专利名称：一种抗体/蛋白a-dna探针的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种抗体/蛋白A-DNA探针的构建方法，抗体指一抗和二抗，属生物工程技术领域。
背景技术：
。在临床医学、法医学、兽医学、农学以及分子生物学等领域的基础和应用研究中，都涉及到微量或超微量抗原抗体的检测技术。1992年10月2日，Tadeshi Sano等在‘科学(Science)’杂志，第258卷(VOL.258)上发表题为‘免疫-聚合酶链反应利用特异抗体-DNA嵌合体的高灵敏抗原检测技术(Immuno-PCRVerySensitive Antigen Detection by Means of SpecificAntibody-DNA Conjugates)’的论文，提出一项灵敏度极高的、检测抗原的免疫-聚合酶链反应(Immuno-PCR)。该技术通过应用一个对DNA和抗体具双重结合活性的连接分子，把作为标志物的DNA分子特异地结合到抗体复合物上，这种DNA标志物可用特异的引物进行PCR扩增，根据特异性PCR的产物，证明抗原的存在与否。该技术的优点是把PCR的DNA扩增能力与免疫学中抗原抗体反应的高度特异性结合在一起，大大地提高了抗原抗体检测的灵敏度，无放射污染。该技术的缺点是用于构建抗体-DNA探针的连接分子是链霉抗生物素-蛋白A融合蛋白，目前尚未商品化，难以获得。
本发明的目的在于推出一种简便而直接的、有背景技术优点而没有背景技术缺点的抗体/蛋白A-DNA探针的构建方法。
现详细说明本发明的技术内容。本发明涉及一种抗体/蛋白A-DNA探针的构建方法，抗体指一抗和二抗，其特征在于，该方法包括三个必需的步骤将抗体或蛋白A与对苯醌(PBQ)反应，旨使抗体或蛋白A活化，加入聚乙烯亚胺(PEI)，旨使抗体或蛋白A进一步活化，加入交联剂戊二醛，旨使活化的抗体或蛋白A与单链DNA分子共价结合，构建成抗体/蛋白A-DNA探针，该方法的全部步骤罗列如下第1步 取0.01～10mg的抗体或蛋白A，溶于440μl的，浓度和pH值分别为90m mol/l和6.0的磷酸缓冲液中，以抗体为原料，最终构建成的探针是抗体-DNA探针，以蛋白A为原料，最终构建成的探针是通用型蛋白A-DNA探针；第2步 向第1步制备的溶液中加入120μl的PBQ溶液，再把混和溶液置于温度为37℃的黑暗环境，反应时间为1小时；第3步 将第2步的反应液上Sephadex G 100柱，并用浓度为0.1～0.2mol/l的NaCl溶液洗柱；第4步 收集第3步形成的洗涤液4ml；第5步 向第4步收集的溶液中加入360μl的，浓度为1mol/l的NaHCO3溶液；第6步 向第5步制备的溶液中加入266μg的PEI后，置于温度为37℃的黑暗环境，反应时间为2小时；第7步 将第6步的反应液装入透析袋中，对浓度和pH值分别为5m mol/l和6.8的磷酸缓冲液透析，透析时间为12小时；第8步 收集第7步的经透析的反应液，保藏在温度为4℃的环境，备用；第9步 取经提取纯化的质粒PNC DNA 1μg，溶于20μl的，浓度和pH值分别为5m mol/l和6.8的磷酸缓冲液中；第10步 将第9步制备的溶液置于温度为100℃的沸水中，时间为3分钟，再把溶液置于冰中，时间为3分钟，重复上述操作三次；第11步 向第10步形成的溶液中加入20μl的第8步的冷藏溶液；第12步 向第11步的混和溶液中加入6μl的，浓度为5％的戊二醛溶液，再在温度为37℃的环境下孵育10分钟；
第13步 将第12步的反应液代替第2步的反应液，重复第3、4步，即得抗体-DNA探针或蛋白A-DNA探针。
与
背景技术：
相比，本发明具有下列优点1.用本发明涉及的方法构建的抗体/蛋白A-DNA探针，其抗体/蛋白A与DNA之间是共价结合，探针的稳定性好。
2.本发明采用抗体/蛋白A直接结合到DNA分子上的构建方法，省去了采用连结分子和其他中间步骤的麻烦，增加了免疫-PCR反应的灵敏度和准确性，减少了非特异性扩增。
3.本发明采用的试剂均为普通化学试剂，来源方便、经济，易于推广应用。
4.本发明涉及的构建探针的方法具有通用性，可用于各种不同类型抗体-DNA探针的构建。
因此，本发明涉及的方法特别适于用来简便而直接地构建检测临床医学、法医学、兽医学、农学以及分子生物学等领域的基础和应用研究中经常涉及到的微量或超微量抗原抗体的抗体/蛋白A-DNA探针。
权利要求
1.本发明涉及一种抗体/蛋白A-DNA探针的构建方法，抗体指一抗和二抗，其特征在于，该方法包括三个必需的步骤将抗体或蛋白A与对苯醌(PBQ)反应，加入聚乙烯亚胺(PEI)，加入交联剂戊二醛，该方法的全部步骤罗列如下第1步 取0.01～10mg的抗体或蛋白A，溶于440μl的，浓度和pH值分别为90mmol/l和6.0的磷酸缓冲液中，以抗体为原料，最终构建成的探针是抗体-DNA探针，以蛋白A为原料，最终构建成的探针是通用型蛋白A-DNA探针；第2步 向第1步制备的溶液中加入120μl的PBQ溶液，再把混和溶液置于温度为37℃的黑暗环境，反应时间为1小时；第3步 将第2步的反应液上Sephadex G 100柱，并用浓度为0.1～0.2mol/l的NaCl溶液洗柱；第4步 收集第3步形成的洗涤液4ml；第5步 向第4步收集的溶液中加入360μl的，浓度为1mol/l的NaHCO3溶液；第6步 向第5步制备的溶液中加入266μg的PEI后，置于温度为37℃的黑暗环境，反应时间为2小时；第7步 将第6步的反应液装入透析袋中，对浓度和pH值分别为5m mol/l和6.8的磷酸缓冲液透析，透析时间为12小时；第8步 收集第7步的经透析的反应液，保藏在温度为4℃的环境，备用；第9步 取经提取纯化的质粒PNC DNA 1μg，溶于20μl的，浓度和pH值分别为5m mol/l和6.8的磷酸缓冲液中；第10步 将第9步制备的溶液置于温度为100℃的沸水中，时间为3分钟，再把溶液置于冰中，时间为3分钟，重复上述操作三次；第11步 向第10步形成的溶液中加入20μl的第8步的冷藏溶液；第12步 向第11步的混和溶液中加入6μl的，浓度为5％的戊二醛溶液，再在温度为37℃的环境下孵育10分钟；第13步 将第12步的反应液代替第2步的反应液，重复第3、4步，即得抗体-DNA探针或蛋白A-DNA探针。
全文摘要
本发明涉及一种抗体/蛋白A-DNA探针的构建方法，抗体指一抗和二抗，属生物工程技术领域，包括三个必需的步骤将抗体或蛋白与对苯醌(PBQ)反应，加入聚乙烯亚胺(PEI)，加入交联剂戊二醛，有构建的探针稳定性好，没有采用连结分子和其他中间步骤的麻烦，免疫-PCR反应灵敏度和准确性高，非特异性扩增少，采用普通化学试剂，通用性强等优点，适于用来构建各种不同类型的抗体/蛋白A-DNA探针。
文档编号C12N15/09GK1132250SQ95111578
公开日1996年10月2日 申请日期1995年3月29日 优先权日1995年3月29日
发明者吴自荣, 李建林, 潘杏龙 申请人:华东师范大学