专利名称：水合乙醛酸/氨甲基膦酸二烷基酯混合物的制备方法
背景技术：
发明领域本发明涉及在氨甲基膦酸二烷基酯以及催化剂—甘醇酸酯氧化酶((S)-2-羟基酸氧化酶，EC 1.1.3.15)和过氧化氢酶(EC1.11.1.6)的存在下，在水溶液中，用羟基乙酸和氧起反应制备水合乙醛酸和氨甲基膦酸二烷基酯混合物的方法。用该方法得到的水合乙醛酸和氨甲基膦酸二烷基酯混合物是可用于制备N-(膦酰基甲基)甘氨酸的中间产物，而N-(膦酰基甲基)甘氨酸是一种广谱的出苗后(post-emergent)的植物毒剂和除莠剂，可用于控制大量植物的生长。
相关技术的说明甘醇酸酯氧化酶广泛存在于绿叶植物和哺乳动物细胞中，催化羟基乙酸氧化为水合乙醛酸的反应，同时产生过氧化氢
N.E.Tolbert等在J.Biol.Chem.，Vol.181，905-914(1949)中首次报道了从烟叶中提取的一种酶，该酶可催化羟基乙酸的氧化，经形成水合乙醛酸中间物，最后生成甲酸和CO2.加入某些化合物例如1，2-乙二胺，可以限制中间产物水合乙醛酸被进一步氧化。氧化在pH约为8的条件下进行，所用羟基乙酸的浓度通常为约3-40mM(毫摩尔浓度)。甘醇酸酯氧化酶的最适pH据报道为8.9。据报道，草酸(100mM)能抑制甘醇酸酯氧化酶的催化作用.类似的，K.E.Richardson和N.E.Tolbert在J.Biol.Chem.，Vol.236，1280-1284(1961)中表明，在甘醇酸酯氧化酶催化的羟基乙酸的氧化过程中，含三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的缓冲液可抑制草酸的形成。C.O.Clagett，N.E.Tolbert和R.H.Burris在J.Biol.Chem.，Vol.178，977-987(1949)中，报道了甘醇酸酯氧化酶催化的羟基乙酸和氧的氧化反应的最适pH为约7.8-8.6，最适温度为35-40℃。
I.Zelitch和S.Ochoa在J.Biol.Chem.，Vol.201，707-718(1953)中以及J.C.Robinson等在J.Biol.Chem.，Vol.237，2001-2009(1962)中都报道了在波菜甘醇酸酯氧化酶催化的羟基乙酸的氧化反应中，甲酸和CO2的形成来自于H2O2与水合乙醛酸的非酶促反应。他们还观察到，向反应体系中加入能催化H2O2分解的过氧化氢酶时，可以通过抑制甲酸和CO2的形成而大大地提高水合乙醛酸的产率。同时还发现向酶溶液中加入FMN(黄素单核苷酸)时，可以大大地增加甘醇酸酯氧化酶的稳定性。
N.A.Frigerio和H.A.Harbury在J.Biol.Chem.，Vol.231，135-157(1958)中，报道了从波菜中分离甘醇酸氧化酶的制备方法及其性质，纯化的该酶在溶液中极不稳定，这是由于黄素单核苷酸(FMN)在酶的活性位点的结合比较弱，并由于酶从有活性的四聚体和/或八聚体形式解离为无活性的单体和二聚体，并发生不可逆地凝聚和沉淀。向酶溶液中加入FMN(黄素单核苷酸)便能使酶的稳定性大大增加，且高蛋白质浓度或高离子强度也可使酶保持为八聚体或四聚体。
在美国5,135,860号专利中，描述了制备水合乙醛酸和氨甲基膦酸(AMPA)混合物的方法，即在AMPA及两个酶催化剂—甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的存在下，在水合溶液中，使羟基乙酸与氧起反应。在该方法中，还描述了通过使用过氧化氢酶(破坏产生甲酸的过氧化氢副产物)和AMPA作为能与甘醇酸酯形成抗氧化的N-取代半胺和/或亚胺络合物(限制其进一步氧化)的胺添加剂时，所表现出的协同效应。水合乙醛酸的产率据报道可高达92％，且得到的水合乙醛酸和A MPA混合物可用于制备出苗后的植物毒剂和除莠剂N-(膦酰基甲基)甘氨酸。
本发明的简要说明本发明涉及在氨甲基膦酸二烷基酯及两种酶催化剂—甘醇酸酯氧化酶((S)-2-羟基酸氧化酶，EC 1.1.3.15)和过氧化氢酶(EC1.11.1.6)的存在下，在水溶液中，通过用氧氧化羟基乙酸制备水合乙醛酸和氨甲基膦酸二烷基酯混合物的方法。以前使用的氨甲基膦酸(AMPA)在反应中会抑制过氧化氢酶活性，用氨甲基膦酸二烷基酯代替AMPA，可使水合乙醛酸的产量得到意外地提高。水合乙醛酸和氨甲基膦酸二烷基酯的混合物可用来制备出苗后的植物毒剂和除莠剂N-(膦酰基甲基)甘氨酸。
美国5,135,860号专利中，描述了用可溶性的波菜甘醇酸酯氧化酶和可溶性的过氧化氢酶(例如从黑曲霉(Aspergillusniger)中提取的可溶性过氧化氢酶)作催化剂，制备水合乙醛酸和氨基甲基膦酸(AMPA)混合物的方法。美国的5,180,846号专利中，描述了这些混合物氢化产生N-(膦酰基甲基)甘氨酸的方法。在相关的U.S.S.N.07/951,497号专利申请中，描述了用能表达波菜甘醇酸酯氧化酶和内源性过氧化氢酶两种酶的遗传工程微生物转化细胞作为催化剂，制备水合乙醛酸/AMPA混合物的方法。还观察到AMPA可道地对多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)或巴斯德毕赤氏酵母(PichiaPastoris)的转化细胞中内源性过氧化氢酶的抑制作用，使过氧化氢不能分解为水和氧，结果导致大量甲酸(过氧化氢氧化水合乙醛酸的产物)的生成。当用多型汉逊氏酵母或巴斯德毕赤氏酵母的转化细胞作为催化剂时，向反应体系的混合物中加入另一种来源的过氧化氢酶(例如来源于黑曲霉的可溶性过氧化氢酶)可得到高产率的水合乙醛酸。
分别用来自黑曲霉、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多型汉逊酵母、巴斯德毕赤氏酵母和牛肝的过氧化氢酶作催化剂，进行分解在甘醇酸酯/AMPA混合物的氧化过程中产生的过氧化氢的检验，发现AMPA对来源于多型汉逊酵母、巴斯德毕赤氏酵母和牛肝中的过氧化氢酶有可逆抑制作用，这是以前未曾报道的。该抑制作用与是否使用可溶性的过氧化氢酶、固定化的过氧化氢酶或含过氧化氢酶的全细胞催化剂无关。除向用一种AMPA抑制来源的过氧化氢酶(例如多型汉逊酵母或巴斯德毕赤氏酵母转化细胞)作为催化剂的甘醇酸酯/AMPA反应体系中加入另一来源的抗抑制的过氧化氢酶之外，也可在相同的反应体系中，用氨甲基膦酸二烷基酯代替AMPA，获得消除或显著降低对某些过氧化氢酶的抑制作用的意外效果，以致用AMPA作为胺添加物时也能正常发生。
在用可溶性甘醇酸酯氧化酶和可溶性黑曲霉过氧化氢酶(不被AMPA抑制)或可溶性多型汉逊酵母过氧化氢酶(被AMPA抑制)作为催化剂的羟基乙酸氧化反应体系中，比较AMPA和氨甲基膦酸二乙基酯(DEAMPA)作为胺添加物，在产生水合乙醛酸的最适反应条件(按实施例中描述)下，水合乙醛酸和甲酸的产量列于下表。当用黑曲霉或多型汉逊酵母的可溶性过氧化氢酶作催化剂时，用DEAMPA比用AMPA可得到更高的水合乙醛酸产量。在黑曲霉过氧化氢酶浓度低时，水合乙醛酸产率的提高可能是由于DEAMPA的质子化胺比AMPA有更低的pKa(DEAMPA的pKa为6.4，AMPA的pKa为10.8)，而DEAMPA的较低的pKa有助于非质子化的DEAMPA与羟基乙酸在反应进行的pH(pH8.3-8.5)时形成抗氧化的半胺或亚胺络合物。
过氧化氢酶 [过氧化氢 水合乙甲酸酶] 醛酸胺 的来源(IU/mL)(％)(％)AMPA 黑曲霉 1,400 70 20AMPA 黑曲霉 14,000 92 2DEAMPA黑曲霉 1,400 95 4DEAMPA黑曲霉 14,000 97 1AMPA 多型汉逊酵母 5,600 43 45AMPA 多型汉逊酵母 14,000 64 24AMPA 多型汉逊酵母 56,000 68 6DEAMPA 多型汉逊酵母 1,400 84 12DEAMPA 多型汉逊酵母 14,000 98 1
在使用DEAMPA或AMPA以及多型汉逊酵母的可溶性过氧化氢酶的反应体系中，比较水合乙醛酸产率和甲酸产量(见上表)可以看出，用DEAMPA作为胺添加物时，水合乙醛酸产率显著增加，而甲酸的产量明显降低。使用低浓度的多型汉逊酵母的可溶性过氧化氢酶时，用DEAMPA可显著提高水合乙醛酸产率，当用AMPA时，增加同一种酶的浓度，并不能得到用DEAMPA时相应的水合乙醛酸产率。同样地，当用多型汉逊酵母或巴斯德毕赤氏酵母的转化细胞作为催化剂，并用DEAMPA代替AMPA时，也能提高水合乙醛酸的产率，同时降低甲酸的产量(见所附实施例)。
优选实施方案的说明羟基乙酸的催化氧化常在能催化羟基乙酸和O2反应生成水合乙醛酸的酶催化剂存在下，通过羟基乙酸和氧分子源的接触很方便地进行。这样的一种催化剂是甘醇酸酯氧化酶(EC 1.1.3.15)，也叫羟基乙酸氧化酶。甘醇酸酯氧化酶可以从本领域技术人员所熟知的很多来源中分离得到(见上述)。反应体系中所用的甘醇酸酯氧化酶必须达到有效的浓度，通常是约0.01-约1000IU/mL的浓度，优选约0.1-约10IU/mL。1 IU(国际单位)的定义为每分钟催化1微摩尔底物转换所需的酶量。该酶可以按I.Zelitch和S.Ochoa在J.Biol.Chem.，Vol.201，707-718(1953)中描述的方法测定。该方法也可用于测量回收的或再循环的甘醇酸酯氧化酶的活性。
用甘醇酸酯氧化酶作为催化剂氧化羟基乙酸转换为水合乙醛酸时，向反应体系中加入促进过氧化氢分解的催化剂可以得到最佳的结果。能与甘醇酸酯氧化酶有效结合的这样一种过氧化物破坏酶是过氧化氢酶(E.C.1.11.1.6)。过氧化氢酶催化过氧化氢分解为水和氧，并且可以确信，在本方法中，可以在甘醇酸酯氧化酶催化的羟基乙酸和O2的反应体系中，通过加速作为副产物产生的过氧化氢的分解而提高水合乙醛酸的产率。过氧化氢酶的浓度必须达到50-50,000IU/mL，优选2,000-15,000IU/mL。过氧化氢酶和甘醇酸酯氧化酶的浓度最好在上述范围内调节，以使过氧化氢酶与甘醇酸酯氧化酶的比值(测量每种酶的IU)至少为约250∶1。
除用可溶性酶作为催化剂外，还制备了能表达甘醇酸酯氧化酶活性和内源性过氧化氢酶活性的微生物转化细胞，并在本发明中描述了它们作为微生物催化剂的用法。本发明中所用的微生物细胞催化剂为多型汉逊酵母(一种甲基营养型酵母)的转化细胞。通过向受甲酸脱氢酶(FMD)启动基因控制的表达载体中插入甘醇酸酯氧化酶的DNA，制备了几个具有足够高甘醇酸酯氧化酶活性的多型汉逊酵母的转化细胞系。多型汉逊酵母与这种质粒一起被转化，并挑选出一个表达高水平甘醇酸酯氧化酶的菌株，标记为多型汉逊酵母GO1。
制备多型汉逊酵母细胞催化剂的经典方法，首先是多型汉逊酵母转化细胞的接种物在500mL，pH4.4的YPD(Difco)中生长，然后将培养物接种到pH为5.0的10L含无氨基酸的酵母氮碱(YBN)(14g)、硫酸铵(50g)和甲醇(100g)的发酵罐中，在37℃操作42.5小时，搅拌转速为400rpm，恒定pH在5.0，40％溶解的氧(控制)和14psig的空气。发酵结束后，加入1.0千克的甘油，离心收集细胞，液氮冷冻后，贮藏于-80℃。
本发明所用到的第二种微生物细胞催化剂是巴斯德毕赤氏酵母(一种甲基营养型酵母)的转化细胞，它能表达来源于波菜的甘醇酸酯氧化酶和内源性的过氧化氢酶。通过向例如受甲醇诱导的乙醇氧化酶I启动基因控制的巴斯德毕赤氏酵母表达载体(pHIL-D4)中，插入包含来源于波菜的甘醇酸酯氧化酶基因的DNA片段，得到pMPl质粒，制备了几个具有足够高甘醇酸酯氧化酶活性的多型汉逊酵母的转化细胞系。巴斯德毕赤氏酵母GTS115(NRRL Y-15851)经pMPl质粒转化，挑选出整合线性pMPl质粒到染色体中乙醇氧化酶I的位点，并用甘醇酸酯氧化酶基因取代乙醇氧化酶基因。这种转化细胞库用于进一步挑选最大数量的整合表达框的拷贝数。分离出高拷贝数的转化细胞，标记为GS115-MSP10，并保藏在NRRL中(Peoria，Illinois，1992年9月24日，NRRL编号为Y-21001)。
制备巴斯德毕赤氏酵母细胞的经典方法是，将巴斯德毕赤氏酵母细胞的接种物在30℃、100mL含1％甘油的YNB中生长，48小时后，细胞转移到含10L由无氨基酸酵母氮碱(YNB)(134g)、甘油(100g)和生物素(20mg)组成的培养基的发酵罐。发酵的pH为5.0(用NH4OH控制)，温度为30℃，搅拌速度200rpm，5slpm通气，5psig的空气，溶解的氧至少达到不低于50％饱和度。当甘油消耗殆尽时，将细胞在相同的培养基(用甲醇(50克)代替甘油)中诱导表达甘醇酸酯氧化酶。测量诱导甘醇酸酯氧化酶的过程的酶活性，然后进行酶分析。24小时后，用甘油(1kg)处理，收集细胞，液氮冷冻后，贮藏于-80℃。
多型汉逊酵母和巴斯德毕赤氏酵母细胞的转化细胞，在用作羟基乙酸氧化为水合乙醛酸的反应的催化剂前，需要进行透性化处理。很多公知的透性化的方法都可用来制备具有足够高活性甘醇酸酯氧化酶的细胞(见Felix，H.Anal.Biochemistry，Vo1.120，211-234，(1982))。惯用的方法是，将10％湿细胞的含0.1％(v/v)Triton X-100/20mM的磷酸的缓冲液(pH7.0)的悬浮液混合15分钟，然后冻于液氮中，冻融，并用0.1mM FMN/20mM磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤。第二种透性化处理的方法是，将10％湿细胞的含0.2％(w/v)氯苄烷铵/20mM的磷酸缓冲液(pH7.0)的悬浮液混合，60分钟后，用0.1mM FMN/20mM磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤。透性化处理后，选择加入反应混合体系中的全细胞催化剂的量，以使甘醇酸酯氧化酶的浓度和过氧化氢酶的活性达到上面描述的相应可溶性酶浓度所需的浓度。甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶活性的回收大于其初始值的100％，这可能是由于在反应进行的过程中增加了全细胞催化剂的透性。
测量微生物细胞转化细胞的甘醇酸酯氧化酶活性时，准确称取约5-10mg的湿细胞(用滤纸吸去多余的水份)，加入到3-mL的石英比色杯中，杯中放有磁子搅拌棒和2.0mL0.12mM 2，6-二氯靛酚(DCIP)及80mM TRIS的缓冲液(pH8.3)。比色杯上盖一层橡皮隔膜，向溶液中通入氮气鼓泡5分钟去氧，然后，搅拌下加入40μL 1.0M的羟基乙酸/1.0MTRIS(pH8.3)，一边搅拌混合物，一边在605nm(ε＝22,000)波长下测量随时间的变化的吸收值。
测量过氧化氢酶活性时，准确称取约2-5mg的湿细胞(用滤纸吸去多余的水份)，加入到3-mL的石英比色杯中，杯中放有磁子搅拌棒和2.0mL蒸镏水。然后，加入1.0mL含59mM过氧化氢的50m M磷酸缓冲液(pH7.0)。在240nm(ε＝39.4)波长下测量随时间变化的吸收值。不同培养基中培养的多型汉逊酵母或巴斯德毕赤氏酵母湿细胞(透性化)，其甘醇酸氧化酶的活性在20-120DCIPIU/克湿细胞的范围，内源性过氧化氢酶的活性在30,000-200,000IU/克湿细胞的范围。
在反应混合物中可选择适当的有益组分，最常用的是黄素单核甘酸(FMN)，其所用浓度通常可高到约2.0mM，优选约0.01到约0.2mM的浓度。FMN确信可以增加甘醇酸酯氧化酶的生产率，这意味着每单位的酶可以促使更多的羟基乙酸转换为水合乙醛酸。应该理解的是，加入的FMN的浓度应该除去酶中已存在的任何FMN，因为在制备酶的过程中通常也向酶中加入FMN。FMN的结构及其检测方法可以参见K.Yagai，Methods Of BiochemicalAnalysis，Vol.X，Interscience Publishers，New York，1962，P.319-355，在此引用作为参考文献。
羟基乙酸很容易并优选在水性介质中转换为水合乙醛酸。羟基乙酸(2-羟基乙酸)可购得，在本发明中其反应起始浓度在0.10M到2.0M的范围，优选在0.25M和1.0M间的浓度，可用其原有形式或其相容的盐形式，即水溶性且其阳离子不干扰羟基乙酸向水合乙醛酸的转换，或下一步水合乙醛酸和氨甲基膦酸二烷基酯产生N-(膦酰基甲基)甘氨酸的反应的盐。合适的且相容的成盐阳离子应该是很容易被检测，这样的盐有碱金属、碱土金属、铵、取代铵、及取代的鏻盐。
本发明的氨甲基膦酸二烷基酯的分子式为 其中，X和Y各自是烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基等，这样形成的氨甲基膦酸二烷基酯在水性反应混合物中可部分或完全溶解。加入氨甲基膦酸二烷基酯的量为，按氨甲基膦酸二烷基酯和羟基乙酸(起始量)摩尔比，从0.01到3.0的范围，优选从0.25到1.05的范围。在氨甲基膦酸二烷基酯和羟基乙酸在水溶液中化合后，调节最终混合物的pH在6和10之间，优选在7.0-9.0之间.在这一pH范围内，可以通过加入相容的无干扰的碱精确调整pH到所需的pH值，这些碱包括碱金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐和磷酸盐。在反应过程中，反应混合物的pH会发生轻微地下降，故通常有用地在最大酶活性PH范围的高限开始反应，即约在9.0-8.5，这样可以允许在反应过程中pH有所下降。由于酶活性会随pH发生改变，因此可以任选通过另外加入无干扰的无机或有机缓冲液保持pH稳定。
羟基乙酸和水合乙醛酸在水中有很高的离解度，当pH在7和10之间时，不难理解，即便不是全部也是绝大多数的羟基乙酸和水合乙醛酸以离子形式存在。本领域熟练的技术人员可认识到水合乙醛酸(及其共轭碱水合乙醛酸阴离子)也可以以例如(HO)2CHCOOH的水合物和/或HOOCCH(OH)OCH(OH)COOH的半缩醛形式存在，这样的组成及其阴离子配对物等当量于水合乙醛酸及其阴离子，成为形成N-(膦酰基甲基)甘氨酸的适合反应物。同样的，氨甲基膦酸二烷基酯可以部分或完全以质子化的胺阳离子形式存在，其反离子可以是一个或多个存在于反应混合物中的阴离子。
作为羟基乙酸转换为水合乙醛酸的氧化剂的氧气(O2)，可以通过在气-液界面搅动液体，或通过透过氧气的膜，向反应体系中加入气体氧。在多数条件下，反应速度至少部分取决于氧溶进水介质的速度。因此，虽然氧可以以空气加入到反应体系中，但最好是用较纯的氧，甚至高压氧。尽管不知道氧压力的上限，但可用至多50个大气压的氧，优选15个大气压的上限。搅动对保证氧气的高溶解速度(以及反应)是很重要的。只要方便，可以使用任何形式的搅动例如搅拌。另一方面，从事酶领域研究的技术人员都知道，剧烈地剪切搅拌或产生气泡的搅拌会使可溶性酶的活性下降，因此，使用可溶性的酶作催化剂时应该避免这类搅拌。
反应温度是一个重要的变量，它影响着反应速度和酶的稳定性。反应可用0℃到40℃的温度，优选从5℃到15℃的温度范围。在优选的温度范围内操作，可以保证在反应最后得到最大的回收酶活性。温度不能低到水溶液开始结冰的程度。温度能用普通的方法例如(但不仅限于此)通过用夹套反应器并让适当温度的液体流过夹套控制。可用任何材质制造反应容器，只要该材质对反应成分是惰性就行。
反应完成后，可溶性的酶可以通过过滤或离心除去并重复使用。它们也可以通过在例如70℃加热5分钟后沉淀变性，和/或只要在后面的混合物转换为N-(膦酰基甲基)甘氨酸及从反应混合物中回收N-(膦酰基甲基)甘氨酸的步骤中不起干扰任用，也可以继续留在反应混合物中。微生物细胞的转化细胞可以经过滤或离心后回收并重复使用。反应溶液与O2的接触的终止后，优选在可溶性酶或全细胞催化剂除去之后，则可以通过与活性碳的接触任选除去黄素单核苷酸(FMN)。
水合乙醛酸和氨甲基膦酸二烷基酯的终产物混合物(与相应的半胺与亚胺平衡)可以用本领域技术人员所熟知的方法处理以合成N-(膦酰基甲基)甘氨酸。催化加氢水合乙醛酸/氨甲基膦酸二烷基酯的混合物然后水解的催化氢化产物N-(二烷氧基氧膦基甲基)甘氨酸，是从水合乙醛酸和氨甲基膦酸二烷基酯制备混合物N-(膦酰基甲基)甘氨酸的优选方法。适用于这一目的的加氢催化剂包括(但不局限于此)多种铂族金属例如铱、锇、铑、钌、铂和钯，还包括多种其他过渡金属例如钴、铜、镍和锌。催化剂可以无载体例如阮内镍或氧化铂，或有载体如在碳上的铂、在氧化铝上的钯或在硅藻土上的镍。优选在碳上的铂、在硅藻土上的镍或阮内镍。氢化反应的pH一般在4-11间，优选5-10间。氢化反应的温度和压力可以有很宽的选择。温度一般在0℃-150℃的范围，优选20℃到90℃。而H2压一般在从大气压到约100个大气压范围，优选从1到10个大气压。
氢化水合乙醛酸/氨甲基膦酸二烷基酯混合物产生的N-(二烷氧基氧膦基甲基)甘氨酸可经向水性产物混合物中加入过量的盐酸或氢溴酸，并加热而水解得到N-(膦酰基甲基)甘氨酸。用作出苗后的除草剂的N-(膦酰基甲基)甘氨酸，可以用本领域技术人员所熟知的回收方法从终混合物中回收。
在用于进一步说明本发明的下面的实施例中，水合乙醛酸、甲酸和草酸的产率，以及甘醇酸酯的回收产率，用占反应开始阶段羟基乙酸总量的百分数表示。反应混合物通过Bio-Rad HPX-87H有机酸分析柱用高压液相色谱(HPLC)进行分析。
实施例1向3盎司的费歇尔-玻特(Fischer-Porter)玻璃气溶胶反应器中放入一磁子搅拌棒，加入10mL含羟基乙酸(0.25M)、氨甲基膦酸(AMPA，0.263M)、FMN(0.01mM)、丙酸(HPLC内标物，0.125M)、波菜甘醇酸酯氧化酶(1.0IU/mL)和可溶性黑曲霉过氧化氢酶(1,400IU/mL)的pH8.5的水溶液。密封反应器，并将反应混合物冷却至15℃。搅拌下用氧气加压至70psig，并排气到大气5次，以此吹洗。然后将反应器加压到70psig的氧气，在15℃搅拌反应混合物。用注射器通过取样口(不要减少反应器中的压力)在以规定间隔取每等分样品(0.10mL)进行HPLC分析监测反应过程。5小时后，水合乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为70.4％、19.6％和2.2％，并剩余5.3％的甘醇酸酯。甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别为其初始值的27％和100％。
实施例2用含羟基乙酸(0.500M)、AMPA(0.500M)、FMN(0.01mM)、异丁酸(HPLC内标物，0.100M)、波菜甘醇酸酯氧化酶(1.0IU/m L)和可溶性黑曲霉过氧化氢酶(1,400IU/mL)的水溶液，在pH8.5和5℃的条件下，重复实施例1中描述的反应步骤。21小时后，水合乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为85.2％、1.5％和3.3％，并剩余5.5％的甘醇酸酯。甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别为其初始值的49％和93％。
实施例3用含羟基乙酸(0.500M)、AMPA(0.375M)、FMN(0.01mM)、异丁酸(HPLC内标物，0.100M)、波菜甘醇酸酯氧化酶(1.0IU/mL)和1,400IU/mL的分别来源于黑曲酶、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、牛肝、或多型汉逊酵母的可溶性过氧化氢酶的水溶液，在pH8.5和5℃的条件下，重复实施例1中描述的反应步骤。反应时间、甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的回收活性以及水合乙醛酸、甲酸、草酸和羟基乙酸的产率分别列于下表可溶性 时间 过氧化 甘醇酸酯 水合 甲酸 草酸 羟基乙氢 乙醛 酸酸过氧化氢酶 (小时) 酶(％)氧化酶 (％) (％) (％) (％)(％)黑曲霉 19 8139 92.1 1.94.7 1.8啤酒酵母18 5937 94.2 2.6 03.0牛肝 18 3427 40.0 51.4 2.5 5.3多型汉逊酵 19 7546 64.3 23.7 4.0 2.7母实施例4分别用1,400IU/m L的黑曲酶或多型汉逊酵母的可溶性过氧化氢酶的水溶液，在15℃条件下重复实施例3的反应。反应时间、甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的回收活性以及水合乙醛酸、甲酸、草酸和羟基乙酸的产率分别列于下表可溶性 时间 过氧化氢 甘醇酸酯 水合乙 甲酸 草酸 羟基乙醛酸过氧化氢酶 (小时) 酶(％)氧化酶(％) (％) (％) 酸(％)(％)黑曲霉 20 8412 87.3 1.8 2.78.2多型汉逊酵20 6417 62.0 27.9 2.94.7母实施例5分别用5,600IU/mL或56,000的IU/mL的可溶性多型汉逊酵母过氧化氢酶重复实施例3的反应。对于三种浓度的过氧化氢酶，其反应时间、甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的回收活性以及水合乙醛酸、甲酸、草酸和乙醇酸的产率都列于下表多型汉逊 时间 过氧化 甘醇酸酯 水合乙 甲酸 草酸 羟基乙酵 氢 醛酸母(小时) 酶(％) 氧化酶(％) (％) (％) 酸(％)(IU/mL) (％)5,600 22 48 25 42.9 44.501.614,00020 64 17 62.0 27.9 2.9 4.756,00022 12 14 68.4 6.34 2.4 6.5实施例6
用含羟基乙酸(0.500M)、氨甲基膦酸二乙基酯(DEAMPA，0.398M)、FMN(0.01mM)、异丁酸(HPLC内标物，0.100M)、波菜甘醇酸酯氧化酶(1.0IU/mL)和可溶性黑曲霉过氧化氢酶(14,000IU/mL)的水溶液，在pH8.3和5℃的条件下，重复实施例1中描述的步骤。20小时后，水合乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为97.4％、0.8％和1.8％，且没有剩余的甘醇酸酯。甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别为其初始值的10％和95％。
实施例7用含羟基乙酸(0.50M)、DEAMPA(0.525M)、FMN(0.01mM)、异丁酸(HPLC内标物，0.10M)、波菜甘醇酸酯氧化酶(1.0IU/mL)和可溶性黑曲霉过氧化氢酶(1,400IU/mL)的水溶液，在pH8.3的条件下，重复实施例6中的反应。23小时后，水合乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为95.3％、3.9％和1.5％，且没有剩余的甘醇酸酯。甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别为其初始值的12％和100％。
实施例8分别用1,400IU/mL或14,000IU/mL的可溶性多型汉逊酵母过氧化氢酶，重复实施例7与DEAMPA(0.525M)的反应。反应时间、甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的回收活性以及水合乙醛酸、甲酸、草酸和羟基乙酸的产率列于下表多型汉逊 时间 过氧化 甘醇酸酯 水合乙 甲酸 草酸 羟基乙酵氢 醛酸母 (小时) 酶(％) 氧化酶(％) (％) (％) (％) 酸(％)(IU/mL)1,400 10 76 31 84.21 1.5 0.62.314,000 10 79 38 98.2 1.3 0.42.8实施例9在3盎司的费歇尔-玻特玻璃气溶胶反应器中，放入一个磁子搅拌棒，加入10mL含羟基乙酸(0.500M)、氨甲基膦酸(0.375M)、异丁酸(0.100M，HPLC内标物)、黄素单核苷酸(0.01mM)的水溶液，调pH(用50％的NaOH)到8.3，并冷却至5℃。再向反应器中加入0.47克事先经0.1％Triton X-100/1次冻溶处理后透性化的多型汉逊酵母转化细胞G01(10IU的甘醇酸酯氧化酶和22,100IU的过氧化氢酶)，封闭反应器，并将反应混合物冷却至5℃。搅拌下用氧加压至70psig，并排气到大气5次，以此吹洗。然后将反应器加压到70psig的氧气，在5℃搅拌反应混合物。用注射器通过取样口(不要减少反应器中的压力)以规定间隔取每等分(0.10mL)样作HPLC分析监测反应过程。5小时后，水合乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为57.6％、32.5％和2.6％，并剩余8.9％的甘醇酸酯。剩余透性细胞中甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的活性分别为其初始值的60％和378％。
实施例10重复实施例9的反应，只是在反应混合物中再加入14,000IU/mL的可溶性黑曲霉过氧化氢酶.6小时后，水合乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为90.1％、1.3％和5.9％，并剩余3.0％的甘醇酸酯。甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的剩余活性分别为其初始值的86％和136％。
实施例11重复实施例9的反应，只是用0.75克事先经0.1％TritonX-100/1次冻溶处理后透性化的巴斯德毕赤氏酵母转化细胞MSP10(13.2IU的甘醇酸酯氧化酶和21,200IU的过氧化氢酶)代替多型汉逊酵母转化细胞。16小时后，水合乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为30.5％、59.2％和10.7％，并剩余0.8％的甘醇酸酯。
实施例12在3盎司的费歇尔-玻特玻璃气溶胶反应器中放入一个磁子搅拌棒，加入10mL含羟基乙酸(0.500M)、DEAMPA(0.525M)、异丁酸(0.100M，HPLC内标物)和黄素单核苷酸(0.01mM)的水溶液，调pH(用50％的NaOH)到8.3，并冷却至5℃。再向反应器中加入1.5克事先经0.1％Triton X-100/一次冻溶处理后透性化的多型汉逊酵母转化细胞G01(8.0IU的甘醇酸酯氧化酶和38,000IU的过氧化氢酶)，然后封闭反应器，并将反应混合物冷却至5℃。搅拌下用氧气加压至70psig，并排气到大气5次，以此吹洗。然后将反应器加压到70psig的氧气，在5℃搅拌反应混合物。用注射器通过取样口(不要减少反应器中的压力)以规定间隔取每等分(0.10mL)样作HPLC分析监测反应过程。9小时后，水合乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为98.4％、0％和2.0％，并没有剩余的甘醇酸酯。剩余透性细胞中甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的活性分别为其初始值的63％和250％。
实施例13用含羟基乙酸(0.500M)、AMPA(0.525M)、异丁酸(0.100M，HPLC内标物)、黄素单核苷酸(0.01mM)和0.72克事先用0.2％氯苄烷铵(Lonza Barquat OJ-50)处理后透性化的多型汉逊酵母转化细胞G01(43.0IU的甘醇酸酯氧化酶和39,880IU的过氧化氢酶)的混合物，在pH8.3(用50％的NAOH)和5℃条件下，重复实施例12的反应。1小时后，水合乙醛酸、甲酸和草酸的HPLC产率分别为50.2％、47.4％和1.1％，并剩余2.2％的甘醇酸酯。剩余透性细胞中甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的活性分别为其初始值的95％和105％。
实施例14分别用AMPA(0.375M)或DEAMPA(0.375M)作为胺添加剂，重复实施例13的反应。反应时间、甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的回收活性以及水合乙醛酸、甲酸、草酸和乙醇酸的产率列于下表时间 过氧化 甘醇酸酯 水合乙 甲酸 草酸 羟基乙氢 醛酸胺 (小时) 酶(％) 氧化酶 (％) (％) (％) 酸(％)(％)AMPA 5 99 54 42.7 47.3 10.7 4.7DEAMPA 1 122 108 83.5 15.5 5.60实施例15
用含羟基乙酸(0.500M)、AMPA(0.375M)或DEAMPA(0.375M)、异丁酸(0.100M，HPLC内标物)、黄素单核苷酸(0.01mM)和0.23克事先用0.2％氯苄烷铵(LonzaBarquat OJ-50)处理后透性化的巴斯德毕赤氏酵母转化细胞GS115-MSP10(12.3IU的甘醇酸酯氧化酶和39,420IU的过氧化氢酶)的混合物，在pH8.3(用50％的NaOH)和5℃条件下，重复实施例12的反应。反应时间、回收甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的活性以及水合乙醛酸、甲酸、草酸和乙醇酸的产率列于下表时间 过氧化 甘醇酸酯 水合乙 甲酸 草酸 羟基乙氢 醛酸胺 (小时) 酶(％)氧化酶 (％) (％) (％) 酸(％)(％)AMPA4130 214 59.7 36.2 4.31.5DEAMPA 1124 268 92.9 3.6 3.9 0实施例16分别用AMPA(0.525M)或DEAMPA(0.525M)作为胺添加剂，重复实施例15的反应。反应时间、甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的回收活性以及水合乙醛酸、甲酸、草酸和乙醇酸的产率列于下表时间 过氧化 甘醇酸酯 水合乙 甲酸 草酸 羟基乙氢 醛酸胺 (小时) 酶(％) 氧化酶(％) (％) (％) 酸(％)(％)AMPA 4 130 246 58.2 34.6 3.6 1.9DEAMPA 1 118 276 95.1 1.63.30实施例17按实施例12中描述的方法，用微生物转化细胞作催化剂，从羟基乙酸(0.50M)和DEAMPA(0.525M)的混合物制备的水合乙醛酸(0.49M)和DEAMPA(0.525M)的混合物，经Amicon Centriprep 10号浓缩器(截留分子量10,000)过滤除去可溶性蛋白质，然后与0.10克的活性碳混合除去FMN，过滤，滤液放入带磁子搅拌棒的3盎司费歇尔-玻特瓶中。向瓶中加入0.100克10％的Pd/C，并封闭反应瓶，用氮气吹洗，然后用氢气加压至50psig，在25℃搅拌，当氢压下降时，补加氢气使压力保持在50psig。当氢气压力保持稳定时，通过卸压和用氮气吹洗反应。向含N-(二乙氧基氧膦基甲基)甘氨酸的最终水溶液中，加入过量的浓盐酸并加热至沸腾，导致二烷基膦酸酯水解，浓缩所得混合物，用结晶法分离N-(膦酰基甲基)甘氨酸。
以上以某种程度的特殊性，对本发明进行说明和示例，但应理解的是后边的权利要求并不限于此，而是为权利要求提供与权利要求的每一要求及相应内容的措词相适应的范围。
权利要求
1.制备水合乙醛酸酯和氨甲基膦酸二烷基酯混合物的方法，包括在氨甲基膦酸二烷基酯及甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的存在下，在水溶液中，用氧氧化甘醇酸酯。
2.制备用于合成N-(膦酰基甲基)甘氨酸的中间产物的方法，中间产物包括含有水合乙醛酸酯和氨甲基膦酸二烷基酯的混合物，所述方法包括在氨甲基膦酸二烷基酯的存在下，酶催化甘醇酸酯转化为水合乙醛酸酯。
3.制备N-(膦酰基甲基)甘氨酸的方法，包含下列步骤(A)在氨甲基膦酸二烷基酯及甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的存在下，在水溶液中，用氧氧化甘醇酸酯合成水合乙醛酸酯和氨甲基膦酸二烷基酯的混合物；(B)还原步骤(A)中所得的混合物，得到N-(二烷氧基氧膦基甲基)甘氨酸；和(C)水解步骤(B)中所得的N-(二烷基氧膦基甲基)甘氨酸，得到N-(膦酰基甲基)甘氨酸。
4.按权利要求1的方法，其中所述过氧化氢酶来自黑曲霉、构巢曲霉、啤酒酵母、多型汉逊酵母、巴斯德毕赤氏酵母和牛肝中。
5.按权利要求2的方法，其中所述酶促转化甘醇酸酯为水合乙醛酸酯的过程在甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶存在下进行，所述过氧化氢酶来自黑曲霉、构巢曲霉、啤酒酵母、多型汉逊酵母、巴斯德毕赤氏酵母和牛肝。
6.按权利要求3的方法，其中所述过氧化氢酶来自黑曲霉、构巢曲霉、啤酒酵母、多型汉逊酵母、巴斯德毕赤氏酵母和牛肝。
7.按权利要求1的方法，其中过氧化氢酶和甘醇酸酯氧化酶以微生物全细胞催化剂形式使用，微生物全细胞催化剂选自多型汉逊酵母和巴斯德毕赤氏酵母。
8.按权利要求2的方法，其中所述酶促转化甘醇酸酯为水合乙醛酸酯的过程在甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶存在下进行，酶以选自多型汉逊酵母和巴斯德毕赤氏酵母的微生物全细胞催化剂形式使用。
9.按权利要求3的方法，其中所述过氧化氢酶和甘醇酸酯氧化酶以选自多型汉逊酵母和巴斯德毕赤氏酵母的微生物全细胞催化剂形式使用。
全文摘要
本发明提供了制备水合乙醛酸酯和氨甲基膦酸二烷基酯混合物及其后续产物N-(膦酰基甲基)甘氨酸的方法，即在氨甲基膦酸二烷基酯及甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶催化剂的存在下，在水溶液中，使羟基乙酸和氧在酶催化下反应，制备水合乙醛酸酯和氨甲基膦酸二烷基酯(DEAMPA)混合物；所得混合物可被氢化并进一步水解，得到N-(膦酰基甲基)甘氨酸，可用作出苗后的植物毒剂和除莠剂。
文档编号C12P13/04GK1124981SQ94192283
公开日1996年6月19日 申请日期1994年5月20日 优先权日1993年5月28日
发明者D·L·安敦, R·迪科西莫 申请人:纳幕尔杜邦公司