专利名称：作为佐剂的聚氧乙烯脱水山梨醇酯和辛苯昔醇组合及其在疫苗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型佐剂系统，所述佐剂系统包含与辛苯昔醇结合的聚氧乙烯脱水山梨醇酯表面活性剂。本发明提供所述新型佐剂、包含所述佐剂的疫苗以及其生产方法和将其配制到疫苗中的方法。也提供了本发明佐剂或疫苗在疾病预防或治疗方面的应用。所述佐剂尤其可用作粘膜佐剂，但也是系统有效的。所述佐剂尤其可用于流感疫苗。
除避开对痛苦的注射的需要和相关的因“针头恐惧”所致的对患者顺从的不利影响外，由于已经表明在动物中经粘膜给予抗原在于粘膜表面诱导保护性应答方面的效率更大，而粘膜是许多病原体进入的途径，因此粘膜接种是吸引人的。另外，已经提出，粘膜接种，例如鼻内接种，可以不仅在鼻粘膜中诱导粘膜免疫，而且在远端粘膜部位例如生殖器粘膜中也诱导粘膜免疫(Mestecky，1987，Joumal of ClinicalImmunology，7，265-276；McGhee和Kiyono，Infectious Agents andDisease，1993，2，55-73)。尽管在本领域中有许多研究，但适用于人类的安全而有效的佐剂仍有待鉴定。本发明提供对该问题的一种解决方法。
某些非离子表面活性剂的医药应用已有描述。例如，已经描述了鼻内给予聚氧乙烯脱水山梨醇酯、聚氧乙烯醚、胆汁盐和其它渗透增强剂以增强鼻腔中胰岛素的吸收(Hirai等1981，International Journal ofPharmaceutics，9，165-172；Hirai等1981，International Journal ofPharmaceutics，9，173-184)。
已经利用了其它非离子表面活性剂制剂。例如，包含或者聚氧乙烯蓖麻油或辛酸/癸酸甘油酯与聚氧乙烯脱水山梨醇一酯和抗原的混合物的疫苗制剂，能够在局部给予粘膜后诱导系统免疫应答(WO94/17827)。本专利申请公开了，非离子表面活性剂TWEEN20TM(聚氧乙烯脱水山梨醇一酯)和Imwitor742TM(辛酸/癸酸甘油酯)的组合或TWEEN20TM和聚氧乙烯蓖麻油的组合能够在鼻内免疫后，增强系统免疫应答。在文献中也已经描述了这种制剂对于增强针对鼻内所给予抗原的免疫应答之影响的细节(Gizurarson等1996.Vaccine Research，5，69-75；Aggerbeck等1997，Vaccine，15，307-316；Tebbey等，ViralImmunol 1999；12(1)41-5)。在WO94/17827所示的实施例(尤其是实施例4)中，增强所述免疫应答所需的TWEEN20TM浓度非常高(36％)，而甚至在有辛酸/癸酸甘油酯的情况下，在28％的浓度下也没有发生免疫应答的增强作用。
也已经以这样一种方式配制了非离子表面活性剂，以致形成非离子表面活性剂泡(通常称为NISV；US5,679,355)。这种非离子表面活性剂的制剂通常在胆固醇存在时的形成脂质双层囊泡，所述囊泡将抗原捕获在内部水相中或双层本身中。
WO96/36352和US5,653,987描述了一种液体药剂，所述药剂包含至少两种吸收增强剂和水，主要用于胰岛素的口服传递，其中每种吸收增强剂的存在量为所述总制剂的1-10％w/w的浓度。
通常将表面活性剂用于供系统给药的油乳化佐剂的配制中，起稳定油微滴的作用。例如，聚氧乙烯脱水山梨醇酯(TWEENTM)和脱水山梨醇脂肪酸酯(SPANTM)用来稳定水包油乳液(EP0399843，WO95/17210)。
过去，已经利用Triton X-100或Tween和乙醚的混合物来将流感病毒断裂，制备了流感病毒疫苗。对这两种断裂物(split)系统免疫原性的临床比较表明它们是相当的(Gross等1981.J.Clin Microbiol 14，534-8)。也研究了其它表面活性剂对所得片段疫苗免疫原性的影响。在胃肠外给药的比较研究中，Mukhlis等(1984 Vaccine 2，199-203)指出，全病毒比去垢剂断裂的病毒更具免疫原性，但在不同的去垢剂Triton X-100和溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)之间产生了勉强比去垢剂empigen强的免疫原性断裂物。
本申请人在此介绍一个令人惊讶的发现，即聚氧乙烯脱水山梨醇酯与辛苯昔醇联合作为一种有效的疫苗佐剂。有利的是，这种组合物可以系统给予，但经粘膜给予时足以诱导系统免疫应答。通过粘膜给予本发明疫苗诱导的免疫应答可以与在系统注射传统疫苗后观察到的免疫应答至少一样强或至少与其相当。
本发明提供了安全而有效的佐剂，它们易于生产，可以或者通过粘膜途径或者通过系统途径给予。
在第一个方面，本发明提供包含聚氧乙烯脱水山梨醇酯和辛苯昔醇的佐剂。
另一方面，本发明提供包含按照本发明的佐剂与抗原的疫苗。
特别优选包含按照本发明的佐剂与流感病毒抗原、用于给予粘膜表面、特别是给予鼻粘膜的疫苗组合物。然而，有多种可供选择的给药途径和供按照本发明的疫苗用的其它可能的抗原，在下文中将描述这些抗原。
辛苯昔醇和聚氧乙烯脱水山梨醇酯在“Surfactant systems”编著Attwood和Florence(1983，Chapman and Hall)中有描述。在Merck IndexEntry 6858(第1162页，第12版，Merck & Co.Inc.，Whitehouse Station，N.J.，USA；ISBN 0911910-12-3)中也描述了辛苯昔醇系列，包括叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100TM)。在Merck Index Entry 7742(第1308页，第12版，Merck & Co.Inc.，Whitehouse Station，N.J.，USA；ISBN0911910-12-3)中描述了聚氧乙烯脱水山梨醇酯，包括聚氧乙烯脱水山梨醇一油酸酯(TWEEN80TM)。这两者都可以用其中描述的方法生产，或者从商业来源例如Sigma Inc购买。
供按照本发明的佐剂用的优选辛苯昔醇包括来自Triton系列的其它非离子表面活性剂，例如Triton X-45、、Triton X-102、Triton X-114、Triton X-165、Triton X-205、Triton X-305、Triton N-57、Triton N-101和Triton N-128，但特别优选叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)。
本发明的佐剂包含一种聚氧乙烯脱水山梨醇酯和一种辛苯昔醇。所述辛苯昔醇最好是叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON-X-100TM)。所述聚氧乙烯脱水山梨醇酯最好是聚氧乙烯脱水山梨醇一油酸酯(TWEEN80TM)。
按照本发明的佐剂还可以有利地包含一种胆汁盐或胆酸衍生物。
因此，所述佐剂可以包含一种聚氧乙烯脱水山梨醇酯例如聚氧乙烯脱水山梨醇一油酸酯(Tween 80)、一种辛苯昔醇例如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)和一种胆汁盐或胆酸衍生物例如脱氧胆酸钠或牛磺脱氧胆酸钠。在一个优选实施方案中，本发明提供一种包含聚氧乙烯脱水山梨醇一油酸酯(Tween 80)、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)和脱氧胆酸钠的佐剂制剂。
最好是，所述佐剂制剂中存在的非离子表面活性剂总浓度低于40％，更优选至多约20％。优选的范围是在约0.001-20％之间，更优选0.01-10％，最优选至多约2％(w/v)。
所述各种非离子表面活性剂在最终疫苗组合物中的优选浓度如下辛基或壬基苯氧基聚乙氧基乙醇例如Triton X-100或Triton系列中的其它去垢剂0.001％-20％，优选0.001-10％，更优选0.001-1％，最优选0.005-0.1％(w/v)；聚氧乙烯脱水山梨醇酯例如Tween 800.01-1％，最优选约0.0％(w/v)。
所述非离子表面活性剂浓度的特别优选的范围是Tween 80TM0.01-1％，最优选约0.1％(v/v)；Triton X-100TM0.001-0.1％，最优选0.005-0.02％(w/v)。
本发明的一个方面是包含与辛苯昔醇结合的聚氧乙烯脱水山梨醇酯表面活性剂的疫苗制剂，其中疫苗中存在的抗原未被捕获在非离子表面活性剂的泡中。
供按照本发明的疫苗用的流感病毒抗原可以是适合于引起免疫应答的任何形式的流感病毒抗原，包括活的或失活的全病毒、断裂病毒或者由全病毒制备的或通过重组方法制备的亚单位抗原。用于生产抗原的流感病毒可以以常规方法在含胚卵中培养，或所述病毒可以在组织培养物中培养。用于流感病毒组织培养的合适的细胞基质包括例如犬肾细胞，例如MDCK细胞、来自MDCK一个克隆的细胞或MDCK样细胞；猴肾细胞，例如AGMK细胞，包括Vero细胞；或适合于生产疫苗用流感病毒的任何其它细胞类型。合适的细胞基质也包括人细胞，例如MRC-5细胞。合适的细胞基质不限于细胞系，例如也包括原代细胞，例如鸡胚成纤维细胞。
优选包含已经历一系列纯化步骤的断裂病毒(split virus)的流感病毒抗原制剂。因此，所述抗原制剂可以采用多种不同的商业上适用的方法生产，例如在DD 300 833号和DD 211 444号专利中描述的断裂流感病毒法，所述专利通过引用结合到本文中。市售的断裂流感疫苗包括由SmithKline Beecham出售的FluarixTM。
因此，优选的按照本发明的疫苗制剂包含卵或组织培养物来源的流感抗原(优选断裂流感病毒抗原)与聚氧乙烯脱水山梨醇酯和辛苯昔醇，任选地还包含一种胆汁盐或胆酸衍生物。最优选这种制剂包含断裂流感病毒抗原、聚氧乙烯脱水山梨醇一油酸酯(Tween 80)、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)和脱氧胆酸钠。
按照本发明的流感疫苗最好是包含两种或更多种流感病毒株的多价流感疫苗。最优选的是包含三种病毒株的三价疫苗。传统的流感疫苗包含三种流感病毒株-两种A型病毒株和一种B型病毒株。然而，本发明不排除可以用于例如大流行情况下的单价疫苗。大流行流感的单价疫苗最多半含有来自单一A型病毒株的流感抗原。
本发明的疫苗制剂最好用来借助于经粘膜途径给予所述疫苗来保护或治疗易感疾病或患病的哺乳动物，所述粘膜途径例如口服/口腔含化/肠/阴道/直肠或鼻途径。这种给予可以微滴、喷雾或干粉形式给予。喷雾或气雾型疫苗制剂也构成本发明的一部分。肠溶制剂例如用于口服的抗胃液胶囊和颗粒剂、用于直肠或阴道给药的栓剂也构成本发明的一部分。本发明也可以用来增强用于皮肤(透皮传递或经皮传递)的抗原的免疫原性。另外，本发明的佐剂可以胃肠外传递，例如肌内注射或皮下注射。当供鼻内疫苗用时，就性质而言，本发明的疫苗最好是溶血性的。
根据给药途径，可以使用各种各样的给药装置。例如，对于优选的鼻内给药途径，可以使用喷雾装置，例如市售的AccusprayTM(BectonDickinson)。
鼻内应用的优选喷雾装置是所述装置的性能不依赖于使用者施加的压力的装置。这些装置被称为压力阈装置(pressure thresholddevice)。仅在达到阈值压力时才从喷嘴释放出液体。这些装置使得更易于达到微滴大小均匀的一致的喷雾。适用于本发明的压力阈装置是本领域已知的，例如描述于WO91/13281、EP311863B和EP516636B中，所述文献通过引用结合到本文中。这类装置在商业上可得自Pfeiffer GmbH。
优选的鼻内装置产生范围为1-200μm、优选10-120μm的微滴(用水作为液体测量)。低于10μm，则有吸入的危险，因此，最好是低于10μm的微滴不超过约5％。大于120μm的微滴的传播不如较小微滴，因此最好是超过120μm的微滴不超过约5％。
双剂量传递是供按照本发明疫苗使用的鼻内传递装置的再一优选特征。双剂量装置含有一个疫苗剂量的两个分剂量，向每个鼻孔给予一个分剂量。一般所述两个分剂量在一个小室内，所述装置的构造允许每次有效地传递一个分剂量。
在再一方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的一种鼻内给药装置，所述装置含有一种按照本发明的疫苗制剂。在本发明该方面的一个优选实施方案中，所述鼻内给药装置装有流感疫苗。
对于某些疫苗制剂，可以在所述制剂中包括其它疫苗组分。因此，本发明的佐剂制剂也可以包含胆汁酸或其衍生物，尤其是盐形式。这些包括胆酸衍生物及其盐，特别是胆酸的钠盐或胆酸衍生物。胆汁酸及其衍生物的实例包括胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、石胆酸、熊去氧胆酸、猪脱氧胆酸和衍生物，例如上述胆汁酸的甘氨-、牛磺、氨基丙基(amidopropyl)-1-丙磺酸、氨基丙基-2-羟基-1-丙磺酸衍生物或N，N-双(3D葡糖酰胺丙基)脱氧胆酰胺(deoxycholamide)。一个特别优选的实例是脱氧胆酸钠(NaDOC)，它可以存在于最终的疫苗制剂中。
最好是，当制剂为水溶液形式或非囊泡形式的悬浮液时，本发明的佐剂制剂是有利的。这种制剂易于可重复地生产，也易于灭菌(通过450或220nm孔膜终末过滤)以及易于以喷雾形式给予鼻粘膜，而所述佐剂的复杂物理结构不会被降解。
在本发明的又一方面，提供一种制备疫苗的方法，所述方法包括将按照本发明的佐剂与抗原混合。
在再一方面，提供一种诱导或增强受治疗者体内免疫应答的方法，所述方法包括将所述抗原和按照本发明的佐剂混合，并且将所述混合物给予所述受治疗者。
给予所述受治疗者的途径优选是通过粘膜表面，更优选通过鼻粘膜。当所述疫苗通过鼻粘膜给予时，所述疫苗最好作为喷雾剂给予。在诱导或增强免疫应答的一个优选方法中，通过经鼻给予所述疫苗，诱导系统应答。因此，按照本发明的粘膜疫苗最好是当通过粘膜途径给予时，能够诱导系统免疫应答。
本发明还提供聚氧乙烯脱水山梨醇酯和辛苯昔醇在佐剂制剂、特别是在用于患者粘膜的佐剂制剂生产方面的应用。本发明也涉及聚氧乙烯脱水山梨醇酯、辛苯昔醇和抗原在疫苗制剂、尤其是用于粘膜的疫苗制剂生产中的应用。所述抗原最好是流感病毒抗原。
特别优选给予鼻粘膜的佐剂和疫苗。
最好是，按照本发明的疫苗的给予包括给予所述疫苗的一剂诱发疫苗或一剂加强疫苗，例如包含一种流感抗原制剂的流感疫苗的一剂诱发疫苗或一剂加强疫苗。
可以预见，本发明的组合物将可用来配制含有来源于各种各样来源的抗原的疫苗。例如，抗原可以包括人、细菌或病毒的核酸、来源于病原体的抗原或抗原性制剂、肿瘤来源的抗原或抗原性制剂、宿主来源的抗原包括GnRH和IgE肽、重组产生的蛋白质或肽以及嵌合融合蛋白。
本发明的疫苗制剂最好含有能够引发针对人类病原体的免疫应答的抗原或抗原性组合物，所述抗原或抗原性组合物来源于HIV-1(例如tat、nef、gp120或gp160)；人疱疹病毒，例如gD或其衍生物、或立即早期蛋白质例如得自HSV1或HSV2的ICP27；巨细胞病毒((尤其是人病毒)(例如gB或其衍生物)；轮状病毒属(Rotavirus)(包括减毒活病毒)；EB病毒(例如gp350或其衍生物)；水痘-带状疱疹病毒(例如gpI、II和IE63)；或肝炎病毒，例如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎表面抗原或其衍生物)、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒；或者所述抗原或抗原性组合物来源于其它病毒病原体，例如副粘病毒呼吸道合胞病毒(例如F蛋白和G蛋白或其衍生物)、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒(例如HPV6、11、16、18、...)、黄病毒(例如黄热病毒、登革病毒、蜱传脑膜炎病毒、日本脑膜炎病毒)或流感病毒(全活病毒或灭活病毒、断裂流感病毒，在卵或MDCK细胞、或Vero细胞或全流感病毒体中培养的(如R.G1uck，Vaccine，1992，10，915-920中所述)；或其纯化的蛋白质或重组蛋白质，例如HA、NP、NA或M蛋白、或其组合)；或者所述抗原性组合物来源于细菌病原体，例如奈瑟氏球菌(Neisseria spp.)，包括淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhea)和脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)(例如夹膜多糖及其缀合物、运铁蛋白结合蛋白、乳铁蛋白结合蛋白、PilC、粘附素)；化脓链球菌(S.pyogenes)(例如M蛋白或其片段、C5A蛋白酶、脂磷壁酸质)、无乳链球菌(S.agalactiae)、变异链球菌(S.mutans)；杜氏嗜血菌(H.ducreyi)；莫拉氏菌(Moraxella spp.)，包括粘膜炎莫拉氏菌(M.cararrhalis)，也称为粘膜炎布兰汉氏菌(Branhamella catarrhalis)(例如高分子量和低分子量粘附素和侵染素)；博德特氏菌(Bordetella spp.)，包括百日咳博德特氏菌(B.pertussis)(例如pertactin、百日咳毒素或其衍生物、丝状血凝素、腺苷酸环化酶、伞毛)、副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)和支气管败血性博德特氏菌(B.bronchiseptica)；分枝杆菌(Mycobacerium spp.)，包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(例如ESAT6、抗原85A、85B或85C)、牛分枝杆菌(M.bovis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、乌分枝杆菌(N.avium)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)；军团菌(Legionellaspp.)，包括嗜肺军团菌(L.pneumophila)；埃希氏菌(Escherichia spp.)，包括肠毒性大肠杆菌(例如定居因子、热不稳定毒素或其衍生物、热稳定毒性或其衍生物)、肠出血性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌(例如志贺菌毒素样毒素或其衍生物)；弧菌(Vibrio spp.)，包括霍乱弧菌(V.cholera)(例如霍乱毒素或其衍生物)；志贺氏菌(Shigella spp.)，包括索氏志贺氏菌(S.sonnei)、痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)、弗氏志贺氏菌(S.flexnerii)；耶尔森氏菌(Yersinia spp.)，包括小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)(例如Ypo蛋白)、鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、假结核耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)；弯曲杆菌(Campylobacter spp)，包括空肠弯曲杆菌(C.jejuni)(例如毒素、粘附素和侵染素)和大肠弯曲杆菌(C.coli)；沙门氏菌(Salmonella spp.)，包括伤寒沙门氏菌(S.typhi)、副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi)、猪霍乱沙门氏菌(S.choleaesuis)、肠炎沙门氏菌(S.entertidis)；李斯特氏菌(Listeria spp.)，包括单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)；螺杆菌(Helicobacter spp)，包括幽门螺杆菌(H.pylori)(例如脲酶、过氧化氢酶、空泡毒素(vacuolating toxin))；假单胞菌(Pseudomonas spp.)，包括铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；链球菌(Staphylococcus spp.)，金黄色链球菌(S.aureus)、表皮链球菌(S.epidermidis)；肠球菌(Enterococcus spp.)，包括粪肠球菌(E.faecalis)、屎肠球菌(E.faecium)；梭菌(Clostridium spp.)，包括破伤风梭菌(C.tetani)(例如破伤风毒素及其衍生物)、肉毒梭菌(C.botulinum)(例如肉毒杆菌毒素及其衍生物)、艰难梭菌(C.difficile)(例如梭菌毒素A或B及其衍生物)；芽孢杆菌(Baccillus spp.)，包括炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)(例如肉毒杆菌毒素及其衍生物)；棒杆菌(Corynebacterium spp.)，包括白喉棒杆菌(C.diphtheriae)(例如白喉毒素及其衍生物)；疏螺旋体(Borrelia spp.)，包括布氏疏螺旋体(B.burgdorferri)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、格氏疏螺旋体(B.garinii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、阿氏疏螺旋体(B.afzelii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B.andersonii(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、赫氏疏螺旋体(B.hermsii)；埃里希氏体(Ehrlichia spp.)，包括马埃里希氏体(R.equi)和人粒细胞性埃利希病的病原体；立克次氏体(Rickettsia spp.)，包括立氏立克次氏体(R.rickettsii)；衣原体(Chlamydia spp.)，包括砂眼衣原体(C.trachomatis)(例如MOMP、肝素结合蛋白)、肺炎衣原体(C.pneumoniae)(例如MOMP、肝素结合蛋白)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)；钩端螺旋体(Leptospira spp.)，包括问号钩端螺旋体(L.interrogans)；密螺旋体(Treponema spp.)，包括苍白密螺旋体(T.pallidum)(例如稀有外膜蛋白)、齿垢密螺旋体(T.hyodusenteriae)、猪痢疾密螺旋体(T.hyodysenteriae)；或者所述抗原或抗原性组合物来源于寄生虫，例如疟原虫(Plasmodium spp.)，包括恶性疟原虫(P.falciparum)；弓形虫(Toxoplasma spp.)，包括鼠弓形虫(T.gondii)(例如SAG2、SAG3、Tg34)；内阿米巴(Entamoeba spp.)，包括溶组织内阿米巴(E.histolytica)；巴贝虫(Babesia spp.)，包括田鼠巴贝虫(B.microti)；锥虫(Trypanosomaspp.)，包括克鲁斯氏锥虫(T.cruzi)；贾第鞭毛虫(Giardia spp.)，包括兰氏贾第鞭毛虫(G.lamblia)；Leshmania spp.，包括L.major；肺囊虫(Pneumocystis spp.)，包括卡氏肺囊虫(P.carinii)；毛滴虫(Trichomonasspp.)，包括阴道毛滴虫(T.vaginalis)；血吸虫(Schisostoma spp.)，包括曼氏血吸虫(S.mensoni)；或者所述抗原或抗原组合物来源于酵母，例如念珠菌(Candida spp.)，包括白色念珠菌(C.albicans)；隐球菌(Cryptococcus spp.)，包括新型隐球菌(C.neoformans)。
优选的细菌疫苗包含来源于链球菌(Streptococcus spp.)包括肺炎链球菌(S.pneumoniae)(例如夹膜多糖及其缀合物、PsaA、PspA、链球菌溶血素、胆碱结合蛋白)的抗原以及蛋白抗原肺炎链球菌溶血素(Biochem Biophys Acta，1989，67，1007；Rubins等，MicrobialPathogenesis，25，337-342)及其突变型去毒衍生物(WO90/06951；WO99/03884)。其它优选的细菌疫苗包含来源于嗜血菌(Haemophilus spp.)包括B型流感嗜血菌(H.influenzae type B)(例如PRP及其缀合物)、不可定型的流感嗜血菌(non typeable H.influenzae)的抗原例如OMP26、高分子量粘附素、P5、P6、蛋白D和脂蛋白D以及丝束蛋白和丝束蛋白衍生肽(US5,843,464)或其多拷贝变异体(varient)或融合蛋白。其它优选的细菌疫苗包含来源于粘膜炎莫拉氏菌的抗原(包括其外膜小泡(outmembrane vesicle)和OMP106(WO97/41731))和来源于脑膜炎奈瑟氏球菌B的抗原(包括其外膜小泡)和NspA(WO96/29412)。
乙型肝炎表面抗原的衍生物是本领域众所周知的，尤其包括在欧洲专利申请EP-A-414374、EP-A-0304578和EP198-474中描述阐明的那些PreS1、PreS2 S抗原。在一个优选方面，本发明的疫苗制剂包含HIV-1抗原、gp120，尤其是当在CHO细胞中表达时。在再一实施方案中，本发明的疫苗制剂包含以上限定的gD2t。
在本发明的一个具体实施方案中，含有要求保护的佐剂的疫苗包含来源于被认为引起生殖器疣的人乳头瘤病毒(HPV)的抗原(HPV6或HPV11和其它抗原)和引起宫颈癌的HPV病毒(HPV16、HPV18和其它抗原)。
特别优选形式的生殖器疣预防性或治疗性疫苗包含L1粒子或壳粒、以及包含选自HPV6和HPV11的蛋白E6、E7、L1和L2中的一种或多种抗原的融合蛋白。
最优选形式的融合蛋白是WO96/26277中公开的L2E7和GB9717953.5(PCT/EP98/05285)中公开的蛋白D(1/3)-E7。
HPV宫颈感染或宫颈癌的一种优选的预防性或治疗性疫苗组合物，可以包含HPV16或18的抗原。例如，L1或L2抗原单体、或作为病毒样粒子(VLP)一起呈现的L1或L2抗原、或单独在VLP或壳粒结构中呈现的单独的L1。这类抗原、病毒样粒子和壳粒是本来已知的。参见例如WO94/00152、WO94/20137、WO94/05792和WO93/02184。
另外的早期蛋白可以单独包括或以融合蛋白来包括例如最好是E7、E2或E5；尤其优选的实施方案包括含L1E7融合蛋白(WO96/11272)的VLP。
特别优选的HPV16抗原包含与蛋白D载体融合形成蛋白D-E6或E7融合体的HPV16的早起蛋白E6或E7、或其组合；或者E6或E7与L2的组合(WO96/26277)。
或者，HPV16或18早期蛋白E6和E7可以存在于一个分子中，最好是蛋白D-E6/E7融合体。这种疫苗可以任选地含有来自HPV18的E6和E7中的任一种或两种，最好是蛋白D-E6或蛋白D-E7融合蛋白或蛋白D E6/E7融合蛋白的形式。
本发明的疫苗可以另外包含来源于其它HPV毒株、优选来自毒株HPV6、11、31、33或45的抗原。
本发明的疫苗可以包含来源于引起疟疾的寄生虫的抗原。例如，来源于恶性疟原虫的优选抗原包括RTS，S和TRAP。RTS是一种杂种蛋白，包含通过乙型肝炎表面抗原preS2部分的四个氨基酸与乙型肝炎病毒的表面(S)抗原连接的恶性疟原虫环子孢子(CS)蛋白的基本上全部的C末端部分。其完整的结构公开于国际专利申请PCT/EP92/02591号中，该专利申请的公布号为WO93/10152，要求英国专利申请9124390.7号的优先权。当在酵母中表达时，RTS作为脂蛋白粒子产生，而当它与HBV的S抗原共表达时，它产生一种称为RTS，S的混合粒子。TRAP抗原描述于国际专利申请PCT/GB89/00895号中，后者的公布号为WO90/01496。本发明的一个优选实施方案是疟疾疫苗，其中所述抗原性制剂包含RTS，S和TRAP抗原的组合。可能成为多级(multistage)疟疾疫苗组分候选者的其它疟原虫抗原是恶性疟原虫的MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、钳合蛋白、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230和疟原虫属物种中的其类似物。
或者，所述制剂可以含有一种抗肿瘤抗原，并且可用于癌症的免疫治疗性治疗。例如，所述佐剂制剂可和肿瘤排斥抗原一起应用，所述肿瘤排斥抗原例如前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌或黑素瘤的肿瘤排斥抗原。示范性抗原包括用于治疗黑素瘤的MAGE 1和MAGE 3抗原或其它的MAGE抗原、PRAME、BAGE或GAGE(Robbins和Kawakami，1996，Current Opinions in Immunology 8，第628-636页；Van den Eynde等，International Journal of Clinical &Laboratory Research(1997提交)；Correale等(1997)Journal of theNational Cancer Institute 89，第293页)。实际上，这些抗原在各种各样的肿瘤类型中表达，例如在黑素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌中表达。其它肿瘤特异性抗原适于与本发明的佐剂一起使用，所述抗原包括但不限于前列腺特异性抗原(PSA)或Her-2/neu、KSA(GA733)、MUC-1和癌胚抗原(CEA)。因此，在本发明的一个方面，提供一种包含按照本发明的佐剂组合物和一种肿瘤排斥抗原的疫苗。
另外，在许多癌症的治疗中或在immunocastration中，所述抗原可以是自身肽类激素，例如一种短的10个氨基酸长的肽-全长促性腺素释放激素(GnRH，WO95/20600)。
可以预见，本发明的组合物可用于配制含疏螺旋体来源之抗原的疫苗。例如，抗原可以包括核酸、病原体来源的抗原或抗原性制剂、重组产生的蛋白或肽、以及嵌合融合蛋白。特别是，所述抗原是OspA。OspA可以是借助于宿主细胞(大肠杆菌)而呈脂质化(lipidated)状态的称为(Lipo-OspA)的完整的成熟蛋白或非脂质化衍生物。这类非脂质化衍生物包括非脂质化NS1-OspA融合蛋白，它具有流感病毒非结构蛋白(NS1)的N末端的前81个氨基酸和完整的OspA蛋白，而另一种-MDP-OspA是携带3个额外N末端氨基酸的非脂质化形式的OspA。
本发明的疫苗可以用于预防或治疗变态反应。这类疫苗将包含变应原特异性抗原(例如Der p1)和变应原非特异性抗原(例如来源于人IgE的肽，包括但不限于stanworth十肽(EP0477231B1))。
将每剂疫苗中蛋白质的量选定为在典型疫苗中诱导免疫保护性应答而无显著不利副作用的量。根据使用哪种具体的免疫原和将其如何呈递，则这种量将有所不同。一般而言，预期每剂将包含1-1000μg蛋白质、优选1-500μg、优选1-100μg、最优选1-50μg。通过涉及观测受治疗者体内的适当免疫应答的标准研究，可以确定具体疫苗的最适量。在初次接种后，受治疗者可以接受一次或数次适当间隔的加强免疫。
本发明的疫苗也可以通过口服途径给予。在这种情况下，所述药学上可接受的赋形剂也可以包括抗酸缓冲剂或肠溶胶囊或微粒剂。本发明的疫苗也可以通过阴道途径给予。在这种情况下，所述药学上可接受的赋形剂也可以包括乳化剂、聚合物例如CARBOPOL以及其它已知的阴道乳膏和栓剂的稳定剂。本发明的疫苗也可以通过直肠途径给予。在这种情况下，所述赋形剂也可以包括蜡和本领域已知的用于形成直肠栓剂的聚合物。
本发明的制剂既可以用于预防目的，又可以用于治疗目的。因此，本发明提供一种治疗易患或患有传染病或癌症或变态反应或自身免疫病的哺乳动物的方法。在本发明的再一方面，提供本文所述的用于医药的一种佐剂组合和一种疫苗。New Trends and Developments inVaccines，Voller等编著，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978全面地描述了疫苗制剂。
在本发明的一个替代的相关实施方案中，本发明的佐剂还可以与其它佐剂联合，所述其它佐剂包括霍乱毒素及其B亚基、单磷酰基脂质A及其无毒衍生物3-脱氧-酰化单磷酰基脂质A(描述于英国专利GB2,220,211号)、免疫学活性皂苷部分例如来源于南美皂树QuillajaSaponaria Molina之树皮的Quil A及其衍生物(例如QS21，美国专利号5,057,540)和寡核苷酸佐剂系统CpG(描述于WO 96/02555)、尤其是5’TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT3’(SEQ ID NO.1)。
通过下面的实施例说明本发明，但本发明不限于以下的实施例。在以下实施例中，我们使用全蛋培养的、用甲醛灭活的流感病毒或TWEEN-醚破碎的病毒或NaDOC破碎的蛋培养并补充以Triton X-100的病毒。Tween-80和Triton X-100的浓度示于实施例中。实施例1，用来测量血清中抗体(Ab)应答的方法用于测量流感特异性血清Ig Ab的ELISAMaxisorp Nunc免疫平板用50μl/孔在PBS中稀释的1μg/mlβ-丙酸内酯(BPL)灭活的流感病毒的HA(由SSD GmBH厂商供应，Dresden，Germany)于4℃包被过夜。所述平板上的游离位点用饱和缓冲液即含有1％BSA、0.1％聚氧乙烯脱水山梨醇一月桂酸酯(TWEEN 20)的PBS封闭(1小时，37℃)。然后，将按标准曲线加入的参比血清(具有以ELISA单位/ml表示的中点效价的血清，置于A行中)和血清样品(始于1/100的稀释度，置于B-H行中)的2倍连续稀释液于37℃温育1小时30分钟。然后用洗涤缓冲液(PBS，0.1％聚氧乙烯脱水山梨醇一月桂酸酯(TWEEN 20))洗涤(×3)平板。然后，将用饱和缓冲液以1/3000稀释的生物素化的山羊抗人Ig(Amersham)(50μl/孔)于37℃温育1小时30分钟。经3次洗涤和随后加入链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶缀合物(Amersham)后，将平板洗涤5次，并于室温下将平板与50μl/孔的显色缓冲液(OPDA 0.4mg/ml(Sigma)和H2O20.03％，在50mM pH 4.5的柠檬酸缓冲液中)一起保温20分钟。加入50μl/孔2N硫酸而终止显色。用Biorad 3550免疫读出仪于492nm和630nm读出光密度。用SoftMaxPro软件，根据4参数数学方法计算抗体的效价。小鼠中流感特异性血清Ab的血凝抑制(HAI)活性首先用100μl0.5M硼酸盐缓冲液(pH9)和125μl Dade Behring购买的高岭土于室温(RT)下处理血清(25μl)20分钟。离心(30分钟，3000RPM或860g)后，取100μl上清液(相当于血清的1/10稀释液)，并将其与0.5％鸡红细胞一起于4℃孵育1小时。以3200RPM(970g)离心10分钟后，收集上清液。进行这两个操作以消除血清中含有的天然血凝因子。然后，在96孔Greiner板中25μl经处理的血清用25μl PBS稀释(2倍连续稀释，始于1/20)。以4个血凝单位(即引发红细胞凝集的最大稀释度的四分之一的稀释度)BPL灭活的全病毒(25μl/孔)，于室温在搅拌下达30分钟。最后将平板于4℃下保持过夜，然后进行读出。HAI效价相当于抑制病毒诱导的血凝的最低血清稀释度的倒数。实施例2，TWEEN80和Triton在小鼠体内对灭活的完整流感病毒的鼻内免疫原性的影响过去，主要在未经攻击的动物体内进行其它流感疫苗(例如加入佐剂的胃肠外疫苗、基于DNA的疫苗或粘膜传递的疫苗)的临床前评价。一般而言，从这些研究中获得的有前景的结果未在人体中得到证实。这可能是由于这样一个事实与未经攻击的动物不一样，大多数成人在接种之前已经通过天然感染而在免疫学上“接触过抗原”。因此，在动物模型中评价鼻内流感疫苗的最佳方式可能是测试其在经鼻接触过抗原的动物体内加强预先建立的免疫应答的能力。我们在本实施例中评价了TWEEN-80和Triton X-100对这样的应答的影响。
在第0天，通过用移液器(在麻醉下)在每个鼻孔中给予10μl PBS中含有的2.5μg BPL灭活的A/Beijing/262/95流感病毒之HA，在雌性Balb/c小鼠(8周龄)中进行抗原接触。28天后，用20μl溶液(每个鼻孔10μl，用移液器以小滴形式传递)给小鼠(6只动物/组)进行鼻内加强(在麻醉下)，所述溶液是在或者APBS；或者BTWEEN80(0.11％)加Triton X-100(0.074％)中含有5μg BPL灭活A/Beijing/262/95流感病毒之HA的溶液；或者通过C肌内注射1.5μg HA的流感疫苗，进行加强。抗原由SSD GmBH厂商(Dresden，Germany)供应。如实施例1中所述，测量血清中的HAI Ab应答。如
图1所示，当用TWEEN80和Triton配制时，鼻内传递的灭活流感病毒能够与传统胃肠外流感疫苗同样有效地加强预先建立的系统HAI Ab应答。然而，在缺乏TWEEN80和Triton的情况下，鼻内给予的相同的抗原，其免疫原性显著较低。实施例3具有TWEEN80和TRITON X-100的断裂流感病毒鼻内疫苗与经批准的传统胃肠外疫苗(FluarixTM)在健康成年受治疗者体内的免疫原性的比较。用于该项研究的制剂已经评价了蛋来源的断裂流感抗原的两种制剂(A、B)。A是一种鼻内制剂，而B是肌内给予的FluarixTM/α-Rix。所述制剂含有三种由WHO建议的1998/1999季节的病毒株制备的灭活断裂病毒体抗原。
用于鼻内传递的装置是Becton Dickinson的AccusprayTM鼻内注射器。在每个鼻孔内喷100μl A制剂。所述制剂的组成鼻内制剂(A)含有以下灭活断裂病毒体1. 30μg HA A/Beijing/262/95(H1N1)2. 30μg HA A/Sydney/5/97(H3N2)3. 30μg B/Harbin/7/94的HA和磷酸缓冲盐溶液pH 7.4±0.1、Tween 80 0.1％、Triton X-100 0.015％、脱氧胆酸钠0.0045％和低于35μg/ml的硫柳汞。
一剂的体积是200μl(每个鼻孔100μl的分剂量)。
对比物FluarixTM/α-Rix是SmithKline Beecham Biologicals的市售的灭活三价断裂流感疫苗。肌内给予500μl的剂量。
该剂量含有15μg上述三种病毒株的HA、500-1000μg/ml(0.05％-0.1％)的Tween 80、50-170μg/ml(0.005％-0.017％)的Triton X-100、最高100μg/ml的脱氧胆酸钠、100μg/ml硫柳汞和pH 6.8-7.5的磷酸缓冲盐溶液。免疫原性研究一个开放式、有对照和随机的研究，评价用Tween 80和TritonX-100配制的断裂流感鼻内疫苗与传统胃肠外疫苗(即FluarixTM)相比的免疫原性。20位健康的成年受治疗者(年龄为18-40岁)接受一剂FluarixTM，10位受治疗者接受一剂鼻内流感疫苗。所述鼻内制剂(200μl)含有以下的灭活病毒体30μg血凝素A/Beijing/262/95(H1N1)、30μg血凝素A/Sydney/5/97(H3N2)、30μg血凝素B/Harbin/7/94与磷酸缓冲盐溶液(pH 7.4±0.1)、Tween 80(0.1％)、Triton X-100(0.015％)、脱氧胆酸钠(0.0045％)和硫柳汞(＜35μg/ml)。
对于诱发的局部和全身性症状有8天的随访期，这两种疫苗在安全性和反应原性方面都能被很好地耐受。没有报道与接种相关的严重不利事件。
通过评价血清血凝抑制(HI)效价以确定血清阳转率(定义为与第0天相比，第21天时就每种疫苗株而言血清HI效价至少提高3倍的疫苗的百分比)、转化系数定义为与第0天相比，第21天时就每种疫苗株而言血清HI几何平均效价(GMT)的增加倍数)和血清保护率(定义为接种后血清HI效价≥40(对于每种疫苗株)的疫苗的百分比，血清HI效价≥40被认可为指示保护作用)，检验所述疫苗的免疫原性。一般而言，流感疫苗对于每种病毒株而言，必须血清阳转率大于或等于40％，血清保护率大于或等于70％，而转化系数大于或等于2.5，以便满足国际规章的要求。这适用于18-60岁的成人；老年人适用不同的标准。
另外，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)评价粘膜IgA抗体的应答。
在表1中可以看到在给予一剂FluarixTM或所述鼻内制剂后21天的HI血清阳性率、血清阳转率和血清保护率。表1在给予1剂后21天时的HI血清阳性率、血清阳转率和血清保护率
血清阳性(n，％)效价≥10的受治疗者的数目和百分率血清保护(n，％)效价≥40的受治疗者的数目和百分率血清阳转(n，％)从第0天至第21天效价增加至少4倍的受治疗者的数目和百分率在所有情况下，转化系数(接种后血清HI GMT增加的倍数)大于2.5，这是成功的流感疫苗所要求的水平。
在表2中可以看到在第21天和第0天之间特异性粘膜IgA抗体/总粘膜IgA抗体之比增加1倍或3倍的受治疗者的百分率(一剂)。表2在第21天和第0天之间特异性IgA抗体/总IgA抗体之比增加1倍或3倍的受治疗者的百分率(一剂)。
总结以上列表显示的免疫原性结果表明，在一剂后21天时，所述鼻内制剂导致的血清阳性、血清阳转和血清保护的水平与由传统胃肠外疫苗(FluarixTM)所导致的类似。在一剂后，所述鼻内制剂引起的粘膜IgA应答比传统胃肠外疫苗(FluarixTM)所引起的要好。
权利要求
1.一种聚氧乙烯脱水山梨醇酯与辛苯昔醇的组合的用途，用于生产应用于患者粘膜表面的佐剂。
2.权利要求1的用途，其中所述聚氧乙烯脱水山梨醇酯是聚氧乙烯脱水山梨醇一油酸酯(TWEEN80TM)。
3.权利要求1或权利要求2的用途，其中所述辛苯昔醇是叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TRITON X-100TM)。
4.权利要求1-3中任一项的用途，还包括一种胆汁盐或胆酸衍生物。
5.权利要求1-4中任一项的佐剂的用途，所述佐剂与抗原一起用于生产供粘膜给药的疫苗。
6.权利要求5的用途，其中所述抗原选自人免疫缺陷病毒、水痘带状疱疹病毒、1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒、登革病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或戊型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、人乳头瘤病毒、流感病毒、Hib、脑膜炎病毒、沙门氏菌属(Salmonella)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、疏螺旋体属(Borrelia)、衣原体属(Chlamydia)、博德特氏菌属(Bordetella)、链球菌属(Streptococcus)、支原体属(Mycoplasma)、分枝杆菌属(Mycobacteria)、嗜血菌属(Haemophilus)、疟原虫属(Plasmodium)或弓形虫属(Toxoplasma)、stanworth十肽；或肿瘤相关抗原(TMA)、MAGE、BAGE、GAGE、MUC-1、Her-2 neu、LnRH、CEA、PSA、KSA或PRAME。
7.权利要求6的用途，其中所述抗原是来源于流感病毒的抗原或抗原性制剂。
8.权利要求7的用途，其中所述抗原性制剂是断裂流感病毒制剂。
9.权利要求7或权利要求8的用途，用于生产预防流感的疫苗。
10.权利要求5-9中任一项的用途，用于生产供医药用的疫苗。
11.一种生产疫苗的方法，所述方法包括将(a)一种聚氧乙烯脱水山梨醇酯、(b)一种辛苯昔醇和(c)一种抗原混合，并且提供供粘膜给药的一个疫苗剂量的疫苗。
12.权利要求11的方法，其中所述疫苗在鼻内气雾剂或喷雾剂装置中提供。
13.一种喷雾剂或气雾剂装置，更尤其是双剂量装置，所述装置装有包含一种聚氧乙烯脱水山梨醇酯、一种辛苯昔醇和一种抗原的疫苗。
14.权利要求13的喷雾剂或气雾剂装置，其中所述抗原是流感抗原或抗原性制剂。
15.权利要求14的喷雾剂或气雾剂装置，其中所述抗原性制剂是断裂流感病毒制剂。
16.一种治疗患有或易患病原体感染或癌症或变态反应的哺乳动物的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物的粘膜安全而有效量的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含一种聚氧乙烯脱水山梨醇酯、一种辛苯昔醇和一种抗原。
17.权利要求16的方法，其中所述疫苗经鼻内给予。
18.权利要求16或权利要求17的方法，其中所述疫苗是流感病毒疫苗，所述流感病毒疫苗包含一种流感抗原或抗原性制剂，例如一种断裂流感病毒制剂。
全文摘要
本发明涉及一种新型佐剂系统，所述佐剂系统包含与辛苯昔醇组合的聚氧乙烯脱水山梨醇酯表面活性剂，本发明也涉及包含所述佐剂系统连同抗原的疫苗。还提供生产所述佐剂和疫苗的方法以及所述佐剂和疫苗在疾病预防或治疗方面的应用。
文档编号A61K39/12GK1391483SQ00816014
公开日2003年1月15日 申请日期2000年9月22日 优先权日1999年9月24日
发明者M·弗里德, P·赫尔曼德, V·亨德里克斯 申请人:史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司