC15442均用LB液体培养基进行培养；白假丝酵母ATCC10231用YEPD培养基进行培养。具体培养方式为，从-80℃低温冰箱中取出含有1mL菌种保藏液的冻存管一支，转接入含有100mL的LB液体培养基的250mL三角瓶中，37℃下以150rpm的转速振荡培养24h后取出。24h内测定培养好的各菌株菌悬液的菌浓度，测试前根据菌浓度用无菌生理盐水将菌悬液调整为105～107CFU/mL的活菌初始浓度。
测试方法：准确吸取调整好菌浓度的菌悬液1mL，4℃条件下以4500rpm转速离心5min，弃去上清，并在离心管中加入1mL的pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液中对离心后的菌体进行重悬，然后将重悬菌液加入9mL杀菌测试液中，快速混匀后静止放置30min，然后进行活菌残留浓度测定。
杀菌率计算：杀菌率＝(1-活菌残留浓度/活菌初始浓度)×100％。
比较例1：
杀菌测试液组成：乳酸链球菌素，0.5g/L(500IU/mL)；柠檬酸，4.0g/L。
表1Nisin测试液对不同微生物的杀菌率
在比较例1中的研究可知(表1)，Nisin在柠檬酸水溶液中对金黄色葡萄球菌ATCC6538具有较好的杀灭作用，但杀灭率不为100％，而是约为99.99％。而且，仅为Nisin的测试杀菌液对四种革兰氏阴性细菌(大肠杆菌ATCC8099、沙门氏菌CMCC50335、柠檬酸杆菌CICC20211和铜绿假单胞菌ATCC15442)和真菌(白假丝酵母ATCC10231)均不具有任何抑制作用，杀菌率均为0％。
比较例2：
杀菌测试液：乳酸链球菌素，0.5g/L(500IU/mL)；乙二胺四乙酸二钠(EDTA2Na)，20.0g/L；柠檬酸，4.0g/L。
表2Nisin与EDTA2Na复配测试液对不同微生物的杀菌率
乳酸链球菌素与EDTA2Na复配后，可以进一步提高Nisin对金黄色葡萄球菌的杀菌率，同时也对革兰氏阴性菌起到了一定的杀灭作用。
从表2中可以看到，当初始菌浓度为106CFU/mL时，Nisin与EDTA2Na复配对大肠杆菌、肠沙门氏菌、柠檬酸杆菌和铜绿假单胞菌的杀菌率分别为90.8462％、94.1818％、93.1429％和91.3000％；当初始菌浓度为105CFU/mL时，Nisin与EDTA2Na复配对大肠杆菌、肠沙门氏菌、柠檬酸杆菌和铜绿假单胞菌的杀菌率分别为90.2308％、92.9090％、87.8571％和92.6000％。而对于白假丝酵母这一真菌，在比较例1和比较例2的研究中并未发现有明显地杀灭作用。
实施例1：
杀菌测试液：乳酸链球菌素，0.5g/L(500IU/mL)；谷氨酸二乙酸四钠(GLDA4Na)，15g/L；葡萄糖酸，1.0g/L；葡萄糖酸钠，10g/L；柠檬酸，4.0g/L。
表3Nisin与GLDA、葡萄糖酸和葡萄糖酸钠复配杀菌测试液对不同微生物的杀菌率
乳酸链球菌素与GLDA4Na、葡萄糖酸和葡萄糖酸钠复配后，与比较例1中单独使用Nisin相比，对金黄色葡萄球菌的杀菌率同样有了提高，杀菌率达到100％。同时与比较例2相比对革兰氏阴性菌的杀灭作用也有了显著提高。
从表3中可以看到，当初始菌浓度为106CFU/mL时，Nisin与GLDA4Na、葡萄糖酸和葡萄糖酸钠复配对大肠杆菌、肠沙门氏菌、柠檬酸杆菌和铜绿假单胞菌的杀菌率分别为94.6932％、98.9091％、95.9286％和94.6000％，与比较例2相比杀菌率分别提高了3.8461％、4.7273％、2.7857％和3.3000％；当初始菌浓度为105CFU/mL时，实施例1的实验对大肠杆菌、肠沙门氏菌、柠檬酸杆菌和铜绿假单胞菌的杀菌率分别为98.4769％、98.1273、98.0000％和96.9000％，与比较例2相比分别提高了8.2461％、5.2183％、10.1429％和4.3000％。
对于白假丝酵母这一真菌，比较例并未发现有明显地杀灭作用。
实施例2：
杀菌测试液：乳酸链球菌素，0.5g/L(500IU/mL)；谷氨酸二乙酸四钠(GLDA)，10g/L；葡萄糖酸，1.2g/L；葡萄糖酸锌，10g/L；柠檬酸，4.0g/L。
表4Nisin与GLDA、葡萄糖酸和葡萄糖酸锌复配杀菌测试液对不同微生物的杀菌率
乳酸链球菌素与GLDA4Na、葡萄糖酸和葡萄糖酸锌复配后，与比较例1中单独使用Nisin相比，对金黄色葡萄球菌的杀菌率有了提高，杀菌率达到100％。同时与比较例2相比，实施例2对革兰氏阴性菌的杀灭作用也有了显著提高。
从表4中可以看到，当初始菌浓度为106CFU/mL时，Nisin与GLDA4Na、葡萄糖酸和葡萄糖酸锌复配对大肠杆菌、肠沙门氏菌、柠檬酸杆菌和铜绿假单胞菌的杀菌率分别为95.9231％、99.2545％、96.7143％和97.8000％，与比较例2相比杀菌率分别提高了5.0769％、5.0727％、3.5714％和6.5000％；当初始菌浓度为105CFU/mL时，实施例2的实验对大肠杆菌、肠沙门氏菌、柠檬酸杆菌和铜绿假单胞菌的杀菌率分别为98.8769％、99.1727％、97.9296％和97.4000％，与比较例2相比分别提高了8.6461％、6.2637％、10.0715％和4.8000％。而且实施例2中的杀菌率结果略高于实施例1。
对于白假丝酵母这一真菌，比较例2的研究结果并未发现有明显地杀灭作用。
实施例3：
杀菌测试液：乳酸链球菌素，0.5g/L(500IU/mL)；谷氨酸二乙酸四钠(GLDA)，10g/L；葡萄糖酸，1.0g/L；葡萄糖酸锌，10g/L；肉桂酸钾，2.0g/L；柠檬酸，3.0g/L。
表5Nisin与GLDA、葡萄糖酸、葡萄糖酸锌和肉桂酸钾复配杀菌测试液对不同微生物的杀菌率
乳酸链球菌素与GLDA4Na、葡萄糖酸、葡萄糖酸锌和肉桂酸钾复配后，与比较例1中单独使用Nisin相比，对金黄色葡萄球菌的杀菌率有了显著提高，杀菌率达到100％。同时与比较例2相比对革兰氏阴性菌和白假丝酵母的杀灭作用也有了显著提高。
从表5中可以看到，当初始菌浓度为106CFU/mL时，Nisin与GLDA4Na、葡萄糖酸、葡萄糖酸锌和肉桂酸钾复配对大肠杆菌、肠沙门氏菌、柠檬酸杆菌和铜绿假单胞菌的杀菌率分别为99.7524％、99.9974％、99.9522％和99.8788％，与比较例2相比杀菌率分别提高了8.9062％、5.8156％、6.8093％和8.5788％；当初始菌浓度为105CFU/mL时，实施例3的实验对大肠杆菌、肠沙门氏菌、柠檬酸杆菌和铜绿假单胞菌的杀菌率分别为99.9600％、99.9978％、99.9927％和99.9956％，与比较例2相比分别提高了9.7292％、7.0888％、12.1356％和7.3956％。而且实施例3中对革兰氏阴性菌的杀菌率结果略高于实施例2。
表5中还表现出，实施例3中的配方对白假丝酵母也具有良好的杀菌作用，杀菌率高于92％，与比较例2相比提高了近90％。
实施例4：
杀菌测试液：乳酸链球菌素，0.8g/L(800IU/mL)；谷氨酸二乙酸四钠(GLDA4Na)，25g/L；葡萄糖酸，0.5g/L；葡萄糖酸锌，15g/L；肉桂酸钾，2.5g/L；柠檬酸，4.0g/L。
表6Nisin与GLDA、葡萄糖酸、葡萄糖酸锌和肉桂酸钾复配杀菌测试液对不同微生物的杀菌率
从表6中可以看到，以实施例4中的配比配制杀菌测试液，杀菌效果得到了进一步的提升。当初始菌浓度为106CFU/mL时，实施例4中对大肠杆菌、肠沙门氏菌、柠檬酸杆菌和铜绿假单胞菌的杀菌率分别为99.9429％、99.9979％、99.9976％和99.9973％，与比较例2相比杀菌率分别提高了9.0967％、5.8161％、6.8547％和8.6973％；当初始菌浓度为105CFU/mL时，实施例3的实验对大肠杆菌、肠沙门氏菌、柠檬酸杆菌和铜绿假单胞菌的杀菌率分别为99.9838％、99.9985％、99.9927％和99.9981％，与比较例2相比分别提高了9.7530％、7.0895％、12.1356％和7.3981％。而且实施例4中对革兰氏阴性菌的杀菌率结果略高于实施例3。
表6中还证明，实施例4中的配方对白假丝酵母的杀菌率得到进一步提高。与比较例2相比提高了95.6652％以上，而与实施例1相比提高了近6％。