枯草芽孢杆菌在降解烟草制品中蛋白质方面的应用的制作方法

本发明属于烟草制备技术领域，具体一种枯草芽孢杆菌xp菌株在降解烟草制品中蛋白质方面的应用。

背景技术：

枯草芽孢杆菌是芽胞杆菌属的一种，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。其菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚，在遗传学研究中应用广泛。此外，枯草芽孢杆菌菌体自身可合成α-淀粉酶、中性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在降解复杂大分子化合物方面具有良好的应用前景，因此近年来枯草芽孢杆菌逐渐成为被关注和研究的热点。

烟叶发酵又称为烟叶醇化，其实质是在一定温度和湿度条件下，促使烟叶理化特性发生深刻变化的过程，即将不利于烟叶品质的大分子物质组分（包括蛋白质、淀粉、果胶等）降解转化成有利于提升烟叶品质的小分子组分（还原糖、氨基酸等），进而达到克服新烟不良品质，改良和提高烟叶内在质量与外观质量的目的。

烟叶醇化是卷烟工业提高产品质量的一种初加工方法，也是卷烟加工中极为重要的一个环节。烟草醇化或者发酵方法一般分为人工醇化和自然醇化两种。人工醇化速度快，周期短，但醇化效果差；自然醇化是将烟叶按一定要求堆放在储备仓库内，在自然条件下进行的醇化，时间一般为1~3年。自然醇化虽然效果较好，但也存在一些不足，如：1）醇化过程中，烟叶容易滋生虫害；2）由于温度、湿度的变化，烟叶容易产生霉变；3）醇化周期较长，易造成库存烟叶的积压与大量资金的占用。

蛋白质是烟叶中的重要化学成分，其含量的高低与烟草品质密切相关。蛋白质含量过高对于烟草制品的抽吸品质是不利的，在燃吸时会产生如同燃烧羽毛的臭味，同时还会产生辛辣、苦涩的感觉，严重制约烟叶整体品质的提高。在烟叶醇化过程中，烟叶中的蛋白质在蛋白酶的催化下降解为短肽，游离氨基酸等，而氨基酸可与还原糖等发生持续的非酶棕色化反应（即美拉德反应），生成多种致香物质以及致香前体物质，从而改善烟叶香气和吸味品质。

由于国内烤烟蛋白质含量普遍偏高，加上烟草品质需求的快速提升，因而纯粹依赖自然醇化过程中烟叶自身酶类的水解作用远不能满足卷烟工业对于高品质烟叶原料的需求。已有研究表明，通过特定微生物制剂或者酶制剂应用，可一定程度改进现有的烟叶醇化技术，加速降解烟叶中的蛋白质等大分子物质，从而加快烟叶醇化进程，缩短烟叶醇化周期，对卷烟企业提高卷烟品质、节约生产成本、提高经济效益具有广泛而现实的意义。但是由于现有研究仍然较为有限，技术效果也存在一定差异，因而开发新的能够降低烟草制品中蛋白质含量的微生物制剂仍然具有十分重要的应用意义。

技术实现要素：

通过特定的枯草芽孢杆菌xp菌株的选择，本发明目的在于提供枯草芽孢杆菌xp菌株在降解烟草制品中蛋白质方面的新应用，从而获得较为稳定降低烟草中蛋白质含量的技术效果，进而加快烟叶的醇化进程，缩短醇化周期。

本申请所采取的技术方案详述如下。

枯草芽孢杆菌在降解烟草制品中蛋白质方面的应用，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌xp菌株，其分类命名为Bacillus subtilis. xp，该菌株现保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏地址为：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16 号（武汉大学），保藏日期为：2011 年12 月9 日，保藏编号为CCTCC No ：M 2011452。

所述枯草芽孢杆菌在降解烟草制品中蛋白质方面的应用，其用于降解烟草制品中蛋白质时，首先制备成菌剂，然后以烟草制品0.5~1.0%的质量比例（优选0.7%）均匀喷洒于烟草制品表面，最后在28~30℃、55~65%湿度条件下，贮藏醇化30~40d；

所述菌剂，具体为采用LB液体培养基制备的OD₆₀₀=1.0~5.0的悬浮培养液；

所述烟草制品，具体可为新鲜采摘的或经烘烤、晾晒、发酵后的不同品种、不同产地的全株烟草或部分组织器官，更进一步而言，具体例如为烤烟叶片。

总体而言，本发明通过特定枯草芽孢杆菌菌株的选择，在将其扩增制备成菌剂后，应用于烟草制品时，可有效降低烟草制品中蛋白质含量，提高其评吸效果，提升烟草等级，在确保醇化效果同时进而加快烟叶醇化进程。由于本发明可在短时间内，以较低成本和较高效率较好改善烟草的吸食品质，加上其操作流程较为简便，因而使得本申请在卷烟制备领域表现出较好的应用价值和应用前景。

附图说明

图1为本发明菌液制剂喷洒后作用时间对烟叶醇化中蛋白质降解率的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分实验背景情况简要介绍如下。

实验材料：

供试烟叶：2015年河南许昌C3F，由河南中烟工业有限责任公司提供；

下述实施例中所采用的枯草芽孢杆菌xp菌株，其分类命名为Bacillus subtilis. xp，该菌株现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No ：M 2011452；由于该菌株为申请人自行筛选获得，且已在其他专利中有所公开，因而属于可公开获得的微生物资源，本申请属于该菌株的新用途专利申请；

实验试剂：

LB液体培养基，常规配制并灭菌（121℃保温15 min）即可，具体配方为：每1000 mL 去离子水中含有：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCL 10 g，用NaOH 溶液调pH=7.0；

主要实验设备：

UV-2550紫外分光光度计，为Shimadzu公司产品。

实施例

为将枯草芽孢杆菌xp菌株用于降解烟草制品中蛋白质，首先需将该菌株进行适当扩增培养，制备成含有一定数量的活性菌剂才能加以应用，菌剂的具体制备方法如下所述。

（1）菌种活化，利用接种环挑取斜面培养基（配方同LB液体培养基，仅另外添加15g/L琼脂粉）上菌种，置于LB液体培养基中悬浮培养，30℃培养12h进行菌种活化；

（2）菌种扩增，将步骤（1）中菌种活化后菌液转接至LB液体培养液中，35℃摇床培养至OD₆₀₀=3.5左右，悬浮均匀后即可作为降解烟草制品用菌剂。

将上述菌剂具体用于降解烟草制品中蛋白质时，按烟草制品0.7%的质量比例均匀喷洒与烟草制品表面，然后在30℃、55~65%湿度条件下贮藏醇化30~40d左右即可。

为确定具体降解蛋白质效果，具体以片状（3cm×3cm）烟叶（去除烟梗的烟叶）作为烟草制品进行了醇化处理，同时设置空白对照组（CK）（按烟草0.7%的质量比例喷施蒸馏水，与处理组一起进行醇化处理），每组处理烟叶质量均为200 g，喷施后贮藏60 d，定期（每5 d）取样，对烟叶中蛋白质降解率进行测定并进行感官质量评价。

蛋白质降解率测定

按照《YC/T 249-2008 烟草及烟草制品 蛋白质的测定 连续流动法》中的要求，在处理的不同时间段分别取处理组和空白对照组适量烟叶样品，对其蛋白质含量进行测定，与样品贮藏处理前蛋白质含量进行比对，计算不同贮藏处理时间时的蛋白质降解率。

测定结果如图1所示。

从图1可以看出，随着处理时间增加，空白对照组中烟叶样品的蛋白质含量并无明显变化；而经菌剂处理后，处理组中烟叶样品的蛋白质含量发生明显变化，并且随着处理时间延长，蛋白质降解率持续增高，当贮藏醇化处理30天时，烟叶中蛋白质降解率可达最高值25%。

在不同贮藏醇化时间段内，取适量烟叶切丝，常规制备卷烟样品，恒温恒湿平衡后，由专业评委对烟支的香气质（A）、香气量（B）、浓度（C）、柔细度（D）、余味（E）、杂气（F）、刺激性（G）等指标进行评定，每项指标均按9分制打分，感官评吸总分（T）=（A+B）× 2.3 + C × 1.5 + D + E + F + G。

具体评价结果如下表1所示。

表1 处理后烟叶感官质量变化：

注：T（感官总分）=（A＋B）×2.3＋C×1.5＋D＋E＋F＋G；CK为喷洒等量蒸馏水贮藏0天的对照烟叶（需要说明的是，贮藏60天后的评吸结果与此数据大致相同，故此省略）。

对上表数据分析可以看出，与样品初始状态相比，经菌剂处理后，随着贮藏醇化时间延长，烟草制品的感官质量可以得到持续性的改善。但结合改善效果的提升率、前述蛋白质降解率测定结果及时间效益而言，经菌剂处理后，贮藏醇化30天时是较为适宜。